有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法.pdf

《有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102226176 A (43)申请公布日 2011.10.26 CN 102226176 A *CN102226176A* (21)申请号 201110160531.3 (22)申请日 2008.09.10 200810151276.4 2008.09.10 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市塘沽区经济技术开发区 十三大街 29 号 (72)发明人 张治洲 杨霞 刘芳 孟良玉 (74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限 公司 12209 代理人 王来佳 (54) 发明名称 有机溶剂增强高GC含量DNA。

2、片段扩增效率的 方法 (57) 摘要 本发明涉及一种有机溶剂增强高 GC 含量 DNA 片段扩增效率的方法， 包括 (1) 待扩增 DNA 的提 取、 (2)PCR 体系的配置及优化、 (3)PCR 条件的设 定与运行、 (4)PCR产物电泳检测， 其中PCR体系的 优化是在PCR反应体系中添加有机溶剂， PCR产物 电泳检测采用 1琼脂糖凝胶， 跑胶后用 EB 液染 色， 然后用紫外分光透射仪观察扩增片段在凝胶 中的位置， 并与相应的分子量标准做对照。 本发明 使用的优化剂为普通化学试剂， 价格便宜， 可获得 性强 ； 优化剂易于长期室温保存， 使用方便。本发 明对富含 GC 碱基 DNA 。

3、片段的扩增效果明显， 使得 针对高 GC 含量序列的扩增更具有效率和目的性。 这对分子生物学技术试验的发展将具有重大理论 意义和应用价值。 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 CN 102226183 A1/1 页 2 1. 一种有机溶剂增强高 GC 含量 DNA 片段扩增效率的方法， 包括 (1). 待扩增 DNA 的提 取、 (2).PCR 体系的配置及优化、 (3).PCR 条件的设定与运行、 (4).PCR 产物电泳检测， 其特 征在于 ： PCR 体系的优化是在 。

4、PCR 反应体系中添加有机溶剂， PCR 产物的电泳检测采用 1 琼脂糖凝胶， 跑胶后用 EB 液染色， 然后用紫外分光透射仪观察扩增片段在凝胶中的位置， 并与相应的分子量标准做对照， 所述有机溶剂为乙二醇， 其添加量为15L PCR反应液加入 1.5L 的乙二醇。 2.根据权利要求1所述的有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法， 其特征在 于 ： 所述有机溶剂为纯度为分析纯及以上级别的试剂。 权 利 要 求 书 CN 102226176 A CN 102226183 A1/5 页 3 有机溶剂增强高 GC 含量 DNA 片段扩增效率的方法 0001 本申请是 ： 专利申请号为 200。

5、810151276.4， 发明创造名称 “有机溶剂增强高 GC 含 量 DNA 片段扩增效率的方法 “的分案申请。 0002 原申请的申请日 ： 2008年9月10日， 原申请的申请号 ： 200810151276.4， 原申请的 发明创造名称 ： 有机溶剂增强高 GC 含量 DNA 片段扩增效率的方法。 技术领域 0003 本发明属于分子生物学领域的聚合酶链式反应 (PCR) 扩增， 尤其是一种应用有机 溶剂为优化剂增强高 GC 含量 DNA 片段扩增效率的方法。 背景技术 0004 PCR 技术是在核酸研究的基础上发展起来的， 自 1930 年正式提出 DNA 和 RNA 两 种核酸的概念。

6、后， 人们对核酸的化学组成、 结构及其功能进行了更为深入的研究， 1953 年 Watson 和 Crisk 根据 X 一射线衍射图形及各种化学分析数据提出的 DNA 双螺旋结构及其 半保留复制模型， 是生物科学史上的一个飞跃， 使得对基因在体外克隆、 表达、 调控等方面 取得了长足的进展， 并由此拉开基因工程的序幕。随着大量科学家的不断研究， 在 1985 年 美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应 (PCR)。 0005 但是聚合酶链式反应(PCR)发展到今天已经有20多年的时间了， 随着技术不断的 发展、 进步， PCR 已经成为分子生。

7、物学研究中不可缺少的一项实验技术， 并广泛应用于遗传 学、 微生物学、 乃至整个生命科学领域的研究中。但是自 PCR 建立以来， 在实际应用中也表 现出了它所具有的不足， 尤其是针对 GC 含量很高的序列更是不容易得到理想的结果， 甚至 有时候基本上扩增不出靶基因。因为 G、 C 之间形成三对氢键， 解链所需能量较高， 模板较 难打开， 而高 GC 含量模板扩增中所面临的主要困难还是模板中容易形成稳定的二级结构， 妨碍了 DNA 聚合酶在模板上的推进， 以及模板上可能存在多个非特异性的引物局部复性位 点， 导致非特异性扩增。 0006 针对此方面的研究有很多， 过去曾研发一些有效的手段来优化 。

8、PCR 效率。为解决 此问题， 人们采取了各种措施如增加变性及退火温度， 调节Mg2+浓度， 用NaOH进行DNA模板 变性， 用碱基类似物 7-deaza-dGTP 和 dITP 替代 dGTP 以降低被取代 DNA 的解链温度 Tm， 采 用 Touch-down 方法进行扩增 ； 也有人在 PCR 反应体系中加入各种促进剂， 如甲酰胺、 砜类 (DMSO)、 甘油、 BSA、 非离子去污剂及氯化四甲基铵等， 以增加 PCR 的特异性和产量。上述措 施对有些 GC 含量高的 DNA 模板的 PCR 扩增有效， 但有时无效， 其原因前尚不清楚。因此找 到切之有效的手段来优化 PCR 效率显得。

9、十分的重要， 对这一问题的研究就很有意义， 也对 以后的研究工作也有一定的帮助作用。 发明内容 0007 本发明的目的在于克服现有技术中高 GC 含量 DNA 片段扩增的常见问题而提供一 说 明 书 CN 102226176 A CN 102226183 A2/5 页 4 种有机溶剂增强高 GC 含量 DNA 片段扩增效率的方法， 该方法通过在 PCR 反应体系中添加有 机溶剂达到对 DNA 片段的有效扩增， 对高 GC 含量 DNA 片段扩增的效果明显。 0008 本发明采取的技术方案是 ： 0009 一种有机溶剂增强高GC含量DNA片段扩增效率的方法， 包括(1).待扩增DNA的提 取、 。

10、(2).PCR 体系的配置及优化、 (3).PCR 条件的设定与运行、 (4).PCR 产物电泳检测， 其特 征在于 ： PCR 体系的优化是在 PCR 反应体系中添加有机溶剂， PCR 产物的电泳检测采用 1 琼脂糖凝胶， 跑胶后用 EB 液染色， 然后用紫外分光透射仪观察扩增片段在凝胶中的位置， 并与相应的分子量标准做对照， 所述有机溶剂为 1， 2- 丙二醇， 其添加量为 15L PCR 反应 液加入 1.5L 的乙二醇。 0010 而且， 所述有机溶剂为纯度为分析纯及以上级别的试剂。 0011 本发明的优点和积极效果是 ： 0012 (1). 本发明应用于高 GC 含量 DNA 片段扩。

11、增的有机溶剂乙二醇， 比已有提高高 GC 含量 DNA 片段的 PCR 添加剂具有更优的效果， 对高 GC 模板的扩增效果明显， 副作用少。这 一发现对于高 GC 含量片段的扩增是一个新的突破， 为满足不同实验内容的高 GC 扩增提供 了有效的方法和借鉴。 0013 (2).本发明中所涉及的应用有机溶剂增强高GC含量DNA片段的扩增方法， 与已有 的方法相比， 该方法所用的 PCR 促进剂为普通化学试剂， 价格便宜， 可获得性强 ； 促进剂易 于长期室温保存， 使用方便。 0014 (3). 本发明对富含 GC 碱基 DNA 片段的扩增效果明显， 使得针对高 GC 含量序列 的扩增更具有效率和。

12、目的性， 对分子生物学技术试验的发展将具有重大理论意义和应用价 值。 附图说明 0015 图 1 为本发明扩增 GC 68.8、 长度为 780bp 的 DNA 片段的结果 ； 0016 图 2 为本发明扩增 GC 69.6、 长度为 771bp 的 DNA 片段的结果 ； 0017 图 3 为本发明扩增 GC 62.1、 长度为 739bp 的 DNA 片段的结果 ； 0018 图 4 为本发明扩增 GC 71.1、 长度为 796bp 的 DNA 片段的结果 ； 0019 图 5 为本发明扩增 GC 71.2、 长度为 775bp 的 DNA 片段的结果 ； 0020 图 6 为本发明扩增。

13、 GC 71.6、 长度为 728bp 的 DNA 片段的结果 ； 0021 图 7 为本发明扩增 GC 73.3、 产度为 806bp 的 DNA 片段的结果 ； 0022 图 8 为本发明扩增 GC 78.1、 长度为 735bp 的 DNA 片段的结果 ； 0023 图 9 为本发明扩增 GC 76.9、 长度为 729bp 的 DNA 片段的结果 ； 0024 图 10 为本发明扩增 GC 76.3、 长度为 754bp 的 DNA 片段的结果 ； 0025 图 11 为本发明扩增 GC 75.9、 长度为 714bp 的 DNA 片段的结果。 具体实施方式 0026 下面结合实施例，。

14、 对本发明进一步说明 ； 下述实施例是说明性的， 不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 0027 本发明所涉及的 PCR 技术的优化方法是通过向 PCR 体系中添加有机溶剂来实现 说 明 书 CN 102226176 A CN 102226183 A3/5 页 5 的， 其具体操作方法如下 ： 0028 1. 待扩增人类基因组 DNA 的提取 ： 0029 2.PCR 体系的配置及优化 0030 PCR 体系根据现有的技术， 由待扩增 DNA 片断的不同而各不相同。具体表现在 dNTP、 模板、 Mg2+、 引物的添加量根据不同的模板和不同的扩增片段长度来选择 ； 0031。

15、 PCR反应体系中的H2O为双蒸水及以上级别水， 体系中水的添加量应根据有机溶剂 添加的体积进行调整， 即应扣除相应添加的有机溶剂的体积。在上述 PCR 反应体系中加入 一定体积的所选用的某一种有机溶剂。为适合 PCR 反应的特殊需要， 所有有机溶剂均需用 一定的方法灭 DNA 酶和 RNA 酶。灭酶的方法有多种， 本发明采用的方法是真空滤膜过滤灭 酶法。对于直接购买的已经灭 DNA 酶和 RNA 酶的产品， 无需再做灭酶处理。 0032 3.PCR 条件的设定与运行 0033 PCR 反应条件中的预变性、 变性及退火各阶段的温度和对应时间应根据不同模板 和引物融解温度来选择 ； 其中的延伸温。

16、度根据所用聚合酶的合适温度来选择 ； 延伸时间根 据所扩增片段的长度来选择 ； 循环次数根据个人试验目的和需要进行选择。 0034 4.PCR 产物的检测 ： 0035 一般用琼脂糖凝胶电泳技术进行检测， 琼脂糖凝胶的浓度及 PCR 产物的上样体积 需根据具体情况而定。 0036 本发明所采用的琼脂糖凝胶电泳技术依照已有方法概括如下 ： 0037 (1). 琼脂糖凝胶的具体浓度大小应根据扩增 DNA 片段的大小来确定。 0038 (2). 吸取一定体积的 PCR 产物上电泳槽点样， 同时点上合适分子量标记作为参 照。 0039 (3). 加上 3-4V/cm 的电压进行电泳。 0040 (4)。

17、. 待指示剂到合适位置时， 取出胶板于凝胶成象系统下观察并照相记录。 0041 本发明采用的有机溶剂为下述之一， 或者两种以上的混合物， 包括系列酯类， 如乙 酸乙酯， 乙酸丙酯， 乙酸丁酯等 ； 系列醇类， 如丙醇， 异丙醇， 正丁醇， 异丁醇， 仲丁醇， 叔丁 醇， 正己醇等 ； 系列酮类， 如 2- 丁酮。而且所有的有机溶剂纯度为分析纯及以上级别的试 剂。 0042 本发明中 PCR 体系的优化是指 ： 直接在体系中加入一定体积的一种或几种上述有 机溶剂， 所用有机溶剂无需任何方式的稀释。 0043 本发明所称的 PCR 扩增包括 ： 常规 PCR、 低拷贝数 PCR 扩增、 长片段 P。

18、CR、 复杂模板 PCR、 高 GC 含量的 PCR、 反复扩增的 PCR 以及含有较多重复序列的 PCR 扩增。 0044 具体示例 ： 0045 一种有机溶剂增强高 GC 含量 DNA 片段扩增效率的方法， 其步骤是 ： 0046 1. 待扩增人类基因组 DNA 的提取 ： 0047 2.PCR 反应体系的配置 ： 0048 按以下顺序和添加量配置体系于薄壁 PCR 管中。 0049 说 明 书 CN 102226176 A CN 102226183 A4/5 页 6 0050 其中， 模板为 GenomicDNA， 从人类血液中提取 ； Taq 酶及有机溶剂来自北京三博远 志生物工程公司。

19、。采用的方法是真空滤膜过滤灭酶法。对于直接购买的已经灭 DNA 酶和 RNA 酶的产品， 无需再做灭酶处理。 0051 3.PCR 体系的优化与运行 ： 0052 在多种有机溶剂对低 GC 含量 DNA 的作用下， 选择扩增效果显著试剂， 运用选择出 的有机溶剂对高 GC 难扩增的 DNA 片段进行实验。 0053 通过本实验， 发现 1， 2- 丙二醇和乙二醇对高 GC 难扩增的 DNA 片段扩增有显著作 用。 0054 对不同 GC 含量的 DNA 片段， 每个片段都配置 4 管， 且从 0 3 编号。 0055 每个片段的 0 3 管， 分别添加不用的试剂， 添加试剂分别为 ： 0056。

20、 0 号管 ： 本身扩增， 无添加任何试剂 ； 0057 1 号管 ： 添加 Betaine ； 0058 2 号管 ： 添加 1， 2- 丙二醇 ； 0059 3 号管 ： 添加乙二醇。 0060 3. 按以下条件在 PCR 仪上设定循环条件进行 PCR 热循环。 0061 0062 0063 4. 对扩增完成后的 PCR 产物进行琼酯糖凝胶电泳检测。 0064 PCR 产物的电泳检测采用 1琼脂糖凝胶， 跑胶后用 EB 液 ( 溴化乙啶 Ethidium bromide) 染色， 然后用紫外分光透射仪观察扩增片段在凝胶中的位置， 并与相应的分子量 标准做对照。 0065 具体扩增结果如图1。

21、所示， 在图中标记M代表分子量标准带的位置， 此图中分子量 标准为 DNA2000。 说 明 书 CN 102226176 A CN 102226183 A5/5 页 7 0066 从其他附图中可以看出， 与未加任何添加剂的 PCR 体系扩增的结果相比， 用公认 的对高 GC 扩增有显著效果的试剂 Betaine 作用， 这些片段也不能成功扩增 ； 而在有机溶剂 1， 2-丙二醇和乙二醇的作用下， 这些高GC含量的难扩增的DNA片段成功扩增。 这表明有机 溶剂 1， 2- 丙二醇和乙二醇均对高 GC 难扩增 DNA 片段的扩增有显著的作用。 说 明 书 CN 102226176 A CN 102226183 A1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102226176 A CN 102226183 A2/3 页 9 图 5 图 6 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 102226176 A CN 102226183 A3/3 页 10 图 9 图 10 图 11 说 明 书 附 图 CN 102226176 A 。