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1、(10)授权公告号 CN 101302480 B (45)授权公告日 2010.12.08 CN 101302480 B *CN101302480B* (21)申请号 200810061419.2 (22)申请日 2008.05.09 CCTCC NO ： M208043 2008.03.24 C12N 1/14(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12P 13/00(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (73)专利权人 浙江师范大学 地址 321004 浙江省金华市迎宾大道 688 号 (72)发明人 蒋冬花 后家衡 李杰 (74)专利代理机构 杭州。
2、丰禾专利事务所有限公 司 33214 代理人 王鹏举 (54) 发明名称 高产-氨基丁酸红色红曲霉Mr-5菌株及其 筛选方法和用途 (57) 摘要 本发明属于生物技术食品领域， 尤其涉及一 种高产 - 氨基丁酸红色红曲霉 Mr-5 菌株及其 筛选方法和用途。本发明的高产 GABA 红色红曲 霉 (Monascusruber Mr-5) 菌株， 其保藏编号为 ： CCTCC NO ： M208043， 保藏地为 ： 中国典型培养物 保藏中心。本发明另外还公开了上述的红色红曲 霉 Mr-5 菌株的筛选方法以及用途和用于 - 氨 基丁酸的合成的方法。本发明采用生物法合成 - 氨基丁酸的方法所得的发酵。
3、液中含 6 9g/L 的-氨基丁酸。 并且， 所生产的- 氨基丁酸不 存在安全上的隐患能达到食品安全级。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 黄磊 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 101302480 B1/1 页 2 1. 红色红曲霉 Mr-5 菌株， 其特征在于 ： 红色红曲霉 Mr-5 菌株 (Monascusruber Van Tieghem) 的保藏编号为 CGTCC NO ： M208043。 2. 根据权利要求 1 所述的红色红曲霉 Mr-5 菌株用于 - 氨基丁酸的合成。 3.根据权。
4、利要求1所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于-氨基丁酸合成的方法， 其特征 在于包括以下的步骤 ： a、 取红色红曲霉Mr-5菌株保存菌种， 在无菌条件下， 挑少许菌种， 转接于含PDA的培养 皿中， 活化培养 ； b、 以同样方式接入活化好的菌种到一级 PDA 培养基中， 培养一级种子 ； c、 在 PD 培养液， 接入上述的一级种子菌饼， 培养二级发酵种子 ； d、 在发酵培养基中接入上述的二级发酵种子， 进行发酵， 发酵培养基为淀粉类发酵培 养基， 淀粉类发酵培养基的固体物质按重量百分比计包括 ： 淀粉类物质 40 70， 硝酸钠 10 40， 谷氨酸钠 1 20， 硫酸锌 0.5 2， 氯。
5、化钙 0.5 2； 其中， 二级发酵种子 按体积百分比计接种量为5， 摇床培养， 转数为200r/min， 温度为35， 通气量为100L/h， 罐压为 0.03MPa， 发酵时间为 4 天 ； e、 发酵完毕， 对发酵液水浴， 离心取上清液， 可得高 GABA 含量的红曲霉发酵液。 4.根据权利要求3所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于-氨基丁酸合成的方法， 其特征 在于 ： 淀粉类发酵培养基选自谷类、 根茎类或豆类中的一种或多种。 5.根据权利要求4所述的红色红曲霉Mr-5菌株用于-氨基丁酸合成的方法， 其特征 在于 ： 淀粉类发酵培养基为小麦粉或番薯淀粉发酵培养基。 6. 根据权利要求 3 。
6、或 4 或 5 所述的红色红曲霉 Mr-5 菌株用于 - 氨基丁酸合成的方 法， 其特征在于 ： 步骤 e 中对发酵液水浴的温度为 100， 时间为 20 分钟。 权 利 要 求 书 CN 101302480 B1/4 页 3 高产-氨基丁酸红色红曲霉Mr-5菌株及其筛选方法和用 途 技术领域 0001 本发明属于生物技术食品领域， 尤其涉及一种高产 - 氨基丁酸红色红曲霉 (Monascus ruber Mr-5) 菌株及其筛选方法和用途。 背景技术 0002 - 氨基丁酸 (-aminobutyric acid， 简称 GABA) 是一种天然存在的活性氨基 酸， 是哺乳动物中枢神经系统中重。
7、要的抑制性神经递质， 具有降血压、 治疗癫病、 镇静安神、 增强记忆、 控制哮喘、 调节激素分泌、 促进生殖、 健肝利肾、 减轻更年期综合症等多种生理功 能。富含 GABA 的食品具有很好的免疫保健作用， 可以作为一种功能性食品。 0003 GABA广泛分布在动物、 植物和微生物中。 以食用植物(如茶叶、 桑叶)、 粮食(如稻 米、 米胚芽 )、 农副产品 ( 如米糠 ) 等进行 GABA 富集， 可以实现以这些原料加工的食品 GABA 强化。但是其 GABA 含量很低， 要从这些原料提取 GABA 作为食品添加剂或制成保健品非常 困难。GABA 的化学合成由于缺乏安全性， 不适宜作为食品添加。
8、剂或医用 GABA。利用食品安 全级的微生物合成法生产 GABA 是一条较理想的途径。研究表明乳酸菌、 酵母菌、 曲霉菌等 是一类被公认为安全的微生物， 基因技术的发展和微生物基因谱揭示乳酸菌、 酵母菌、 曲霉 菌等也具有 GAD 活性， 可以进行 GABA 生产。 0004 红曲霉 (Monascus spp) 是一类十分重要的药用真菌， 系中药红曲的基原菌。已经 在食品生产中长期而广泛使用， 可用于烹饪、 制作豆腐乳、 酿酒和治疗疾病等， 有降血脂、 降 血压等作用。国内已有以红曲霉为主要成分的中成药如 “血脂康” 和 “地奥脂必妥” 等上市 应用， 且疗效确切。 作为食品添加剂也是红曲霉。
9、应用的主要方向， 目前对红曲霉的研究已从 红曲色素扩展到有关降血压、 血糖、 胆固醇和抑瘤抗癌、 提高人体的免疫力等多个方面， 而 且红曲霉发酵产物本身具有较好的营养价值， 长期使用对人体有益无害。 0005 申请人在浙江师范大学学报 ( 自然科学 ) 第 30 卷第 4 期发表了 红腐乳中高 产 - 氨基丁酸红曲霉菌株的筛选 文章， 其中公开了从红腐乳中分离筛选到一株相对 高产 - 氨基丁酸 (GABA) 的红曲霉菌株 M-6， 初步鉴定该菌株为紫红曲霉 (Monascus purpureus)。对菌株 M-6 的发酵培养基和发酵条件用单因素轮换试验和正交试验进行了整 体优化， 结果表明， 。
10、菌株 M-6 转化富集 GABA 的适宜条件为 ： 以可溶性淀粉为碳源、 牛肉膏和 硝酸钠为复合氮源， 在初始pH5.0、 培养温度40、 摇床速度120r/min条件下发酵培养48h， 发酵液中 GABA 的产量最高可达 7.826g/L， 表明利用红曲霉菌株进行富含 GABA 食品的生产 是可行的。 发明内容 0006 针对现有技术中天然食品 GABA 含量较低， 现有发酵工艺中采用的红曲霉菌株 GABA 产量低等问题。本发明的一个目的是提供一种从自然环境不同场所筛选的高产 GABA 红色红曲霉 Mr-5 菌株。 说 明 书 CN 101302480 B2/4 页 4 0007 本发明的第。
11、二个目的是提供上述的高产 GABA 红色红曲霉 Mr-5 菌株的筛选方法。 0008 本发明的第三个目的是提供上述的高产GABA红色红曲霉Mr-5菌株的用途以及用 于 - 氨基丁酸合成的方法。 0009 为了实现上述的第 - 个目的， 本发明所述的高产 GABA 红色红曲霉 (Monascus ruber Mr-5) 菌株， 其保藏编号为 ： CCTCC NO ： M208043， 保藏地为 ： 中国典型培养物保藏中 心， 保藏日为 ： 2008 年 3 月 24 日。 0010 为了实现上述的第二个目的， 本发明的红色红曲霉 Mr-5 菌株筛选自红曲米。其 筛选方法如下 ： 将红曲米研磨成粉。
12、， 进行梯度稀释， 选择浓度为 10-2的稀释液涂布平板， 20 30培养， 挑取早期菌落为白色， 后期为红色或紫红色的单菌落， 连续划线分离纯 化， 得性状单一的红色红曲霉 Mr-5 菌株。 0011 为了实现上述的第三个目的， 本发明的红色红曲霉Mr-5菌株用于-氨基丁酸的 合成。上述的红色红曲霉 Mr-5 菌株用于 - 氨基丁酸合成的方法， 包括以下的步骤 ： 0012 a、 取红色红曲霉Mr-5菌株保存菌种， 在无菌条件下， 挑少许菌种， 转接于含PDA的 培养皿中， 活化培养 ； 0013 b、 以同样方式接入活化好的菌种到一级 PDA 培养基中， 培养一级种子 ； 0014 c、 。
13、在 PD 培养液， 接入上述的一级种子菌饼， 培养二级发酵种子 ； 0015 d、 在发酵培养基中接入上述的二级发酵种子， 进行发酵 ； 0016 e、 发酵完毕， 对发酵液水浴， 离心取上清液， 可得高 GABA 含量的红曲霉发酵液。 0017 作为优选， 上述的发酵培养基为淀粉类发酵培养基。发酵培养基的固体物质按重 量百分比计包括 ： 淀粉类物质 40 70， 硝酸钠 10 40， 谷氨酸钠 1 20， 硫酸锌 0.5 2， 氯化钙 0.5 2。其中， 所述的淀粉类发酵培养基可以选自谷类、 根茎类或豆 类中的一种或多种。作为再优选， 发酵培养基淀粉类发酵培养基为小麦粉或番薯淀粉发酵 培养基。
14、。 0018 作为优选， 上述的步骤 d 中二级发酵种子按体积百分比计接种量为 5， 摇床培 养， 转数为 200r/min， 温度为 35， 通气量为 100L/h， 罐压为 0.03MPa， 发酵时间为 4 天。 0019 作为优选， 上述的步骤 e 中对发酵液水浴的温度为 100， 时间为 20 分钟。 0020 本发明采用生物法合成 - 氨基丁酸是利用红色红曲霉 Mr-5 菌株体内高活性 的谷氨酸脱羧酶， 此酶以 L- 谷氨酸 (L-MSG) 为底物， 将 L- 谷氨酸 (L-MSG)- 脱羧， 产生 - 氨基丁酸和 CO2， 经过上述的方法所得的发酵液中含 6 9g/L 的 - 氨基。
15、丁酸。另外， 红曲霉制品的保健功效世人公认， 被FDA认为是GRAS(generally recognized as safe)级 食品添加剂。因此， 本发明所生产的 - 氨基丁酸不存在安全上的隐患能达到食品安全级。 附图说明 0021 图1图2为红色红曲霉Mr-5菌株MEA上培养7天菌落特征， 其中图1图为正面， 图 2 为背面。 0022 图 3 图 5 为红色红曲霉 Mr-5 菌株的形态特征。图 3 为菌丝， 图 4 为分生孢子， 图 5 为闭囊壳。 0023 图 6 为红色红曲霉 Mr-5 菌株小麦粉发酵液。 0024 图 7 为红色红曲霉 Mr-5 菌株在小麦粉和番薯粉发酵培养基中 。
16、GABA 产量的随发酵 说 明 书 CN 101302480 B3/4 页 5 时间的变化图。 具体实施方式 0025 下面结合附图对本发明具体实施方式做一个详细的说明。 0026 实施例 1 从红曲米中筛选的红色红曲霉 Mr-5 菌株 0027 采用梯度稀释分离法。将红曲米 (10mg) 研磨成粉， 进行梯度稀释 (10-1-10-4)， 选 择合适的浓度(10-2)200L涂布平板， 25培养， 挑取早期菌落为白色(约3d)， 后期为红色 或紫红色的单菌落 ( 约 5d)， 连续划线分离纯化， 得性状单一的纯红色红曲霉 Mr-5 菌株， 编 号， 4冰箱保存， 备用。用 PDA 固体斜面培。
17、养基进行菌种活化传代， 菌种每 4 周转接一次 ； 菌种使用之前需先活化。 0028 上述的红色红曲霉 Mr-5 菌株的菌落特征为麦芽汁琼脂 (MEA) 培养基上 25培养 7 天， 菌落直径 32mm， 质地较疏松， 边缘不规则， 金莺黄色 ( 附图 1， 2) ； 25 天， 直径达 70mm， 边缘有缺刻， 淡可可棕色、 气生菌丝为淡可可棕色。 0029 显微镜观察菌丝体有分枝， 有隔膜， 直径 3 8m， 含有空泡及黄色油滴 ； 菌丝 和分枝顶端产生分生孢子， 单生或成链， 梨形或球形， 大小 5 7.88.5 10.5m ； 闭 囊壳 ( 被子器 ) 红色， 圆球形， 直径 25 6。
18、0m， 具柄， 闭囊壳内散生众多子囊， 成熟后 子囊壁解体， 孢子剩留在薄壁的闭囊壳内 ； 子囊孢子卵形或椭球形， 光滑， 橙红色， 4.3 5.46.5m， 或直径 4.2 5.0m( 附图 3 5)。 0030 菌株的稳定性 ： 分别在麦芽汁琼脂培养基和土豆琼脂培养基上， 30 10 天条件 下， 经15代连续培养， 其培养特征、 形态特征和GABA产量均无明显变化， 该菌的生物性状基 本稳定。 0031 实施例 2 红色红曲霉 Mr-5 菌株用于 - 氨基丁酸合成的方法 0032 ( 一 ) 培养基 0033 PDA 培养基 ： 马铃薯 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂粉 20g， 水。
19、 1000mL， pH 5.5。 0034 PD 培养液 ： 马铃薯 200g， 葡萄糖 20g， 水 1000mL， pH 5.5。 0035 豆芽汁培养基 ： 豆芽 200g， 葡萄糖 20g， 琼脂粉 20g， 水 1000mL， pH 5.5。 0036 小麦粉发酵培养基 ： 小麦粉 50g， 硝酸钠 25g， 谷氨酸钠 5g， 硫酸锌 1g， 氯化钙 1g， 初始 pH5.5。 0037 番薯淀粉发酵培养基 ： 番薯淀粉 50g， 硝酸钠 25g， 谷氨酸钠 5g， 硫酸锌 1g， 氯化钙 1g， 初始 pH5.5。 0038 ( 二 ) 合成的方法 0039 取红色红曲霉Mr-5菌。
20、株保存菌种， 在无菌条件下(无菌室或超净工作台)， 用接种 针挑少许菌种， 转接于含 PDA 的培养皿中， 30活化培养 108 小时。以同样方式接入活化好 的菌种到一级 PDA 培养基中， 在 30培养 120 小时， 即为一级种子。250mL 三角瓶装入 50mL PD 培养液， 接入一块直径为 1cm Mr-5 菌株一级种子菌饼， 30摇床 (180r/min) 培养 4 天， 即为二级发酵种子。根据发酵规模大小， 如 3.7L 发酵罐装 2500mL 发酵培养基， 接种量 5 (V/V)， 转数 200r/min， 温度 35， 通气量 100L/h， 罐压 0.03MPa。发酵时间为。
21、 4 天。发酵完 毕， 对发酵液 ( 含红曲霉菌丝体 )100水浴 20 分钟， 离心取上清液， 可得高 GABA 含量的红 曲霉发酵液， 颜色为红色 ( 附图 6)。 说 明 书 CN 101302480 B4/4 页 6 0040 本发明中的红色红曲霉 Mr-5 菌株选育于红曲米中， 采用深层液体发酵方法， 发酵 产物与普通红曲发酵产物相比， 普通红曲液体发酵产物 GABA 含量很低， 经高效液相色谱 (HPLC) 检测为 0 2.5g/L， 按上述改进方法用 Mr-5 红曲霉菌株发酵发酵液中 GABA 含量可 达 9.5g/L( 附图 7， HPLC 检测报告编号 20074898)。 0041 综上所述， 经过红色红曲霉 Mr-5 菌株发酵， 可以产生含量较高 GABA， 筛选治疗高 血脂， 维持血压正常 ( 降低高血压或升高低血压 ) 药用成分的又一天然微生物资源。 说 明 书 CN 101302480 B1/2 页 7 图 1 图 2 图 3图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101302480 B2/2 页 8 图 6 图 7 说 明 书 附 图 。