技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及来源于牛筋草EPSPS基因的启动子及 其应用。
背景技术
目前，转基因抗草甘膦作物的培育主要是通过转入外源EPSPS基因来实现 的，各国科学家们已从植物及微生物中获得大量抗草甘膦EPSPS基因用于转基 因抗草甘膦作物的研究，其中从土壤细菌Agrobacterium中分离出来的 CP4-EPSPS基因是最有效的，而其他EPSPS基因用于研究抗草甘膦转基因作物 的效果却不佳，普遍存在外源基因表达量不高的现象，其原因尚不明确。植物 基因转录水平的表达受上游启动子中的顺式作用元件和细胞内转录因子共同调 控，EPSPS基因启动子目前尚未见报道。获得EPSPS基因启动子，将EPSPS基 因启动子和EPSPS基因共同应用于抗草甘膦转基因作物的研究具有较强的应用 意义。
发明内容
本发明的首要目的在于提供EPSPS基因的启动子。
本发明的另一目的在于提供上述启动子的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
EPSPS基因的启动子，为如下的一种：
(1)SEQIDNo.1或SEQIDNo.2；
(2)与SEQIDNo.1或SEQIDNo.2互补的DNA片段；
(3)高严谨条件下能够与(1)或(2)中的DNA序列杂交且具有启动子功 能的DNA片段；
所述的高严谨条件是指在0.5×SSC的溶液中杂交并洗膜；
(4)与(1)或(2)中的DNA序列具有90％以上同源性且具有相同功能 的DNA片段。
扩增上述启动子全长或任意片段的引物也属于本发明保护的范围，优选的 引物序列如SEQIDNo.7、SEQIDNo.8、SEQIDNo.9、SEQIDNo.10、SEQ IDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13、SEQIDNo.14、SEQIDNo.15、SEQ IDNo.16、SEQIDNo.17或SEQIDNo.18所示。
含有上述启动子的重组载体、重组菌、转基因细胞系和表达盒也属于本发 明的保护范围。
上述启动子可以应用在植物遗传育种中，用于培育抗草甘膦转基因作物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
功能实验证明，本发明的两种DNA片段SEQIDNo.1和SEQIDNo.2是启 动子片段，两种片段的核苷酸序列有15个碱基的差异，都能有效地启动下游基 因的表达，但含有SEQIDNo.2的重组表达载体转入植物细胞后，能提高受体植 物对草甘膦的抗药性，在抗草甘膦转基因植物育种中具有重要应用意义。
附图说明
图1为牛筋草EPSPS基因组序列扩增产物电泳分析图。
图2为EPSPS基因组上游序列扩增产物电泳分析图。
图3为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2核苷酸序列分析及差异比对图。
图4为启动子Epro-S和Epro-R片段扩增产物电泳分析图。
图5为不同浓度草甘膦对牛筋草EPSPS基因启动子活性影响结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
启动子序列的克隆，包括以下步骤：
1)、牛筋草基因组DNA的提取
取敏感型牛筋草叶片，加入液氮后充分研磨，将研磨后的粉末倒入1.5mL 离心管中，然后按照植物基因组DNA提取试剂盒(购自TaKaRa公司，产品编 号D9194)的操作说明提取基因组DNA。
2)、Tail-PCR扩增
根据牛筋草EPSPS基因cDNA序列(基因登录号:HQ403647)设计上下游 引物EGF和EGR，以敏感型牛筋草植物基因组DNA为模板扩增出牛筋草EPSPS 基因组片段，命名为EP-gDNA，测序获得2415bpEPSPS基因组序列(SEQID No.3)，其电泳图片如图1所示。
然后根据该基因组核苷酸序列，用引物设计软件primerpremier5.0设计三 个特异性下游引物SP1、SP2和SP3，对其上游序列进行Tail-PCR扩增，获得片 段1后，根据片段1序列设计下游引物SP4、SP5和SP6继续进行第二次Tail-PCR 扩增，得到片段2。两次扩增中用简并引物LAD1-1、LAD1-3和AC1作为PCR 反应的上游引物。
引物序列如下：
以敏感型基因组DNA为模板，利用Tail-PCR技术进行EPSPS基因上游调 控序列扩增。
Tail-PCR预扩增体系如下：
第一轮Tail-PCR扩增体系下：
第二轮Tail-PCR扩增体系如下：
Tail-PCR反应程序：
反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果如图2所示，回收目的条 带。将回收产物与载体pEasy-T载体连接测序。片段1(1269bp)的序列如SEQ IDNo.4所示，片段2(1080bp)的序列如SEQIDNo.5所示。
利用DNAStar软件将EPSPS基因组序列(SEQIDNo.3)、启动子片段1 (SEQIDNo.4)和片段2(SEQIDNo.5)拼接后显示共获得4244bp核苷酸片 段(SEQIDNo.6)。
利用NCBI的BLAST程序对该序列进行比对，结果显示5’端885bp核酸 序列未找到同源序列，剩下的3359bp核酸序列与基因库中牛筋草的EPSPS基因 同源性达到99％，表明该序列片段为牛筋草的EPSPS基因组序列，而5’端885bp 核酸序列则为该基因的启动子序列。
根据该启动子序列设计上下游引物Pfull-F:5′ --GAATTCGTGACGTGAACGAACTGCAAC--3′(SEQIDNo.15)，Pfull-R:5′ --GGTACCGTAGTGGACGTCCTCACTGTT--3′(SEQIDNo.16)，分别以敏感 型和抗型牛筋草基因组DNA为模板，克隆牛筋草EPSPS基因上游启动子片段 Epro-S和Epro-R，结果如图3所示,将回收产物与载体pEasy-T载体连接(详细 见pEASY-BluntZeroCloningKit说明书)获得pEasy-Epro-S和pEasy-Epro-R， 分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆测序。Epro-S和Epro-R测 序结果分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示。
Pfull-F和Pfull-R引物的5’端分别添加限制性内切酶EcoRI(5’ -GAATTC-3’)和KpnI(5’-GGTACC-3’)的识别序列。
PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30sec，58℃复性30sec， 72℃延伸2min，32个循环；最后72℃延伸10min。
实施例2
启动子片段Epro-S和Epro-R序列分析
利用DNAStar软件中的MegAlign模块对Epro-R/S进行序列比对显示，结 果显示两段序列相似度达到99％。但与敏感型相比，抗型牛筋草EPSPS基因上 游序列在-427～-425和61～72区域分别有3和12个碱基的插入，如图4所示。 由于两条序列的相似度极高，选择片段较长的Epro-R序列做进一步生物信息学 分析。
利用专门分析植物启动子序列的网站PlantCARE及网站NEWPLACE，同 时结合比对结果对基因序列Epro-R进行预测分析。分析结果(图4)显示所获 得的EPSPS基因上游序列具有植物基因启动子典型特征，预测的转录起始位点 位于EPSPS基因翻译起始密码子ATG上游-223nt处，图中大写字母“A”显示， 标记为+1。在转录起始位点上游包含有典型的TATA-box和CAAT-box,分别位于 转录起始位点上游的-31nt和-566nt处，同时在该段启动子序列中还预测到水杨 酸反应元件(TGACG-element)、光反应元件(L-box)和植物生长素反应元件 (AuxRR-core)(图4)，推测EPSPS基因的表达受多种因子调控。值得注意的 是，在转录起始位点和翻译起始位点之间存在一段223bp的5’端非翻译区，在 这个区域中存在一个高转录水平顺式作用元件(5UTRPy-richstretch)，该元件 是调控下游基因的高水平表达的一个典型元件，在这个元件序列上，Epro-R比 Epro-S多12个碱基。
实施例3
启动子片段Epro-S和Epro-R功能验证，包括以下步骤：
1)、构建启动子GFP表达盒的重组表达载体
扩大培养含pEasy-Epro-S和pEasy-Epro-R重组质粒的菌株以及含有绿色荧 光蛋白GFP植物表达载体p35S-GFP，该载体由pCAMBIA1300改造而成，用引 物35S-UP：GTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT(SEQIDNo.17) 和35S-low:CTGCAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG(SEQIDNo.18)， 从pEGFP-N1上扩增GFP序列，上游引物5’端加了SalⅠ酶切位点，下游引物 5’端加了PstⅠ酶切位点，PCR产物连入Pmd18-T载体后，用SalⅠ和PstⅠ酶 切后连入用相同酶切pCAMBIA1300载体上，构建好的载体命名为p35S-GFP。
利用质粒提取试剂盒(TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.4.0)从 上述扩大培养的菌株中提取pEasy-Epro-S、pEasy-Epro-R和p35S-GFP质粒DNA。 利用EcoRI酶和KpnI酶进行酶切后，回收目的片段，利用T4DNA连接酶将 Epro-S和Epro-R启动子片段分别连接到p35S-GFP载体中，连接产物直接转化 大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆测序，获得pGFP-Epro-S和 pGFP-Epro-R重组质粒。
2)、将重组质粒pGFP-Epro-S和pGFP-Epro-R分别转入农杆菌
取5μLpGFP-Epro-S、pGFP-Epro-R重组质粒和p35s-GFP载体质粒，分 别加入农杆菌感受态细胞中，冰上放置30min；液氮中放置5min；37℃水浴， 5min；加入800μLYEB液体培养基，轻轻混匀，28℃，200rpm振荡培养4h； 4000rpm离心5min，吸取800μL上清，留200μL重悬菌体；取200μL菌液， 涂布于带Kan抗性(50mg/L)和利福平(Rif)抗性(50mg/L)的YEB平板 上，28℃倒置培养48h。得到分别含pGFP-Epro-S、pGFP-Epro-R重组质粒和 p35s-GFP表达载体的农杆菌。将农杆菌菌液接种至50mlYEB液体培养液中(含 有50mg/LKan，125mg/LStr和100μM/L乙酰丁香酮)中，28℃200rpm振荡 培养过夜；培养物于2800rpm，离心10min，收集菌体，并重悬于液体MS培 养基(含10mMMgCl2，100μM/L乙酰丁香酮)中，使OD600＝0.6左右，备 用。
3)、将含pGFP-Epro-S和pGFP-Epro-R重组质粒的农杆菌转染洋葱表皮细 胞并观察
选取新鲜、生长状况良好的洋葱，在无菌条件下，除去外面的干枯鳞片叶， 将整个鳞茎在75％乙醇中浸泡处理10min，用无菌水洗涤3次；用无菌解剖刀 十字形切开洋葱，取球茎中层稍靠内部的较新鲜肥厚的鳞片叶，用刀片在内表 皮(凹面)上轻轻划出面积为1cm2的小方块，然后用镊子轻轻将小方块撕下， 浸于步骤2)备好的农杆菌菌液中(菌液中分别添加0、10、50、100mM草甘膦)， 间或轻轻摇动，处理20min；用镊子轻轻夹起表皮一角，无菌滤纸上稍滤干菌 液，以贴近鳞片叶肉的一面朝下，平铺于MS固体培养基上(培养基上分别添 加0、10、50、100mM草甘膦)，黑暗条件下，25℃共培养18h左右；取出洋 葱内表皮小块，用液体MS培养基稍稍晃动洗涤，去除附着在表皮上的农杆菌， 压片法制片，于OLYMPUSOptiGrid荧光显微镜下观察并拍照。
结果如图5所示，启动子35S、Epro-S和Epro-R均能启动下游绿色荧光蛋白 表达，10、50、100mM草甘膦处理后，Epro-S启动子活性受到抑制，而35S和 Epro-R仍有启动子活性。说明本发明Epro-S和Epro-R片段是启动子，能启动下 游绿色荧光蛋白表达，且在启动子区域确实存在草甘膦信号响应位点，转入 Epro-R启动子片段的洋葱表皮细胞对草甘膦耐受性提升，35S启动子对草甘膦不 敏感。该发明对将来抗草甘膦转基因作物的研究具有重要意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。