技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及转录因子DksA基因的新用途。
背景技术：
昆虫病原线虫是一种高效、安全的生物杀虫剂。昆虫病原斯氏属(Steinernema)和异小杆属(Heterorhabditis)线虫分别与致病杆菌属(Xenorhabdus)和发光杆状菌属(Photorhabdus)细菌共生(Forst and Clarke,2002)。该两属共生细菌属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，革兰氏阴性，是致死昆虫的毒力因子。这类线虫规模化培养技术成熟，被广泛应用于防治草坪、农林、花卉及牧草等害虫(Georgis et al.,2006；Kaya,2006)，在害虫综合治理方面发挥了显著作用(El-Borai et al.,2012)。
种间特异杀线虫专化性即共生细菌能够产生杀线虫毒素致死非特异性共生线虫的专化性(Han and Ehlers,2001)。这种种间杀虫作用使共生菌在自然环境下具有竞争优势，对线虫之间的营养竞争也有重要的作用。共生细菌P.luminescens LN2产生的信号物质能够诱导H.bacteriophora H06感染期线虫恢复，但LN2细菌能够分泌杀H06线虫的毒素，使非特异共生线虫不能利用LN2细菌进行生长和繁殖(Han and Ehler,1998)。将共生细菌上清过滤液无菌H06感染期线虫仍然具有毒性，且滤液经过80℃热处理后失去致死能力(Han and Ehlers,1999)。预测至少有7种公认的蛋白(包括DsbA，HlpA，RhlE，RplC，NamB)和2种推定蛋白涉及LN2细菌对H06的杀虫作用(Qiu et al.,2012)。
P.luminescens LN2特有的杀线虫毒性相关基因namA已被分离和鉴定。P.luminescens LN2的namA突变体能支持H06线虫的生长与繁殖，丧失了对非特异共生的H06线虫的致死作用(Qiu et al.,2009)。在大肠杆菌中表达该蛋白时，NamA重组蛋白对H06感染期线虫无直接的杀虫毒性(丘雪红,2009)，所以namA基因对线虫的种间特异性杀虫的毒性的分子作用机制仍有待研究。另外，namA基因是P.luminescens LN2所特有，这说明每个共生菌菌株对非特异共生线虫的杀线虫活性可能由不同的基因控制，共生菌种间特异的杀线虫机制仍有待深入研究。
DksA是和卷曲螺旋结构域一起结合到RNA聚合酶次级通道的的转录因子(Stebbins,1995；Perederina,2004)。最近的研究结果表明，DksA能够消除本身就存在的损伤以外的其它损伤(Tehranchi,2010)，能够减少DNA复制过程的损伤(Trautinger,2005)。DksA是转录起始因子，它和ppGpp一起来调节rRNA和许多其它对饥饿应激的基因的转录(Paul,2004)。另外，DksA也作用于转录起始复合物。在严谨条件下，大肠杆菌基因表达谱的改变是RNA 聚合酶(RNAP)，ppGpp和DksA相互作用的结果。ppGpp和DksA都能使转录起到相反的效应，rRNA和tRNA以及细胞增殖有关的基因的表达显著下调，同时耐受压力和饥饿的基因的表达上调(Kanjee,2012)。在存在DksA和提高ppGpp水平时，转录既能激活也能钝化，激活和抑制取决于启动子的内在特性。在严谨反应中，dksA基因的过量表达能够补偿信号素ppGpp的缺失。最近的研究还发现，在昆虫病原线虫-共生细菌体系中，P.luminescens LN2菌株的rpoB基因的缺失引起DksA蛋白下调，而且rpoB基因缺失突变也引起共生细菌丧失杀线活性，所以dksA基因可能与线虫的杀线作用有关(Qiu et al,2012)。因此研究dksA基因缺失对细菌与线虫共生关系的影响有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是提供转录因子DksA基因的新用途。
本发明通过实验发现，P.luminescens LN2中dksA基因突变的菌株具有以下性质：
1.突变菌株LN2△dksA在菌落形态、菌落粘性、荧光、色素分泌等特征与野生型菌株具有明显差异。
野生型菌株LN2-A在NBTA板上呈现黄绿色，而突变株LN2△dksA的菌落在NBTA平板上呈深绿色而且突变菌株的菌落明显比野生型大，说明dksA基因的缺失导致了菌落对色素的吸收。将培养了48h的野生型菌株LN2-A和突变株LN2△dksA菌液置于黑暗中观察，发现两者都产生了荧光。将培养3d的LB平板上的野生型菌株LN2-A和突变株LN2△dksA菌落，在黑暗上观察荧光时发现LN2-A有强荧光，突变株LN2△dksA的荧光很微弱，说明dksA基因的缺失导致菌株荧光蛋白的产生量减少。野生型菌株LN-A和突变菌株LN2△dksA的菌落均具有粘性，但野生型的粘性强于突变菌株。而且在LB平板上培养3d时野生型菌株的菌落颜色为深黄色，而突变菌株的颜色为微黄色。
2.LN2△dksA菌株对大蜡螟的注射毒力显著降低。
野生型的注射毒力明显高于突变菌株。当注射浓度为100CFU和1000CFU野生型菌株对大蜡螟的注射死亡率均显著高于突变菌株的注射毒力。互补菌株对dksA基因的缺失有一定的补偿作用。
3.dksA基因的敲除使P.luminescens LN2细菌失去对非特异共生线虫H.bacteriophora H06的毒性，且能支持H06线虫繁殖。
野生型菌株LN2-A与H06线虫共培养体系中，LN2菌株能够支持H06线虫恢复，但是因为LN2菌株对线虫的毒力作用，不能产生大母虫和二代小虫。野生型菌株的死亡率显著高于缺失突变菌株。突变菌株LN2△dksA与H06线虫共培养体系的线虫怀卵比率和怀小虫比率显著高于野生型菌株，说明缺失突变菌株已经丧失了部分杀虫活性，能够支持H06线虫产生二代小虫。野生型菌株H06-H06线虫共培养体系中，线虫的怀小虫比率分显著高于突变菌株的，说明突变菌株对虽然能够支持H06线虫的生长繁殖但是支持的效果没有H06菌株好，野生型菌株H06与H06线虫共培养体系的线虫发育速度明显比突变菌株LN2△dksA快。突变菌株的互补菌株在IJ、RJ3、F4、AE和AJ和突变菌株均没有明显差异，但是互补菌株的死亡率略高于突变菌株，说明互补菌株部分补偿了dksA基因的缺失。
结果表明：敲除dksA基因后，LN2菌对H06线虫的毒性减弱，且能产生二代小虫。这说明dksA基因对共生细菌LN2对共生线虫的种间杀虫能力具有重要的调控作用。
4.LN2△dksA菌株显著延迟H.indica LN2感染期线虫的恢复和雌雄同体母虫的怀卵。
生物测定实验结果表明：野生型菌株LN2和H.indica LN2线虫组合培养时，LN2线虫的生长发育明显比突变菌株LN2△dksA和H.indica LN2线虫组合培养时线虫的生长发育快。
5.LN2△dksA菌株不影响H.indica LN2线虫于海绵固体培养基中的产量。
野生型菌株LN2-A和突变菌株LN2△dksA和LN2线虫组合培养时，LN2线虫的产量没有显著差异。所以dksA基因对组合培养时线虫的产量没有影响。
因此，本发明提供P.luminescens LN2中的dksA基因在调控P.luminescens LN2菌落对色素吸收、P.luminescens LN2的荧光蛋白产生量、P.luminescens LN2菌落的粘性、P.luminescensLN2对大蜡螟的毒力、P.luminescens LN2对H.bacteriophora H06线虫毒力、P.luminescensLN2对H.indica LN2感染期线虫的恢复中的应用。
本发明的P.luminescens LN2中的dksA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第898-1353位碱基所示。
dksA突变对共生细菌LN2的生理生化特征(色素、荧光等)产生明显影响。突变菌株LN2△dksA明显延迟LN2感染期线虫的恢复和怀卵；丧失了对非特异共生线虫H.bacteriophora H06的毒性，且能支持H06线虫的生长繁殖；对大蜡螟的注射毒力显著降低；但未显著影响共生细菌的生长、LN2线虫的体外培养产量。由此可见，dksA基因在昆虫病原 线虫-共生细菌的共生关系方面具有重要功能。这些结果为研究这一共生体的共生性和病原性的分子机理提供参考。
本发明的P.luminescens LN2是现有技术中的细菌，公开于非专利文献：Qiu XH,Han RC,Yan X,Liu MX,Cao L,Yoshiga T,Kondo E.Identification and Characterization of a Novel GeneInvolved in the trans-Specific Nematicidal Activity of Photorhabdus luminescens LN2[J].ApplEnviron Microb,2009,75(12):4221-4223.2009.该菌株申请人也持有，保证自申请日起20年内向公众提供。
附图说明：
图1是融合PCR的技术图解，其中1.P1和P2扩增基因的上游序列；2.P5和P6扩增基因的下游序列；3.P3和P4扩增抗性标记基因cat；4.引物P2和P3、P4和P5分别在5’末端有20bp的碱基反向互补，因而在进行融合PCR第一步扩增时的无引物扩增可以将cat基因插入到基因的上下游同源臂间，形成融合片段。此时形成的融合片段较少，需要进行第二步PCR反应；
图2是dksA基因的上游序列和cat基因的PCR扩增，dksA基因的上游序列和cat基因的PCR扩增；
图3是融合PCR第二步，M.DL5000DNA Marker；1.dksA::Cm融合片段(2657bp)；
图4是dksA::Cm融合片段阳性转化子鉴定，M.DL2000DNA Marker；1-9.dksA::Cm(2858bp左右)基因转化子；10.为空白对照；
图5是pEASYTM-Blunt-dksA::Cm质粒的BamHI和speI双酶切图谱，M.DL5000DNA Marker；1和2pEASYTM-Blunt-dksA::Cm双酶切(BamH I和spe I)；
图6是自杀质粒的单酶切和双酶切图谱，M.λHindⅢDNA Marker；1.pKNG101质粒双酶切(BamH I和spe I；2、3.分别为BamHI单酶切和speI单酶切；4.pKNG101质粒；
图7是转化子质粒以及酶切鉴定图谱，M.λHindⅢDNA Marker；1.pKNG101-dksA::Cm双酶切(BamH I和spe I)；2.pKNG101-dksA::Cm质粒；
图8是PCR转化子鉴定，M.DL5000DNA Marker；1-16为dksA::Cm阳性转化子；17LN2-W野生型对照；
图9是菌株的生长曲线，注：四个菌株分别为野生型菌株LN2-A、dksA缺失突变菌株LN2△dksA、携带空的pLAFR3质粒互补对照菌株LN2△dksA/PLA以及携带目的基因dksA的pLAFR3质粒的互补菌株LN2△dksA/PLA-dksA。该实验设置2个重复，图中数值为各个时间点共生菌的OD600的平均值；
图10是共生细菌对H06感染期线虫生物测定，注：IJ表示感染期幼虫，RJ3(recovered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示怀卵成虫、AJ(adultwith juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼虫的成虫、DN(dead nematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫(RJ3+J4+AE+AJ)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著(p﹤0.05％)；
图11是共生细菌上清液诱导H.indica LN2感染期线虫恢复的生物测定，注：IJ表示感染期幼虫、DN(dead nematodes)表示死亡的线虫、R(total recovery)表示恢复的线虫。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著(p﹤0.05％)；
图12是突变菌株LN2△dksA、LN2△dksA/pLA和LN2△dksA/pLA-dksA及野生型LN2-A与H.indica LN2线虫共培养第一天时对LN2线虫恢复的影响，注：IJ表示感染期幼虫，RJ3(recovered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示怀卵成虫、AJ(adult with juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼虫的成虫、DN(deadnematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫(RJ3+J4+AE+AJ)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著(p﹤0.05％)；
图13是突变菌株LN2△dksA、LN2△dksA/pLA和LN2△dksA/pLA-dksA及野生型LN2-A与H.indica LN2线虫共培养第二天时对LN2线虫恢复的影响，注：IJ表示感染期幼虫，RJ3(recovered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示怀卵成虫、AJ(adult with juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼虫的成虫、DN(deadnematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫(RJ3+J4+AE+AJ)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著(p﹤0.05％)；
图14是突变菌株LN2△dksA、LN2△dksA/pLA和LN2△dksA/pLA-dksA及野生型LN2-A与H.indica LN2线虫共培养第三天时对LN2线虫恢复的影响，注：IJ表示感染期幼虫，RJ3(recovered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示怀卵成虫、AJ(adult with juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼虫的成虫、DN(deadnematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫(RJ3+J4+AE+AJ)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著(p﹤0.05％)；
图15是突变菌株LN2△dksA、LN2△dksA/pLA和LN2△dksA/pLA-dksA及野生型LN2-A与H.indica LN2线虫共培养第四天时对LN2线虫恢复的影响，注：IJ表示感染期幼虫，RJ3(recovered J3)表示恢复的3龄期幼虫、J4表示4龄期幼虫、AE(adult with eggs)表示怀卵成虫、AJ(adult with juveniles)表示体内的卵已孵化成下一代幼虫的成虫、DN(dead nematodes)表示死亡的线虫、TR(total recovery)表示恢复的线虫(RJ3+J4+AE+AJ)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著(p﹤0.05％)；
图16是突变株LN2-dksA及野生型LN2-A与H.indica LN2固体培养感染期线虫产量，注：图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著(p﹤0.05％)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
P.luminescens LN2细菌基因组的提取：按照常规方法提取P.luminescens LN2细菌基因组DNA。
2.5.5.1、重组克隆载体pEASYTM-Blunt-dksA::Cm的构建
根据P.luminescens LN2的基因组测序结果中，获得dksA基因片段及其上下游基因的碱基序列，由此设计特异性引物，以LN2基因组为模板扩增dksA基因上下游序列及标记基因cat。再通过融合PCR获得同源重组的融合片段dksA::Cm，该实验所设计的引物序列如表1所示，重叠PCR的原理如图1所示。
dskA基因序列及其上下游序列如SEQ ID NO.1所示，其中第1-897位碱基为dskA基因的上游序列，第898-1353位碱基为dskA基因序列，第1354-2241位碱基序列为dskA基因的下游序列。
表1：片段扩增所需要的引物
以上引物委托华大基因生物技术有限公司合成。引物合成后，每OD引物稀释为浓度10 μmol/L时需要加入(nmoles/OD*100)μL dd H2O吸打混匀后-20℃保存备用。
2.5.5.2上下游序列和抗性基因的独立扩增
先用Taq酶进行条件优化，条件优化好后，以LN2基因组为模板，fastPfu高保真酶为DNA聚合酶(保证扩增序列与源序列100％相似)，扩增dksA基因的上、下游序列。同时扩增抗性基因cat序列，该序列扩增的模板为pZS21。PCR反应体系：10x PCR buffer5μL、dNTPs(2.5mM)5μL、上游引物(10μM)2μL，下游引物(10μM)2μL、fastPfu(5μ/μL)1μL、DNA Template1μL，再加水至50μL。扩增dksA基因的上游序列的引物为：dskA-up-B-F和dskA-up-Cat-R，反应条件为：95℃5min,(95℃20sec,60℃20sec,72℃30sec)32cycles,72℃10min，扩增得到的产物命名为P1-P2片段；扩增dksA基因的下游序列的引物为：dskA-down-Cat-F和dskA-down-S-R，95℃5min,(95℃20sec,60℃20sec,72℃30sec)32cycles,72℃10min，扩增得到的产物命名为P5-P6片段；扩增cat基因的引物为：cat-F和cat-R，95℃5min,(95℃20sec,60℃20sec,72℃30sec)32cycles,72℃10min，扩增得到的产物命名为Cm片段。
PCR扩增产物用0.8％的胶琼脂糖电泳检测后，进行割胶并利用胶回收试剂盒回收与纯化目的片段，纯化后的产物用作后续PCR反应。
扩增dksA基因的上下游同源臂，在引物设计的时候，在P1和P6的5’端分别添了BamHI和SpeI限制性酶切位点及其保护碱基，在P2和P5的5’端分别添加了与cat标记基因反向互补的20bp的片段。以质粒pZS21为模板扩增含自身启动子的cat抗性标记基因849bp。
由于目的基因引物设计时上游引物添加有限制性酶切位点和保护碱基，下游引物增加的20bp的互补重叠序列，所以扩增的片段长度应该加上这些碱基。dksA基因的上游片段为897bp，下游片段为895bp，利用设计的引物扩增时上下游片段分别为925bp和923bp。
如图2所示，1、2为dksA基因上游序列的扩增产物(P1-P2片段)，3为dksA基因下游序列的扩增产物(P5-P6片段)大小都在1000bp左右，符合预期。4-5为cat基因的PCR扩增产物(Cm片段)片段大小在800bp左右，大小符合预期。可以进行后续的回收和纯化各个基因的上下游片段和cat基因片段。
2.5.5.3融合PCR第一步
在50μLPCR体系中分别加入等摩尔的待融合片段，进行各片段的无引物互补延伸，形成融合的PCR产物(中间产物)，PCR反应体系：10x PCR buffer5μL、dNTPs(2.5mM)5μL、P1-P2片段5μL、Cm片段5μL、P5-P6片段5μL、fastPfu(5μ/μL)1μL，加水至50μL。按以下程序进行PCR扩增：95℃5min，(95℃15sec，55℃20sec，72℃8min)， 15个循环。扩增获得的PCR产物作为融合PCR第二步扩增的模板。
2.5.5.3融合PCR第二步
第一步得到的PCR产物为模板，dksA基因的上游的上游引物(dskA-up-B-F)，基因下游序列的下游引物(dskA-down-S-R)进行片段全序列扩增。反应条件如下：10x PCR buffer5μL、dNTPs(2.5mM)5μL、P15μL、P65μL、中间产物5μL、fastPfu(5μ/μL)1μL，加水至50μL。进行PCR扩增，扩增程序如下，95℃5min；94℃20sec，55℃20sec，72℃4min，32个循环；72℃延伸10min。扩增的片段用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测后，利用DNA回收和纯化试剂盒进行回收与纯化获得融合片段dksA::Cm，PCR产物于-20℃保存备用。
向融合PCR第一步的反应体系中分别加入等摩尔的dksA基因的上、下游序列片段(P1-P2和P5-P6片段)和cat基因片段(Cm片段)，由于上游基因的下游和下游基因的上游分别有20bp的碱基和cat基因反向互补，所以能够互为引物进行无引物互补延伸，扩增融合基因的全片段。以第一步融合PCR的产物为模板，分别用上述引物P1和P6，进行融合片段全长扩增(即第二步融合PCR)。如图3所示，1表示dksA基因的融合产物，大小在2500bp左右，与预期dksA::Cm的2657bp大小相符。由此得到dksA::Cm，可用于后续与载体的连接，构建得到重组质粒pEASYTM-Blunt-dksA::Cm。
2.5.5.4构建中间重组载体pEASYTM-Blunt-dksA::Cm
采用pEASYTM-Blunt Vector，向PCR薄壁管中分别加入以下体系：dksA::Cm in TE Buffer4μL、pEASYTM-Blunt Vector1μL，混匀并快速离心2-3sec，使反应体系聚集到管底，室温下反应15min，取出连接产物(重组载体pEASYTM-Blunt-dksA::Cm)用于随后转化感受态细胞Trans1-T1。
2.5.5.5中间重组载体转化Trans1-T1感受态细胞
快速取出1管保存在-80℃的感受态细胞Trans1-T1，并迅速插到碎冰上放置30min，中间轻轻旋转几次；待感受态细胞刚刚融化时，缓慢加入5μL待转化的连接产物(重组载体pEASYTM-Blunt-dksA::Cm)于感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min；42℃热激45sec，不要摇动离心管；热激后立即将离心管置于冰上，冰浴2min。加入250μL平衡到室温的无菌SOC培养基，37℃，200rpm振荡1h；3000rpm离心3min后去除200μL上清液，余下的吸打混匀后全部涂布到Kana(50μg/μL)的抗性选择性LB平板上，37℃倒置培养过夜，长出转化子。
2.5.5.6转化子的PCR鉴定
从转化板上随机挑几个转化子菌落，接种到500μL Amp(100μg/μL)抗性LB液体培养 基中，37℃，200rpm培养过夜后进行菌液PCR鉴定。PCR反应体系如下：10x PCR buffer2.5μL、dNTPs(2.5mM)2μL、M13-F(5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′)(10μM)1μL、M13-R(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)(10μM)1μL、Easy Taq(5μ/μL)0.5μL、转化子菌落溶液1μL，加水至50μL。PCR扩增程序如下：95℃5min；95℃30sec，55℃20sec，72℃延伸3min30sec，32个循环；72℃继续延伸10min。扩增片段用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示，1-9为pEASYTM-Blunt-dksA::Cm转化的克隆子扩增PCR片段，大小在2800bp左右，与融合片段2657bp加上载体的约200bp片段的2857bp理论值相符，酶切鉴定结果如图5所示，用BamHI和SpeI这两种限制性内切酶分别对重组子pEASYTM-Blunt-dksA::Cm的质粒进行双酶切鉴定，质粒的酶切片段较大的大小为线性克隆载体pEASYTM-Blunt，大小为3929bp，酶切图谱符合预期；且1和2的片段大小在2800bp左右，与原来的dksA::Cm的2657bp的片段大小符合。因此确定融合片段dksA::Cm已克隆到pEASYTM-Blunt载体上。
选取2个鉴定为阳性克隆的菌液200mL，送广州华大基因进行序列测定，由于序列为3000bp左右。序列测序与源序列达到100％相似度时方可进行后续实验，以保证细菌的功能和形态等的改变是由于基因的缺失造成的。构建的重组质粒命名为pEASYTM-Blunt-dksA::Cm。
2.5.6重组自杀质粒pKNG101-dksA::Cm的构建及鉴定
2.5.6.1质粒提取
提取质粒pEASYTM-Blunt-dksA::Cm及自杀质粒pKNG101，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，质粒保存在-20℃备用。
2.5.6.2质粒酶切
以BamHI和SpeI两种限制性内切酶分别建立如下自杀质粒pKNG101和重组质粒pEASYTM-Blunt-dksA::Cm的双酶切反应体系：
重组质粒pEASYTM-Blunt-dksA::Cm双酶切反应体系1：dd H2O19μL、10×K buffer7μL、SpeI(TaKaRa)2μL、BamHI(TaKaRa)2μL、pEASYTM-Blunt-dksA::Cm40μL。
自杀质粒双酶切反应体系4：10×K buffer6μL、SpeI(TaKaRa)2μL、BamHI(TaKaRa)。2μL、pKNG10146μL。
将反应物混合均匀，并短暂离心2-3sec，使反应物聚集到管底，37℃水浴2h后检测酶切效率。以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，如图6所示，用同样的酶双酶切自杀质粒pKNG101并回收纯化具有相同粘性末端的线性质粒pKNG101。发现完全酶切后回收与纯化pKNG101载体片段和各融合片段，-20℃保存备用。
2.5.6.3线性质粒pKNG101和融合片段的连接
连接体系的建立及连接
将2.5.6.2酶切后的具有相同粘性末端的融合片段pEASYTM-Blunt-dksA::Cm与线性自杀质粒pKNG101载体以3：1的比例建立连接体系。连接反应体系1：dd H2O1μL、10×T4ligaseBuffer1μL、dksA::Cm(上述酶切片段)3.5μL、pKNG101(上述酶切片段)4μL、T4ligase(Takara)0.5μL，将反应物混合均匀，并短暂离心2-3sec，使反应物聚集到管底，16℃连接过夜，连接产物(pKNG101-dksA::Cm)用于转化大肠杆菌S17-1感受态细胞。
2.5.6.4连接产物转化大肠杆菌S17-1感受态细胞
同2.5.5.5方法转化大肠杆菌S17-1感受态细胞，转化得到的阳性克隆命名为重组子S17-1/pKNG101-dksA::Cm。
2.5.6.5重组子S17-1/pKNG101-dksA::Cm的鉴定
(1)菌液PCR鉴定
随机挑几个2.5.6.4的大肠杆菌S17-1转化子菌落，接种到10mL Tc(50μg/μL)LB抗性液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜后进行菌液PCR鉴定。PCR反应体系如下：10x PCR buffer2.5μL、dNTPs(2.5mM)2μL、P1(10μM)1μL、P6(10μM)1μL、Easy Taq(5μ/μL)0.5μL，转化子菌落溶液1μL，加水至50μL。PCR扩增程序如下：95℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃延伸4min，32个循环；72℃继续延伸10min。扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。能扩增得到产物的适合大小的为阳性克隆重组子S17-1/pKNG101-dksA::Cm。
(2)酶切鉴定
分别提取3种鉴定为阳性克隆，提取质粒，建立双酶切体系。
重组质粒S17-1/pKNG101-dksA::Cm双酶切反应体系1：dd H2O2μL、10×K buffer2μL、SpeI(TaKaRa)0.5μL、BamHI(TaKaRa)0.5μL、pKNG101-dksA::Cm15μL。
酶切鉴定图如图7所示，1和2为自杀重组质粒pKNG101-dksA::Cm，其中1为双酶切的产物，2为没有酶切的质粒。质粒pKNG101的片段大小为6986bp双酶切后去掉了中间的367bp片段所以双酶切后的线性片段大小为6619bp，1较大的条带大小位于6500bp左右，与酶切后的pKNG101片段大小吻合；1较小的条带在2900bp左右与融合片段的大小一致。所以可以的得出已成功构建出自杀重组质粒，命名为pKNG101-dksA::Cm，阳性克隆命名为：S17-1/pKNG101-dksA::Cm。
2.5.7互补质粒pLAFR3-dksA的构建
2.5.7.1基因片段的扩增和纯化
利用表1中的引物，以LN2基因组为模板，fastPfu高保真酶为DNA聚合酶，扩增目的基因dksA基因。PCR反应体系1：10x PCR buffer5μL、dNTPs(2.5mM)5μL、dksA-PstⅠ-F(10μM)2μL、dksA-PstⅠ-R(10μM)2μL、fastPfu(5μ/μL)1μL、LN2的基因组DNA1μL，加水至50μL。PCR扩增程序如下：95℃5min，2.94℃30sec，3.55℃30sec，4.72℃45sec，反应2→3→4→2运行32个循环后，72℃延伸10min。扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。扩增得到的目的片段用回收试剂盒回收与纯化后，用于下一步实验。
2.5.7.2连接体系的建立与转化
由于是用高保真酶fastPfu扩增，所以回收得到的dksA基因片段为两端添加了PstI的平末端载体，所以目的片段只能和平末端载体连接。本次选择pEASYTM-Blunt-Simple载体来构建中间重组载体。向PCR薄壁管中分别加入以下体系：dksA in TE Buffer4μL和pEASY-Blunt–Simple Vector1μL。混匀并快速离心2-3sec，使反应体系聚集到管底，室温下反应15min，取出连接产物用于随后转化感受态细胞Trans1-T1。
按照2.6.6的方法转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，随机挑取单菌落到500μL Am LB抗性液体培养基中，25℃，200rpm培养5h，做菌液PCR鉴定。PCR反应体系如下：10x PCRbuffer2.5μL、dNTPs(2.5mM)2μL、M13-F(5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′)(10μM)1μL、M13-R(5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′)(10μM)1μL、Easy Taq(5μ/μL)0.5μL、转化子菌落溶液1μL，加水至25μL。dksA基因的PCR扩增程序：95℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃延伸4min，32个循环；72℃10min。扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
取鉴定为阳性的菌液送华大基因进行测序，测序结果与源序列达到100％相似度后进行后续实验。该中间重组质粒命名为pEASY-Blunt–Simple-dksA。
2.5.7.3质粒酶切获得具有PstI粘性末端的目的基因产物
挑取测序正确的阳性克隆到5mL Am抗性LB液体培养基中，25℃，200rpm培养过夜。利用质粒提取试剂盒提取中间重组质粒pEASY-Blunt–Simple-dksA和互补质粒pLAFR3。分别建立互补质粒pLAFR3和重组质粒pEASY-Blunt-Simple-dksA的PstⅠ酶切反应体系：
重组质粒pEASY-Blunt-Simple-dksA的PstI酶切反应体系1：dd H2O11μL、10×H buffer7μL、PstI(TaKaRa)2μL、pEASYTM-Blunt-Simple-dksA40μL。
互补质粒pLAFR3的PstI酶切反应体系2：：dd H2O21μL、10×H buffer6μL、PstI (TaKaRa)3μL、pLAFR350μL。
将反应物混合均匀，并短暂离心2-3sec，使反应物聚集到管底，37℃水浴3h后检测酶切效率。以0.7％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，发现完全酶切后回收与纯化dksA基因片段和pLAFR3载体片段，-20℃保存备用。
2.5.7.4连接互补质粒和基因并转化感受态细胞DH5α获得互补质粒pLAFR3-dksA
将具有相同粘性末端的融合片段与互补质粒pLAFR3以3:1的比例建立连接体系。连接体系：dd H2O0.5μL、10×T4ligase Buffer1μL、dksA(上述重组质粒pEASY-Blunt-Simple-dksA酶切片段)(Pst I)4μL、pLAFR3(上述互补质粒pLAFR3酶切片段)(Pst I)4μL。将反应物混合均匀，并短暂离心2-3sec，使反应物聚集到管底，16℃连接过夜，连接产物(pLAFR3-dksA)用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。
按照2.6.6的方法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，随机挑取数个单菌落于500μL Tc抗性LB液体培养基中，25℃，200rpm培养5h，进行菌液PCR鉴定。PCR反应体系如下：10x PCR buffer2.5μL、dNTPs(2.5mM)2μL、pLAFR3-for(10μM)1μL、pLAFR3-rev(10μM)1μL、Easy Taq(5μ/μL)0.5μL，转化子菌落溶液1μL，加水至25μL。转化子的PCR扩增程序如下：95℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃延伸4min，32个循环；72℃10min。扩增产物用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。保存鉴定为阳性的菌株命名为DH5α/pLAFR3-dksA。
2.5.8双亲接合构建缺失突变菌株
2.5.8.1双亲接合实验
1.受体菌的培养：取出-80℃低温保存的共生细菌P.luminescens LN2于相应的Am(100μg/mL)LB平板划线培养，25℃培养2d后获得单菌落，挑取单菌落于30mL Am(100μg/mL)LB液体培养基中，25℃，200rpm下培养至OD600约为2.0。无菌条件下，6000rpm离心5min后收集菌体，并用10mM MgSO4清洗2次，最后用10mM MgSO4重悬至OD600约为1.0。
2.供体菌的培养：分别取出-80℃低温保存的带有重组质粒的大肠杆菌S17-1(S17-1/pKNG101-dksA::Cm)于抗性LB平板(Cm,50μg/mL)划线培养，37℃培养24h后挑取单菌落于30mL相应的抗性Cm(50μg/mL)LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，以1：50的转接到新鲜Cm(50μg/mL)抗性LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600约为1.0。无菌条件下，6000rpm离心5min后收集菌体，并用10mM MgSO4清洗2次，最后用10mM MgSO4重悬至OD600约为1.0。
3.双亲接合实验
无菌条件下，供体菌与受体菌以3:1的比例混合后转至硝酸纤维膜上，待吸收后，将膜菌体朝上置于LB平板上，25℃培养72h。取出硝酸纤维膜，在无菌操作条件下将膜上的菌体洗出，并稀释成不同浓度涂布于含有Am和Cm双抗的LB平板上，25℃培养72h后，挑取单菌落进行后续筛选。如果在Am和Cm双抗的LB平板上生长，则表示自杀重组质粒已经转化的共生细菌中。
4.同源互换子的筛选
挑取在Am和Cm双抗平板生长的单菌落，接种于10mL Am和Cm双抗LB液体培养基培养24h后再连续转接2次，促使质粒整合到基因组上。然后稀释成不同的浓度涂布于Am(100μg/mL)、Cm(50μg/mL)及5％蔗糖LB平板上，25℃培养72h。挑取多个抗性平板上生长的单菌落，平行转接到Sm(100μg/mL)的LB抗性平板上，若在含Am、Cm和蔗糖的LB平板上能生长，而不能在含Sm抗性LB平板生长的菌株有可能就是缺失突变菌株。不能在Sm抗性LB平板生长，证明自杀重组质粒已经发生了同源互换，且同源互换后，从基因组中同源互换掉的自杀质粒大片段被降解了。所以确定发生了同源互换，且抗性基因替换掉了原来的基因片段。
还可以通过PCR鉴定进一步鉴定缺失替换突变菌株。
2..5.8.2缺失突变菌株的鉴定
原有基因dksA的片段长度为456bp，抗性标记基因cat(849bp)所替代。dksA基因和抗性基因的片段长度差别较大所以可以直接进行PCR鉴定。
挑取dksA缺失突变菌株，于1mL含Cm抗性的LB液体培养基，25℃，200rpm培养24h后以菌液为模板，进行菌液PCR鉴定。P1，P6为引物。在0.7％的琼脂糖凝胶进行PCR产物的检测。LN2-A作为对照。
用引物P1和P6进行扩增，若dksA扩增的片段比野生型的长400bp左右，则该菌为dksA缺失突变菌株，命名为缺失突变菌株LN2△dksA。
挑取在Am和Cm双抗LB平板上生长且不能在Sm抗性LB平板上生长菌落，此时由于能够在Am和Cm双抗平板生长说明自杀质粒pKNG101-dksA::Cm已经转化到带有Am抗性的野生型菌株LN2-A，自杀质粒不能在LN2-A菌株中自主复制所以质粒进入到菌株中会整合到LN2-A基因组中，由于不能在Sm抗性LB平板上生长，说明质粒大片段已经从染色体组中脱落，得到已经发生同源互换的突变菌株。挑取菌落16个菌落于LB液体培养基(Am和 Cm)培养过夜，取1μL菌液作为模板，以dksA的上游同源臂的上游引物(P1)和下游同源臂的下游引物(P6)进行PCR鉴定，以0.8％琼脂糖凝胶检测PCR产物。野生型菌株LN2-A的作为阴性对照。
用上下同源臂引物P1和P6进行扩增，若dksA扩增的片段比野生型的长400bp左右，则该菌为dksA突变菌。如图8所示，4、9、11、16都有阳性条带，且比野生型的大400bp左右，所以确定得到了dksA缺失突变菌株，其命名为缺失突变菌株LN2△dksA。
2.5.9三亲结合构建缺失互补菌株
1.受体菌的培养
取出-80℃低温保存的缺失突变菌株LN2△dksA于相应的Am和Cm双抗LB平板划线培养，25℃培养3d后获得单菌落。挑取单菌落于30mL Am和Cm双抗LB液体培养基中，25℃，200rpm下培养至OD600约为2.0，6000rpm离心5min后收集菌体，并用10mM MgSO4清洗2次，最后用10mM MgSO4重悬至OD600约为1.0。
2.供体菌和辅助菌的培养
取出-80℃低温保存的带有互补质粒的大肠杆菌DH5α/pLAFR3-dksA和携带有空互补质粒的大肠杆菌DH5α/pLAFR3(与大肠杆菌DH5α/pLAFR3-dksA的区别只是在于其载体pLAFR3中没有插入dksA基因)分别于Am(100μg/mL)和Cm(50μg/mL)双抗LB平板划线培养，37℃培养24h后挑取单菌落于30mL Am和Cm双抗LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，以1:50的转接到新鲜Am和Cm双抗LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600约为1.0。无菌条件下，6000rpm离心5min后收集菌体，并用10mM MgSO4清洗2次，最后用10mM MgSO4重悬至OD600约为1.0，得到供体菌。
取出-80℃低温保存的带有辅助质粒的大肠杆菌DH5α/pRK2013于Kana(50μg/mL)抗性LB平板划线培养，37℃培养24h后挑取单菌落于30mL Kana(50μg/mL)抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，以1：50的转接到新鲜Kana(50μg/mL)抗性LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600约为1.0。无菌条件下，6000rpm离心5min后收集菌体，并用10mM MgSO4清洗2次，最后用10mM MgSO4重悬至OD600约为1.0，得到辅助菌。
3.三亲接合实验
本文共有2种三亲结合实验组合，分别是1.缺失突变菌株LN2△dksA，互补菌株DH5α/pLAFR3-dksA以及辅助菌株DH5α/pRK2013；2.LN2△dksA，空质粒对照DH5α/pLAFR3 以及辅助菌株DH5α/pRK2013。供体菌、受体菌和辅助菌以1:1:1的比例混合后转至硝酸纤维膜上，待吸收后，将膜菌体朝上置于无抗性LB平板上，25℃培养72h。取出硝酸纤维膜，在无菌操作条件下将膜上的菌体洗出，并稀释成不同浓度涂布于含有Am、Cm和Tc三抗LB平板上，25℃培养72h后，挑取单菌落进行后续筛选。如果在Am、Cm和Tc三抗LB平板上生长，则表示互补质粒已经转化的共生细菌(缺失突变菌株LN2△dksA)中。由此得到互补质粒的pLAFR3-dksA的缺失突变菌株LN2△dksA(命名为：缺失互补突变菌株LN2△dksA/pLAFR3-dksA)和空质粒的pLAFR3的缺失突变菌株LN2△dksA(命名为：对照菌株LN2△dksA/pLAFR3)。
3.3缺失突变菌株LN2△dksA的生理生化研究
3.3.1菌落对色素的吸收
挑取LB固体培养基上的新鲜缺失突变菌株LN2△dksA单菌落，涂布在NBTA和MacConkey平板上。25℃培养箱中培养72h，观察菌落的形态及其颜色。野生型菌株LN2-A(P.luminescens LN2，下同)在NBTA板上呈现黄绿色，而突变株LN2△dksA的菌落在NBTA平板上呈深绿色。两者在MacConkey平板上都呈红色。这说明dksA基因的敲除对共生菌LN2的色素吸收有一定的影响，dksA基因参与调控共生菌LN2对色素的吸收。
3.3.2菌落粘性测定
一方面通过菌落的粘性判断，用接种环粘取于LB平板上生长了2d的菌落，以菌落能否拉丝来判断菌落是否具有粘性；另一方面还通过注射大蜡螟看死亡2d的大蜡螟内容物判断菌株粘性。结果显示，野生型菌株LN-A和突变菌株LN2△dksA的菌落均具有粘性，但野生型的粘性强于突变菌株。
3.3.3菌落过氧化氢酶活性测定
在培养皿中滴加5mL3％的H2O2，分别用接种针挑取LB固体培养基上生长的野生菌LN2-A和突变菌LN2△dksA新鲜单菌落放入H2O2中，观察是否有气泡产生以及气泡出现的强烈程度。实验发现，将野生型菌株LN2-A和突变株LN2△dksA的菌落置于3％的过氧化氢H2O2液体中时，液体中都出现强烈气泡，说明两者的过氧化氢酶活性均为阳性。说明dksA基因的敲除没有影响共生菌LN2的过氧化氢酶活性，dksA基因不参与调控该菌的过氧化氢酶活性。
3.3.4初生型与次生型菌落的鉴定
共生细菌Photorhabdus spp.具有两型现象，初生型和次生型。初生型和次生型在颜色吸收和菌落形态都有明显差异。初生型菌落在NBTA平板上呈绿色或蓝绿色，在MA平板上呈 红色，次生型菌落在NBTA板上呈现红色或栗色。初生型菌落具有不规则的边缘且菌落凸起为圆形，且大小长短不一，菌株能够支持线虫生长繁殖；次生型菌落平坦，直径较初生型大。初生型菌落还能产生荧光。
将培养了48h的野生型菌株LN2-A和突变株LN2△dksA菌液置于黑暗中观察，发现两者都产生了荧光。将培养3d的LB平板上的野生型菌株LN2-A和突变株LN2△dksA菌落，在黑暗上观察荧光时发现LN2-A有强荧光，突变株LN2△dksA的荧光很微弱。推测dksA基因可能影响到共生菌LN2的荧光蛋白的表达。
3.3.5菌株在不同酸碱度时的颜色测定
分别挑取野生菌LN2-A、突变菌LN2△dksA、缺失互补突变菌株LN2△dksA/pLAFR3-dksA和对照菌株LN2△dksA/pLAFR3四种菌株在LBD相应抗性培养板上活化好的单菌落转接到LB液体培养基中，25℃，200rpm培养36h后，将菌液分为等量的3份，1份用1mol/L NaOH调整PH到9.0，1份用1mol/L HCl调整PH到6.0，另一份作为对照，观察菌液的颜色变化。
将新鲜的单菌落转接到LB液体培养基中，25℃，200rpm培养15h后，将菌液分为等量的3份，1份用1mol/L NaOH调整PH到9.0，1份用1mol/L的HCl调整PH到6.0，另1份作为对照，混匀后观察菌液的颜色变化。
向野生型LN2-A菌液中加入1mol/L的NaOH使菌液PH为9.0时，混匀后菌液颜色从淡黄色略微加深，而加入1mol/L的HCl调整PH为6.0时，混匀后菌液的黄色基本没有变化。突变株LN2△dksA的菌液本身就为淡颜色而且比野生型LN2-A菌液的颜色淡，调整PH为6.0和9.0时颜色基本没有变化。
3.4突变菌生长曲线的测定
取出-70℃保存的甘油菌将野生菌LN2-A、突变菌LN2△dksA、缺失互补突变菌株LN2△dksA/pLAFR3-dksA和对照菌株LN2△dksA/pLAFR3在相应抗性LBD平板划线培养，25℃培养3d后挑取直径3mm左右的单菌落接种到5mL的LBD液体培养基中，25℃，200rpm培养过夜。按1:100的接种量转接至无抗性的LBD液体培养基中，每3h取一次样，每次取出2mL菌液，48h后每4h取一次样直到72h，每个菌株每次取两个样，测定菌液OD600值。共生菌的OD600的平均值绘制突变菌和野生菌的生长曲线。
从-80℃甘油储存菌出发，将野生菌LN2-A、突变菌LN2△dksA、缺失互补突变菌株LN2△dksA/pLAFR3-dksA和对照菌株LN2△dksA/pLAFR3。在相应抗性LBD平板划线培养，28℃培养2d后挑取直径3mm左右的单菌落接种至5mL的LBD液体培养基中，25℃，200 r/min过夜培养，按1％接种量转接至无抗性的LBD液体培养基中，每3h取样测定该时间点的菌体OD600值，培养36h后共生菌生长非常缓慢，每4h取样一次，每次取两个样。统计数据，取各个时间点共生菌的OD600的平均值绘制突变菌和野生菌的生长曲线。
在25℃，200rpm的培养条件下，测定共生菌在LBD的液体培养基中的生长状况，记录每3h菌液的OD600值，由此作出共生菌的生长曲线，结果如图9，由此说明dksA基因的敲除没有影响共生菌LN2的生长。
3.5突变菌对昆虫大蜡螟的注射毒力测定
3.5.1菌株的培养
分别在相应抗性LBD平板划线培养野生菌LN2-A、突变菌LN2△dksA、缺失互补突变菌株LN2△dksA/pLAFR3-dksA和对照菌株LN2△dksA/pLAFR3，25℃培养3d后，分别挑取新鲜菌落，接种于5mL的LBD液体培养基中，25℃，200rpm振荡培养过夜。以1:100的接种量将菌液接种于新鲜的不带抗性的LBD液体培养，25℃，200rpm振荡培养至OD600约为2.0。于6000rpm，离心10min收集菌体，并以无菌PBS清洗菌体3次，最后将菌体重悬于PBS中至细菌浓度分别为10、100CFU/μL，用于注射大蜡螟。其中，PBS作为空白对照。
3.5.2注射大蜡螟幼虫
取重量为0.30～0.36g的大蜡螟老熟幼虫，用50μL微量注射器将10μL的各种浓度的菌液从大蜡螟幼虫的第一对腹足注入体内，每处理3个重复，每重复10头幼虫。大蜡螟幼虫注射菌液后的先放置在滤纸上数分钟，观察有无液体溢出并且活动正常，便可用于后续实验。注射后的昆虫放置于25℃培养，24h后，每6h检查昆虫的死亡率。死亡标准以针刺昆虫不动，昆虫尸体是否发荧光来判断是否为共生细菌致死。处理组为野生菌LN2-A、突变菌LN2△dksA、缺失互补突变菌株LN2△dksA/pLAFR3-dksA和对照菌株LN2△dksA/pLAFR3，
对照组为无菌PBS。
注射后的昆虫放置于25℃培养，24h后，每6h检查昆虫的死亡率，以针刺激昆虫不动为死亡，死亡的昆虫如能变红并发荧光，则可认为是由共生细菌致死。结果如表2所示。
表2野生型菌株LN2-A与突变株对大蜡螟的注射毒性测定
注：表中数字表示方式为“平均值±标准差”，每处理3个重复，每重复10头大蜡螟幼虫，每头幼虫注射10μL不同浓度的菌液(100CFU、1000CFU)。图中相同字母表示方差分析差异不显著，不同字母表示差异显著(p﹤0.05％)
如表2所示，野生型的注射毒力明显高于突变菌株。当注射浓度为100CFU时：注射30h和36h时，注射野生型菌株的死亡率分别达到49％和96％，显著高于突变菌株的死亡率0％和7％，注射36h时互补菌株的死亡率为53％虽然显著低于野生型菌株96％但是也显著高于突变菌株7％，说明互补菌株对dksA基因的缺失有一定的补偿作用。当注射浓度为1000CFU时：注射野生型菌株30h时大蜡螟已经100％死亡，均显著高于注射突变菌株30h、36h时大蜡螟的死亡率13％和63％。注射42h时不管是注射野生型菌株还是突变菌株都到达100％死亡率。说明dksA基因的突变对共生细菌LN2的毒素产生具有重要的正调控作用。
3.6dksA突变菌对H06杀线虫测定
3.6.1测定平板的制备
制备LBD培养基，加入1.8％琼脂粉，121℃灭菌25min，待培养基冷却至55℃后加入相应的抗生素，与无菌条件下制定测定平板。取24孔细胞培养板，每孔加入含有相应抗性的培养基500μL，测定平板制备好后放置于4℃保存备用或直接用于培养菌株。
3.6.2无菌H06IJs的获得
参照Han等(1990)建立的方法，分别将无菌的1龄H.bacteriophora H06线虫与非专化性共生的P.luminescens HNA共生细菌，进行体外培养。获得肠腔内不携带共生细菌的H06感染期线虫，然后对线虫进行体表消毒(Han et al.,1998)，获得无菌的感染期线虫。
3.6.3细菌的培养与生物测定
分别取野生菌LN2-A和H06、突变菌LN2△dksA、缺失互补突变菌株LN2△dksA/pLAFR3-dksA和对照菌株LN2△dksA/pLAFR3涂于相应的抗性测定平板的孔中，每个菌株5个重复，野生型LN2-A和H06共生细菌对照。测定板置于25℃培养48h后，观察各突变菌株的生长、色素、荧光情况。然后每孔加入10μL无菌感染期线虫液，约含200条感染期线虫，测定板都加好线虫后，置于25℃培养。第4d时和第8d分别洗出LB琼脂板上的菌苔，用Ringer’s清洗线虫数次直到溶液澄清，统计第4d线虫各龄期数目和死亡数目，第8d时由于突变菌株和H06线虫共培养体系有很多二代小虫，所以没有办法统计，只是观察突变菌株以及野生型支持H06线虫的生长情况。
图10所示为共培养第4d各龄期线虫所占比率及死亡率和恢复率。如图10所示，在野生型菌株LN2-A-H06线虫共培养体系中，LN2菌株能够支持H06线虫恢复，但是因为对线虫有毒力作用，不能产生大母虫和二代小虫。从图中可以看出野生型菌株的死亡率和缺失突变菌株以及互补菌株之间有明显差异，H06线虫的死亡率分别为达到48.3％、2.8％和5.5％。突变菌株LN2△dksA-H06线虫共培养体系的怀卵比率和怀小虫比率分别为23.5％和27.9％与野生型菌株LN2-A-H06线虫共培养体系的0％有显著差异，说明缺失突变菌株已经丧失了部分杀虫活性，能够支持H06线虫产生二代小虫。野生型菌株H06-H06线虫共培养体系中，线虫能够很好的生长，怀卵比率和怀小虫比率分别达到10％和60.5％，与突变菌株的23.5％和27.9％都有显著差异，说明突变菌株对虽然能够支持H06线虫的生长繁殖但是支持的效果没有H06菌株好，野生型菌株H06-H06线虫共培养体系的线虫发育速度明显比突变菌株快。如图所示，突变菌株的互补菌株在IJ、R3、R4、adult1和adult2和突变菌株均没有明显差异，虽然死亡率和突变菌株没有明显差异但是互补菌株的死亡率为5.5％比突变菌株的2.8％死亡率高，说明互补菌株部分补偿了dksA基因的缺失。
结果表明：敲除dksA基因后，LN2菌对H06线虫的毒性减弱，且能产生二代小虫。这说明dksA基因在共生细菌LN2对共生线虫的种间杀虫能力中具有重要的作用。
3.7突变菌株上清液诱导LN2感染期线虫恢复的测定
分别挑取在25℃下在LBD相应抗性平板上培养3d野生菌LN2-A、突变菌LN2△dksA、缺失互补突变菌株LN2△dksA/pLAFR3-dksA和对照菌株LN2△dksA/pLAFR3的单菌落，接种于5mL不带抗性的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养过夜。以1:100的接种量 将菌液接种于新鲜的LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养24h至OD600约为2.0。14000g，4℃离心菌体10min，0.2μm滤膜过滤上清液，分别加入48孔细胞培养板中，500μL每孔。每孔加入10μL约含200条LN2感染期线虫，建立判断线虫时期的标准，分别于4d，8d取样观察统计线虫各龄期以及死亡线虫数。
为了测定dksA突变菌株LN2△dksA是否能正常分泌食物信号物质诱导线虫恢复，取OD600达到2.0的LN2△dksA突变菌株与LN2-A野生型菌株和LN2△dksA/pLA和互补菌株LN2△dksA/pLA-dksA菌液离心，取上清液过0.2μm滤膜除菌，将无菌的上清液加入到24孔板中，每个菌株有9各重复，每孔加500μL菌液上清液，再加入10μL无菌的200条LN2感染期线虫，上清液对线虫的诱导作用。在培养4d时，吸出到计数板中使用倒置显微镜计数，统计线虫的死亡率和恢复率。如图11所示，野生型诱导的恢复率为25％，突变均诱导的恢复率约为16.7％与野生型菌株有明显差异，说明突变菌株上清液中的诱导物质含量比野生型菌株上清液中的诱导物质低，说明dksA基因可能参与了诱导物质的合成的调控。
3.8dksA突变菌与LN2线虫的共生关系的测定
3.8.1测定平板的制备
同方法3.6.1。
3.8.2无菌LN2IJs线虫的获得
根参照Han等(1990)的方法，分别将无菌的1龄H.bacteriophora LN2线虫与非专化性共生的P.luminescens H06共生细菌，并用人工培养基进行体外培养(Bedding,1981；Wouts,1981)，获得肠腔内不携带共生细菌的LN2感染期线虫，培养30d后，在无菌条件下将线虫洗出对线虫进行体表消毒(Han et al.,1998)，获得无菌感染期线虫。
3.9dksA突变菌对LN2线虫怀卵线虫比率的影响
在LBD测定板上接种分别接种3μL野生菌LN2-A、突变菌LN2△dksA、缺失互补突变菌株LN2△dksA/pLAFR3-dksA和对照菌株LN2△dksA/pLAFR3菌液，每个菌株25个重复。测定板置于25℃培养48h后，观察各突变菌株的生长、色素、荧光情况，然后各孔加入10μL无菌感染期线虫液，含约200条感染期线虫。25℃培养，分别于第1d、2d、3d、4d观察和统计线虫各龄期线虫数目与死亡数目。
如图12所示，共培养第一天时，所有组合的细菌-线虫都已经恢复发育了，且LN2-A-LN2线虫共培养体系中R3线虫的比率为90.8％，突变菌株LN2△dksA-LN2线虫共生体系的R3线虫的比率为80％，两者有明显差异，此时恢复率和R3线虫比率一致，所以也可以所两者 的恢复率有明显差异，说明dksA基因影响了对线虫恢复的支持。可能是由于基因的缺失调整了相关基因的表达，减少了恢复信号物质的产生。当然我们还可以看出共培养第一天时，线虫只恢复发育到R3期线虫。互补菌株和缺失突变菌株在几个时期中都没有明显差异，说明互补菌株没有补偿回基因缺失所造成的影响。
如图13所示，共培养第二天时线虫进一步发育，部分发育到R3的线虫进一步发育到R4期线虫，还有部分从IJ恢复发育到R3期线虫。此时，LN2-A-LN2线虫共培养体系中线虫达到R3和R4期的线虫比率分别为25.4％和67.3％，突变菌株LN2△dksA-LN2-A线虫虫共培养体系中线虫达到R3和R4期的线虫比率分别为45.6％和41.3％，两者间都有明显差异，可以看出突变菌株-LN2线虫比野生型菌株-LN2线虫恢复的慢，所以可以得出dksA基因敲除后，能够减缓线虫的恢复发育，所以该基因对线虫的恢复发育具有很重要的作用。如图所示，LN2△dksA/pLA与LN2△dksA/pLA-dksA相比对LN2线虫的恢复发育没有明显差异，但是和突变菌株有明显差异，这可能是由于转入互补质粒的原因造成的。
如图14所示，在共培养第三天时LN2线虫已经发育到怀卵的阶段，且LN2-A-LN2线虫共培养体系中，LN2线虫的怀卵率和怀小虫率分别达到60.5％和10.2％，显著高于突变菌株LN2△dksA-LN2线虫的50％和0％。线虫洗出过程发现LN2△dksA/pLA长势不好，这可能是引起线虫恢复发育慢的原因。
如图15所示，培养第四天时线虫都到达怀小虫的阶段，野生型菌株-LN2线虫共培养时怀小虫率最高达到74.6％显著高于突变菌株的28％。而死亡率和总恢复率都显著高于突变菌株。
综上所述，dksA基因缺失突变菌株能够减缓共生线虫的恢复发育，延长线虫产生二代小虫的时间，对线虫的恢复起到很重要的调控作用，该基因可能参与调控分泌信号物质。对细菌-线虫共生关系的研究具有重要的作用。但是dksA基因是在诱导恢复中起作用还是在整个恢复和发育中其作用还不是很清楚。
3.10dksA突变菌对LN2线虫海绵培养时产量的影响
配制海绵培养基，分装到1L的三角瓶中，每瓶200g海绵培养基，121℃灭菌1h。取出-80℃保存的甘油菌野生菌LN2-A、突变菌LN2△dksA、缺失互补突变菌株 LN2△dksA/pLAFR3-dksA和对照菌株LN2△dksA/pLAFR3分别在相应抗性LBD平板划线培养，25℃培养3d后挑取直径3mm左右的单菌落接种到200mL的LBD液体培养基中，25℃，200rpm培养36h，培养至OD600约为2.0。将菌液接种到海绵培养基中，每瓶接种量为20mL，每种菌株接5瓶海绵培养基，拍打海绵使菌液均匀。将接种好的海绵培养基包好后放置在25℃培养2d。将获得的无菌的IJs LN2线虫计数并调整线虫浓度为100000条/mL，将培养2d的接种有菌液的海绵培养基取出，每瓶加入2mL LN2线虫液。所有培养的海绵培养基都加过线虫的三角瓶都包好，放置在25℃养虫室培养30d。每种菌株取出3瓶，用5L水洗出线虫，将所有的5L置于一个比较大的盆中，搅拌均匀后吸出1mL于200mL水中混匀(3个重复)，然后取出1mL于计数板中观察并统计线虫各龄期数目和死亡率(3个重复)。
为了测定突变菌株对海绵培养时线虫产量的影响，利用非共生组合培养体系共生细菌H06-LN2线虫获得体内不带共生细菌的IJs线虫，利用表面消毒获得无菌的LN2IJs线虫，并在培养30d后洗出线虫计数，对感染期线虫进行统计分析，如图16所示，数据分析结果可得，野生型菌株LN2-A、突变菌株LN2△dksA、LN2△dksA/pLA和LN2△dksA/pLA-dksA对LN2线虫的IJs产量在turkey水平上差异不大，分别达到57.7万条/g海绵培养基、64.3万条/g海绵培养基、56.9万条/g海绵培养基和55.8万条/g海绵培养基。所以dksA基因对在海绵固体培养时LN2线虫的产量没有影响。
综上所述，本发明的结论是：
1.突变菌株LN2△dksA在菌落形态、菌落粘性、荧光、色素分泌等特征与野生型菌株具有明显差异。
野生型菌株LN2-A在NBTA板上呈现黄绿色，而突变株LN2△dksA的菌落在NBTA平板上呈深绿色而且突变菌株的菌落明显比野生型大，说明dksA基因的缺失导致了菌落对色素的吸收。将培养了48h的野生型菌株LN2-A和突变株LN2△dksA菌液置于黑暗中观察，发现两者都产生了荧光。将培养3d的LB平板上的野生型菌株LN2-A和突变株LN2△dksA菌落，在黑暗上观察荧光时发现LN2-A有强荧光，突变株LN2△dksA的荧光很微弱，说明dksA基因的缺失导致菌株荧光蛋白的产生量减少。野生型菌株LN-A和突变菌株LN2△dksA的菌落均具有粘性，但野生型的粘性强于突变菌株。而且在LB平板上培养3d时野生型菌株的菌 落颜色为深黄色，而突变菌株的颜色为微黄色。
2.LN2△dksA菌株对大蜡螟的注射毒力显著降低。
野生型的注射毒力明显高于突变菌株。当注射浓度为100CFU和1000CFU野生型菌株对大蜡螟的注射死亡率均显著高于突变菌株的注射毒力。互补菌株对dksA基因的缺失有一定的补偿作用。
3.dksA基因的敲除使P.luminescens LN2细菌失去对非特异共生线虫H.bacteriophora H06的毒性，且能支持H06线虫繁殖。
野生型菌株LN2-A-H06线虫共培养体系中，LN2菌株能够支持H06线虫恢复，但是因为LN2菌株对线虫的毒力作用，不能产生大母虫和二代小虫。野生型菌株的死亡率显著高于缺失突变菌株。突变菌株LN2△dksA-H06线虫共培养体系的怀卵比率和怀小虫比率显著高于野生型菌株，说明缺失突变菌株已经丧失了部分杀虫活性，能够支持H06线虫产生二代小虫。野生型菌株H06-H06线虫共培养体系中，线虫的怀小虫比率分显著高于突变菌株的，说明突变菌株对虽然能够支持H06线虫的生长繁殖但是支持的效果没有H06菌株好，野生型菌株H06-H06线虫共培养体系的线虫发育速度明显比突变菌株LN2△dksA快。突变菌株的互补菌株在IJ、RJ3、F4、AE和AJ和突变菌株均没有明显差异，但是互补菌株的死亡率略高于突变菌株，说明互补菌株部分补偿了dksA基因的缺失。
结果表明：敲除dksA基因后，LN2菌对H06线虫的毒性减弱，且能产生二代小虫。这说明dksA基因对共生细菌LN2对共生线虫的种间杀虫能力具有重要的调控作用。
4.LN2△dksA菌株显著延迟H.indica LN2感染期线虫的恢复和雌雄同体母虫的怀卵。
生物测定实验结果表明：野生型菌株LN2和H.indica LN2线虫组合培养时，LN2线虫的生长发育明显比突变菌株LN2△dksA和H.indica LN2线虫组合培养时线虫的生长发育快。
5.LN2△dksA菌株不影响H.indica LN2线虫于海绵固体培养基中的产量。
野生型菌株LN2-A和突变菌株LN2△dksA和LN2线虫组合培养时，LN2线虫的产量没有显著差异。所以dksA基因对组合培养时线虫的产量没有影响。