奶山羊MFG-E8基因的单核苷酸多态性及其检测方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101705288 B (45)授权公告日 2011.12.28 CN 101705288 B *CN101705288B* (21)申请号 200910219002.9 (22)申请日 2009.11.17 C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省西安市杨凌示范区邰城 路 3 号 (72)发明人 陈宏 屈玉娇 蓝贤勇 刘艳丽 李转见 陈忠琦 淮永涛 雷初朝 胡沈荣 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有限责任 公司 61200 代理人 陆万寿 CN 101203234 A,2008.06.18, 全文 .。

2、 CN 1680600 A,2005.10.12, 全文 . Zhuanjian Li et al.Two novel cSNPs of weaver gene in Chinese indigenous goat and their associations with milk yield.Mol Biol Rep .2009, 第 37 卷 ( 第 1 期 ), 第 563-569 页 . (54) 发明名称 奶山羊 MFG-E8 基因的单核苷酸多态性及其 检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种奶山羊 MFG-E8 基因单核 苷酸的多态性及其检测方法， 以包含 MFG-E8 基 因的待。

3、测奶山羊全基因组 DNA 为模板， 以引物对 P( 包括 P1， R1， newP) 为引物， PCR 扩增奶山羊 MFG-E8 基因 ； 用限制性内切酶 EcoRV 消化 PCR 扩 增产物之后， 再对酶切后的扩增片段进行聚丙烯 酰胺凝胶电泳 ； 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴 定奶山羊 MFG-E8 基因第 12892nt 的单核苷酸多 态性 ； 由于 MFG-E8 基因功能涉及乳腺发育， 乳脂 和总固形物等奶成分， 本发明提供的检测方法为 MFG-E8基因的SNP与奶成分关系的建立奠定了基 础， 以便用于中国奶山羊奶用性状的标记辅助选 择， 快速建立遗传资源优良的奶山羊种群。 (51)In。

4、t.Cl. (56)对比文件 审查员 姚进孝 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 2 页 CN 101705288 B1/1 页 2 1. 奶山羊 MFG-E8 基因的单核苷酸多态性， 其特征在于， 其基因单核苷酸多态性包括 ： 在奶山羊 MFG-E8 基因第 12892bp 为 C 或 T 的碱基多态性。 2. 权利要求 1 所述的奶山羊 MFG-E8 基因单核苷酸多态性的检测方法， 其特征在于， 以 包含 MFG-E8 基因的待测奶山羊全基因组 DNA 为模板， 以引物对 P 为引物， PCR 扩增奶山羊 MFG-E8 基因 。

5、； 用限制性内切酶 EcoRV 消化 PCR 扩增产物之后， 再对酶切后的扩增片段进行 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ； 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定奶山羊MFG-E8基因第12892nt的 单核苷酸多态性 ； 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定奶山羊 MFG-E8 基因第 12892nt 的单核苷酸多态性 为 ： TT 基因型表现为 195bp 一条带 ； TC 基因型表现为 195bp、 175bp 和 20bp 三条带 ； CC 基因 型表现为 175bp 和 20bp 两条带 ； 其中， 单核苷酸多态性 CC 基因型为同义密码子突变 ； 所述的引物对 P 为 ： 上游引物 ： cctactacgc。

6、 acgactggat at 22 ； 下游引物 ： acaaggctca aagaaactcc 20。 3. 如权利要求 2 所述的奶山羊 MFG-E8 基因单核苷酸多态性的检测方法， 其特征在于， 所述的 PCR 扩增反应程序为 ： 94预变性4min ； 94变性30s， 56退火30s， 72延伸20s， 3035个循环 ； 72 延伸 10min。 4. 如权利要求 2 所述的奶山羊 MFG-E8 基因单核苷酸多态性的检测方法， 其特征在于， 所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为 10聚丙烯酰胺凝胶电泳。 权 利 要 求 书 CN 101705288 B1/10 页 3 奶山羊 MFG-E8 。

7、基因的单核苷酸多态性及其检测方法 技术领域 0001 本发明属于分子遗传学领域， 涉及以奶山羊的功能基因的单核苷酸多态性 (SNP) 作为分子遗传标记， 特别涉及一种奶山羊 MFG-E8 基因的单核苷酸多态性及其检测方法。 背景技术 0002 羊奶具有很高的营养价值， 不含过敏原， 营养成分均衡， 易消化吸收， 与人乳蛋白 质组成相似 ； 羊奶的脂肪颗粒体积为牛奶的三分之一， 羊奶中的蛋白质、 矿物质， 尤其是钙、 磷、 维生素及微量元素的含量比牛奶略高， 且更利于人体吸收， 在国际营养界被誉为 “奶中 之王” 。羊奶由于有膻与味喝牛奶相比， 羊奶的人较少。随着高科技应用于生物制药、 食品 加。

8、工， 脱膻技术的应用给羊奶界蓬勃发展带来可能。 虽然奶山羊是我国主要的奶畜之一， 但 是我国羊奶的生产同发达国家相比差距巨大， 主要是因为我国优秀奶山羊品种种源不足和 种群遗传品质较差。 0003 传统的育种方法应用测试动物的表现型和其亲代、 祖代及其它亲属在小的动物模 型中的遗传信息， 设想性状受到许多基因遗传差异的影响， 每个基因对性状有相对较小的 贡献， 因此对性状的估计不可避免有些偏差。分子遗传标记是近年来现代遗传学发展最快 的领域之一， 新的方法正在不断涌现， 已定位的标记基因数目与日俱增。 这将为数量遗传学 提供分子水平信息， 家畜育种也将跨入分子育种阶段。应用分子遗传标记的现代育。

9、种技术 是加快良种选育和提高种群遗传品质， 从而增加奶山羊的产奶量和改善乳品质的先进的有 效的方法。 0004 分子遗传标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合， 通过对遗传 标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点 (QTL)， 使之能够同时利用标记位点信 息和数量性状的表型信息， 更准确估计动物个体的育种值， 提高选择效率， 加快育种进展。 标记辅助选择主要经历了三个阶段 ： 第一阶段是家畜各性状间的遗传分析 ； 第二阶段是蛋 白质 ( 酶 ) 标记对数量性状的标记阶段 ； 第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记 技术日渐成熟与丰富， 使覆盖整个基因组的标记成为可能， 通。

10、过与 QTL 间的连锁分析， 实现 分子标记辅助选择的目标。 0005 单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism， SNP) 作为新的遗传标记已 广泛应用于基因定位、 克隆、 遗传育种及多样性的研究。SNP 是基因组中存在的一种数量非 常丰富的变异形式， 占人类基因组中遗传多态性的 90以上。SNP 与罕见的变异不同， 通常 在种群中频率等于或小于 1的此种变异被称为突变， 而只有频率大于 1时才被称为单 核苷酸多态性。 0006 目前， 主要采用几种不同的方法来发现 SNPs ： DNA 序列测定方法、 PCR-SSCP 与 DNA 测序结合法、 AS-。

11、PCR 方法、 PCR-RFLP 法、 TaqMam 技术与分子信标 (Molecular Beacons) 等。 在这些 SNP 检测技术中， (1)DNA 序列测定法是最为准确的 SNP 检测方法， 但是， 其检测费用 极其昂贵， 且需要有 DNA 测序仪等大型仪器， 同时， 在测序过程中需要非常熟练的技术人员 和经验， 所以， DNA 序列测定法不是一种应用于生产实际的理想 SNP 检测方法 ； (2)PCR-SSCP 说 明 书 CN 101705288 B2/10 页 4 与 DNA 测序结合法检测 SNP 可以适当降低检测费用， 但是， PCR-SSCP 的实验过程比较长， 操 作。

12、比较繁琐， 且实验过程中存在假阳性问题， 所以， 也并非理想的 SNP 检测手段 ； (3)AS-PCR 方法作为一种新型的 SNP 检测方法， 在未来的应用领域中具有非常广阔的前景， 但是， 该 方法需要设计特别的引物， 且只能针对特定的基因位点， 同时， 检测过程中还存在误检的概 率， 因此， 目前不具有普遍应用的特点 ； (4)TaqMam 技术与分子信标 (Molecular Beacons) 都是在荧光能量转移 (Fluorescence ResornanceEnerg Transfer， FRET) 基础上建立起来 的， 利用荧光标记及仪器达到检测目的。焦磷酸测序 (Pyroseq。

13、uencing) 则是利用测序过程 中可释放的焦磷酸和酶类产生荧光， 是不依赖平板胶或毛细管电泳、 不依赖 DNA 的荧光标 记技术， 很可能成为未来的主流技术。(5)RFLP-PCR 方法是一种检测 SNP 的有效技术， 在发 现 SNP 位点后引入限制性内切酶进行切割， 然后进行琼脂糖、 聚丙烯凝胶电泳分析， 就能准 确地鉴别SNP位点。 RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性， 又克服了费用昂贵、 繁琐 操作、 假阳性的缺点， 而且所检测的序列位点无特殊性要求。 0007 MFG-E8 作为一种糖蛋白是在乳中和哺乳动物上皮细胞中首次被发现， 是乳脂肪球 膜的另一种主要蛋白成分。。

14、MFG-E8 糖蛋白是凋亡细胞和活性吞噬细胞之间的联系分子， 在 乳腺衰退过程中， MFG-E8 在识别凋亡细胞， 激活吞噬细胞吞噬凋亡的上皮细胞方面起着重 要作用。MFG-E8 的缺失将会延迟凋亡的乳腺上皮细胞及乳脂肪球的清除， 损害乳腺的发育 和分化， 同时导致衰退受阻和乳腺炎症的发生。 在受精过程中该蛋白促使精卵的相互作用。 此外， MFG-E8 在猪乳凝集素的成熟中和精子获能中发挥作用研究发现。MFG-E8 也是一种可 以阻止肠道病原入侵和感染的重要的乳成分。 0008 目前， 对于MFG-E8基因的研究多集中在小鼠与人类的免疫方面。 关于动物MFG-E8 基因遗传变异的研究国内外也多。

15、见于小鼠与人类， 未见奶山羊 MFG-E8 基因遗传变异或 SNP 研究的报道。目前中国奶山羊 MFG-E8 基因遗传变异领域的研究匮乏， 该基因位点的功能研 究及其遗传变异与经济性状 ( 如 ： 体高、 体长、 产奶量、 奶成分等性状 ) 关联的研究仍是空 白。 发明内容 0009 本发明解决的问题在于提供一种奶山羊 MFG-E8 基因的单核苷酸多态性及其检测 方法， 利用 RFLP-PCR 方法针对其基因位点上的同义密码子突变可能导致编码蛋白表达水 平发生变化的单核苷酸多态性进行检测， 提前淘汰掉汰掉携带不良基因的个体， 加快具 有优质经济性状奶山羊种群的建立。 0010 本发明是通过以下。

16、技术方案来实现 ： 0011 奶山羊 MFG-E8 基因单核苷酸多态性的快速检测方法及其应用， 其基因单核苷酸 多态性包括 ： 0012 在奶山羊 MFG-E8 基因第 12892bp 为 C 或 T 的碱基多态性。 0013 上述奶山羊 MFG-E8 基因的单核苷酸多态性的检测方法为 ： 0014 以包含MFG-E8基因的待测奶山羊全基因组DNA为模板， 以引物对P为引物， PCR扩 增奶山羊 MFG-E8 基因 ； 用限制性内切酶 EcoRV 消化 PCR 扩增产物之后， 再对酶切后的扩增 片段进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 ； 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定奶山羊 MFG-E8 基因第 1289。

17、2bp 的单核苷酸多态性 ； 说 明 书 CN 101705288 B3/10 页 5 0015 所述的引物对 P 为 ： 0016 上游引物 ： cctactacgc acgactggat at 22 ； 0017 下游引物 ： acaaggctca aagaaactcc 20。 0018 所述的 PCR 扩增反应程序为 ： 0019 94预变性 4min， ； 94变性 30s， 56退火 30s， 72延伸 20s， 30 35 个循环 ； 72延伸 10min。 0020 所述的聚丙烯酰胺凝胶电泳为质量浓度为 10的聚丙烯酰胺凝胶电泳。 0021 所述根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果鉴定奶山。

18、羊 MFG-E8 基因第 12892 位的单核苷 酸多态性为 ： TT 基因型表现为 195bp 条带 ； TC 基因型表现为 195bp、 175bp 和 20bp 条带 ； CC 基因型表现为 175bp 和 20bp 条带 ； 其中， 单核苷酸多态性 CC 基因型为同义密码子突变。 0022 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ： 0023 本发明公开了与奶山羊泌乳性相关的功能基因 MFG-E8 的核苷酸多态性， 该核苷 酸多态性能够作为一个分子遗传标记 ； 该多态性中包含的同义密码子突变可能导致编码蛋 白表达水平发生变化， 提前淘汰掉携带不良基因的个体， 能够加快具有优质经。

19、济性状奶山 羊种群的建立。 0024 本发明利用 RFLP-PCR 方法对奶山羊 MFG-E8 基因第 12892bp 上的同义密码子突变 可能产生编码蛋白表达水平发生变化的单核苷酸多态性进行检测， 当第 12892bp 由 T 突变 为C时， 原有的编码Asp的密码子AAT发生突变为AAC， 导致在转录的mRNA在翻译过程由于 携带该氨基酸的 tRNA 丰度不同而影响翻译的效率， 从而影响该蛋白的表达量。 0025 本发明提供的奶山羊 MFG-E8 基因单核苷酸多态性检测方法， 针对第 12892bp 由 T 突变为 C 的转换突变， 通过引物设计人为的在下游引物的 3 端引入碱基错配， 当。

20、由 T 变为 C 时， PCR 扩增 MFG-E8 基因后在错配位置形成限制性内切酶 EcoRV 识别位点， 而突变没有 发生时， PCR 扩增 MFG-E8 基因后不能形成 EcoRV 识别位点 ； 通过电泳检测分型可以准确、 快 速、 方便的检测 MFG-E8 基因单核苷酸多态性 ： 不包含 195bp 条带为 CC 基因型个体 ； 不包含 175bp 条带为 TT 基因型个体 ； 同时包含 195bp 和 175bp 条带为 TC 基因型个体 ； 进而对种群 的 MFG-E8 基因 SNP 的等位基因频率变化监控。 0026 本发明对MFG-E8基因的EcoRV位点进行了基因分型和基因频。

21、率分析， 以及与莎能 奶山羊各胎年泌乳量之间进行了性状关联分析 ； 结果表明 ： EcoRV位点对三个体尺性状(体 高、 体长和胸围 ) 及四个胎次的产奶量 ( 第一胎、 第二胎、 第三胎和第四胎 ) 影响差异不显 著， 但对西农萨能奶山羊的乳脂率和总固形物有显著影响 ； 乳成分 MFG-E8 基因的核苷酸多 态位点能够成为分子遗传辅助育种的标记。 附图说明 0027 图 1 为奶山羊 MFG-E8 基因 PCR 扩增后产物的琼脂糖电泳检测结果图 ； 0028 图 2 为奶山羊 MFG-E8 基因包含突变位点的 195bp PCR 产物经 EcoRV 酶切后电泳 结果 ； 0029 图 3 为。

22、奶山羊 MFG-E8 基因 SNP 的不同基因型测序图。 具体实施方式 说 明 书 CN 101705288 B4/10 页 6 0030 本发明利用 RFLP-PCR 方法对奶山羊 MFG-E8 基因第 12892bp 同义密码子突变可能 产生编码蛋白表达水平发生变化的单核苷酸多态性进行检测， 下面结合对本发明做进一步 的详细说明， 所述是对本发明的解释而不是限定。 0031 a、 奶山羊 MFG-E8 基因含第七外显子区域 PCR 引物的设计 0032 本发明根据与奶山羊的同源动物牛的序列为参考， 具体以 NCBI 所公布的安格斯 牛 (NC 007319) 的序列为参考 ； 利用 Pri。

23、mer 5.0 设计能够扩增包含奶山羊 MFG-E8 基因第 七外显子的 PCR 引物， 其引物序列如下 ： 0033 上游引物 ： t cttttccct tcactgcctc 20 ； 0034 下游引物 ： acaa ggctca aagaaactcc 20 ； 0035 以上述引物对奶山羊基因组扩增， 能够扩增包含奶山羊 MFG-E8 基因第七外显子 12671bp 13063bp 的 397bp 的基因片段， 扩增后片段的电泳检测如图 1 所示， 其中， 泳道 1 6 为检测片段， 泳道 M 为 Marker(100bp， 200bp， 300bp， 400bp， 500bp， 60。

24、0bp) ； 测序结果 如 SEQ ID NO.1 所示， 对扩增的片段进行测序鉴定后， 发现当第 12892bp( 即 MFG-E8 基因 CDS 区第 930 位， 位于序列表的第 225 位 ) 的 T 突变为 C 时， 导致编码第 310bp 的氨基酸密 码子由 AAT 突变为 AAC， 从而形成同义突变 ； 0036 由于在 12892bp 处 (SNP 位点 ) 无自然酶切位点， 不能通过直接酶切检验， 而如果 在 12891bp 处人工设计 PCR 引物错配， 由 A 错配为 T ； 当 12892bp 由 T 突变为 C 时， 设计的引 物扩增MFG-E8基因产物的第18bp2。

25、3bp序列为GATATC， 形成了限制性内切酶EcoRV的酶 切位点， 当在 12892bp 没有突变时， 设计的引物扩增 MFG-E8 基因产物的第 18bp 23bp 序 列为GATATT， 限制性内切酶EcoRV不能识别 ； 这样就可以对该位点SNP多态性进行检测 ； 因 此设计 PCR 扩增引物 P 为 ： 0037 上游引物 ： cctactacgc acgactggat at 22 ； 0038 下游引物 ： acaaggctca aagaaactcc 20 ； 0039 其中， 引入的错配碱基为下游引物第 22bp 的 T ； 引物 P 对应扩增的基因片段是 MFG-E8 基因的。

26、 12869bp 13063bp 的 195bp 的片段， 当用限制性内切酶 EcoRV 对引物 P 对 应扩增的基因片段酶切消化时， 不能被切开或可以被切成 2 段。 0040 b、 以引物 P 进行 PCR 扩增待测奶山羊的 MFG-E8 基因片段 0041 1、 奶山羊样本采集及基因组 DNA 提取 0042 1) 奶山羊样本的采集 0043 本发明具体以 2 个中国地方奶山羊品种的种群的 688 头母羊作为检测对象， 具体 采集样本见表 1 ： 西农萨能奶山羊 (244)， 关中奶山羊 (424) ； 0044 表 1 奶山羊样本的采集 0045 说 明 书 CN 101705288 。

27、B5/10 页 7 0046 2) 血样基因组 DNA 的分离、 提取、 纯化 0047 1)冷冻血样(主要为血细胞)室温解冻， 转移1.0mL至2.0mL Eppendorf离心管， 加入等体积 PBS 液， 充分混匀， 12000r/min 离心 10min(4 )， 弃去上清液， 重复上述步骤至 上清液透明、 沉淀呈淡黄色 ； 0048 2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500L， 摇动， 使血细胞沉淀脱离离心管管壁， 37水浴 1h ； 0049 3) 加蛋白酶 K 至 3L(20mg/mL) 并混匀， 55过夜至澄清， 尚未澄清者， 可补加 1L 蛋白酶 K 混匀继续消化直至澄清 ；。

28、 0050 4) 将反应液冷却至室温， 加 Tris- 饱和酚 500L， 温和摇动离心管 20min， 使其充 分混匀 ； 4， 12000r/min 离心 10min， 将上清液转入另一 1.5mL 离心管中， 重复一次 ； 0051 5) 加氯仿 500L， 充分混匀 20min， 4， 12000r/min 离心 10min， 将上清液转入另 一 1.5mL 离心管中 ； 0052 6) 加氯仿、 异戊醇混合液 (24 1)500L， 充分混匀 20min， 4， 12000r/min 离心 10min， 将上清液转入另一 1.5mL 离心管中 ； 0053 7) 加 0.1 倍体积的。

29、 NaAc 缓冲液及 2 倍体积的冰冷的无水乙醇， 混合转动离心管， 直至白色的絮状沉淀析出， -20保存 30 60min ； 0054 8)4， 12000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 用 70冰冷乙醇漂洗 DNA 沉淀 2 次 ； 0055 9)4， 12000r/min 离心 10min， 弃去上清液， 室温下使乙醇挥发干净 ； 0056 10) 干燥后的 DNA 溶于 80 100L 的 TE 液， 4保存直至 DNA 完全溶解， 0.8琼 脂糖凝胶电泳检测其质量， -80保存。 0057 11)500L的DNA溶液中加入10SDS使其终浓度为0.1， 加入蛋白酶K至。

30、终浓 度达到 50g/mL ； 0058 12)5保温 10h 左右 ； 0059 13) 等体积苯酚、 氯仿、 异戊醇 (25 24 1) 和氯仿分别抽提一次 ； 0060 14)12000r/min 离心 5min 分相， 吸取上层水相至另一离心管中 ； 0061 15) 加入 1/10 体积 3mol/L 醋酸钠和 2 倍体积冰冷无水乙醇沉淀 DNA ； 0062 16) 倒掉液体， 70乙醇洗涤后晾干， 加入 60L 灭菌超纯水溶解， 4待检测。 0063 3)PCR 扩增 0064 PCR 反应体系采用混合加样法， 即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和 1次反应所需的PCR反应。

31、的个数， 算出各种反应组分的总量， 加入到1个1.5mL离心管中， 充 分混匀后瞬时离心， 再分装到每个 0.2mLEppendorf PCR 管中， 然后加入模板 DNA， 再瞬时离 心后进行 PCR 扩增 ； 说 明 书 CN 101705288 B6/10 页 8 0065 PCR 反应体系见表 2 ： 0066 表 2PCR 反应体系 0067 0068 PCR 反应程序 ： 0069 94预变性 4min ； 0070 0071 72延伸 10min ； 0072 对 2 个奶山羊品种的 688 个样本的基因组 DNA 进行 PCR 扩增， 获得 688 个个体的 奶山羊 MFG-E。

32、8 基因中包含该 SNP 位点的 195bp 的 DNA 片段。 0073 c、 EcoRV 酶切消化 PCR 扩增的 MFG-E8 基因片段 0074 1、 EcoRV酶切反应消化体系(2530L) ： 1015L PCR产物， 10缓冲液(含 BSA)2.5 3.0L， EcoRV(10U/L) 为 1.0 1.5L， 11.5 16.5L 灭菌纯水 (H2O) ； 0075 2、 酶切消化条件 ： 37恒温培养箱中消化 5 10h ； 0076 d、 EcoRV 消化 PCR 产物后聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 0077 1) 制作 10的聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)， 上样后 200V 电压。

33、电泳 45min， 0.01 AgNO3， 2 NaOH 显色。 0078 2)待分子量不同的DNA片段分离清晰时， 在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统 成像 ； 0079 3) 根据聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析 SNP 多态性 ： 0080 用 BIO-RAD Gel Doc 2000 凝胶成像系统照相分析， 判断 SNP 的多态性 ： 0081 MFG-E8 基因的第 12892bp 由 T 突变为 C 时， 由于引入了碱基错配， PCR 扩增的 MFG-E8 基因产物的第 18bp 23bp 序列为 GATATC， 限制性内切酶 EcoRV 识别后在 GATATC 对扩。

34、增片段酶切， 切取 20bp 的上游引物片段， 将扩增片段切为 2 段 ； 而 MFG-E8 基因的第 12892bp 没有发生突变， 限制性内切酶 EcoRV 不能识别碱基错配引入的酶切位点， 扩增片段 说 明 书 CN 101705288 B7/10 页 9 不被切开 ； 0082 由于奶山羊为 2 倍体， 所以奶山羊基因组的 MFG-E8 基因的第 12892bp 的 SNP 的多 态性的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果为 ： 0083 TT基因型表现为195bp一条带 ； TC基因型表现为195bp、 170bp和20bp三条带 ； CC 基因型表现为175bp和20bp两条带 ； 由于20bp。

35、较小， 故在聚丙烯酰胺电泳分析泳动位置超 出成像视野， 但通过195bp和175bp条带还是能够准确的鉴别TT基因型、 TC基因型和CC基 因型 ： 不包含 195bp 条带为 CC 基因型个体 ； 不包含 175bp 条带为 TT 基因型个体 ； 同时包含 195bp 和 170bp 条带为 TC 基因型个体 ； 0084 如图 2 所示， 其中， 泳道 1 不包含 175bp 条带， 其为 TT 基因型个体， 泳道 2 不包 含 195bp 条带， 为 CC 基因型个体， 包含 209bp 和 70bp 条带， 泳道 3， 泳道 4 同时包含 195bp 和 175bp 条带， 为杂合子 。

36、TC 基因型个体， 泳道 M 为 Marker I(600bp， 500bp， 400bp， 300bp， 200bp， 100bp)。 0085 4) 不同基因型个体 PCR 产物的测序验证 0086 利用 ABI 377 和 ABI 3730 测序仪对不同基因型个体 PCR 产物分别进行正反双向 测序 ； 同时， 进行 SNP 位置分析， 结果表明包含 175bp 和 195bp 条带的杂合子 TC 基因型个体 其 12892bp 的测序图的确表示为 T 或 C， 如图 3a 所示， 自左向右第 4 个峰为两个峰， 而 CC 基 因型、 TT 基因型分别为 C、 T， 如图 3b、 c 所。

37、示。 0087 e、 奶山羊 MFG-E8 基因 SNP 位点的频率统计分析 0088 1) 基因和基因型频率 0089 基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。 PAA NAA/N， 其中 PAA代表某一位点的 AA 基因型频率 ； NAA表示群体中具有 AA 基因型的个体数 ； N 为检测群体的总数量。 0090 基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。 计算的公式 可以写成 ： PA (2NAA+NAa1+NAa2+NAa3+NAa4+.+NAan)/2N 0091 式中， PA表示等位基因 A 频率， NAA表示群体中具有 AA 基因型的。

38、个体数量， NAai表 示群体中具有 Aai 基因型个体数量， a1-an 为等位基因 A 的 n 个互不相同的复等位基因。 0092 在不同奶山羊品种 MFG-E8 基因 SNP 中的 T 等位基因频率变化幅度在 54.1 57.0， C 等位基因频率变化幅度在 43.0 45.9之间， 如表 3 所示。该 SNP 位点的等 位基因频率大于 1.0， 符合动物育种中分子标记大于 5.0 10的要求， 具备群体遗传 多样性特征。 0093 表 3 奶山羊 MFG-E8 基因第 12892 位 SNP 基因频率分布表 0094 说 明 书 CN 101705288 B8/10 页 10 0095。

39、 f、 基因效应与性状的关联分析 0096 基因型数据 ： EcoRV(TT、 TC 和 CC) 0097 生产数据 ： 三个体尺数据 ( 体高、 体长和胸围 )， 四个胎次的产奶数据 ( 第一胎、 第 二胎、 第三胎和第四胎 ) 和乳成分数据。 0098 关联分析样本 ： 有体尺记录的西农和萨能奶山羊共 668 只， 有第一胎到第四胎泌 乳记录的萨能奶山羊 170 只， 有乳成分记录的萨能奶山羊 74 只， 所有奶山羊均为母羊。 0099 关联分析模型 ： 0100 利用 SPSS(13.0) 软件分析基因位点、 公畜、 产羔季节、 年龄和胎次因素与泌乳性 状的相关性。 先对数据进行描述分析。

40、， 确定是否存在离群值， 再利用最小二乘法分析对数据 校正 ； 根据数据特征， 利用多元线性模型分析基因型对性状的效应。 0101 基因型对体尺性状的效应模型为 ： 0102 Yij +Ai+Gj+eij 0103 其中 ： yij为个体表型记录 ； 为总体均值 ； Ai 为年龄的固定效应 ； Gj 为基因型的 固定效应 ； eij 为随机误差。 0104 基因型对泌乳性状的效应模型为 ： 0105 Yij +YSi+Gj+(GYS)ij+eij. 0106 其中 ： Yij为个体表型记录 ； 为总体均值 ； Ysi为产羔的季节效应 ； (GYS)ij为各 种主效应二级和二级以上互作效应 ； 。

41、eij 为随机误差。 0107 运用 SPSS(16.0) 软件对数据进行分析， 并用最小二乘法拟合线性模型， 对各基因 型间与产奶量指标进行差异显著性检验。 0108 结果表明 ： 在EcoRV可识别的SNP位点， 三种基因型对体尺及第一胎到第四胎的泌 乳量影响均不显著 (P 0.05)， 具体如表 4 所示 ； 三种基因型对乳脂率和总固形物的影响 差异显著 (P 0.05)， 具体如表 5 所示 ： CC 型优于 CT 型， CT 型优于 TT 型。说明 EcoRV 位 点可以成为一个提高奶山羊产奶量的分子遗传标记。 0109 表 4.EcoRV 识别的 SNP 位点和体尺及第一胎到第四胎。

42、的关联分析 . 0110 说 明 书 CN 101705288 B9/10 页 11 0111 表 5.EcoRV 识别的 SNP 位点与乳成分的关联分析 . 0112 0113 注 ： 具有相同字母表示差异不显著 (P 0.05)， 字母不同表示差异显著 (P 0.05)。 0114 核苷酸序列表 0115 西北农林科技大学 0116 奶山羊 MFG-E8 基因的单核苷酸多态性及其检测方法 0117 1 0118 397 0119 DNA 0120 奶山羊 (Capra hircus) 0121 0122 y 0123 (225) 说 明 书 CN 101705288 B10/10 页 12。

43、 0124 1 0125 tcttttccct tcactgcctc gctctcacgc ccccacgcgt aggctgtgga tcccagatct 60 0126 gggtgacagc cccccacccc cacctccttg ttggcaggat gcactgaacc cctaggcctg 120 0127 aaggataata ccatccccaa caagcagatc acagcctcca gctactacaa aacctggggc 180 0128 ctgagtgcct ttagctggtt tccctactac gcacgactgg ataaytgggg caagttca。

44、ac 240 0129 gcctggaccg cccagaccaa cagtgcctct gagtggctgc aggtgagtca ggctcctctg 300 0130 gggatgcagg gttggggttg ggtggggctg tgggaatcta tgaccctggc ccaaccctgg 360 0131 cctctgcttg ccaagaggga gtttctttga gccttgt 397 说 明 书 CN 101705288 B1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101705288 B2/2 页 14 图 3a 图 3b 图 3c 说 明 书 附 图 。