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1、(10)授权公告号 CN 101701200 B (45)授权公告日 2011.11.09 CN 101701200 B *CN101701200B* (21)申请号 200910232710.6 (22)申请日 2009.11.27 CGMCC No.3162 2009.07.06 C12N 1/20(2006.01) C12P 13/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号 (72)发明人 徐幸莲 卢士玲 周光宏 刘登勇 舒蕊华 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200。
2、 代理人 李纪昌 (54) 发明名称 一株阴沟肠杆菌及其应用 (57) 摘要 本发明涉及保藏号为 CGMCC No.3162 的一株 阴沟肠杆菌， 菌落在 VRBDA 琼脂培养基上， 30 培养 24h， 红白色菌落， 1.0-1.50.3-0.6m， 短 杆， 革兰氏阴性， 发酵葡萄糖产酸， 该菌株在普通 显微镜下呈杆状。 应用时， 菌落接种于装有A培养 基的试管中， 37静置培养 24 小时， 反复活化五 次后， 菌液接种到 B 培养基中 37静止培养 4 天， 将菌液 10000 转离心 10 分钟， 取上清液， 获得高 浓度腐胺液， 其中， A 培养基为加入 0.1鸟氨酸 的肠细菌增菌。
3、肉汤培养基 ； B 液体培养基为加入 0.005磷酸吡哆醛 +0.1鸟氨酸的肠细菌增菌 肉汤培养基。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 董桂灵 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 101701200 B1/1 页 2 1. 一株阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)， 其特征在于 ： 保藏号为 CGMCC No.3162， 菌落在 VRBDA 琼脂培养基上， 30培养 24h， 红白色菌落， 1.0-1.50.3-0.6m， 短杆， 革兰 氏阴性， 发酵葡萄糖产酸， 该菌株在普通显。
4、微镜下呈杆状， 该菌株16S rDNA的Genbank登陆 号为 GQ890353。 2. 一株保藏号为 CGMCC No.3162 的阴沟肠杆菌的应用， 其特征在于 ： 从斜面挑取菌落 接种于装有 A 培养基的试管中， 37静置培养 24 小时， 试管中的接种量为 105cfu/ml， 在相 同培养基反复活化五次后 ； 将最后活化后的菌液接种到 B 培养基中 37静止培养 4 天， 接 种量为106cfu/ml ； 将培养后的菌液10000转离心10分钟， 取上清液， 获得高浓度腐胺液， 高 浓度腐胺液的腐胺含量为 4452.74g/ml ； 所述的 A 培养基为加入 0.1 L- 鸟氨酸的。
5、肠细菌增菌肉汤培养基 ； 所述的 B 培养基为 加入 0.005磷酸吡哆醛和 0.1 L- 鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。 3. 根据权利要求 2 所述的一株保藏号为 CGMCC No.3162 的阴沟肠杆菌的应用， 其特征 在于 ： 所述的肠细菌增菌肉汤培养基为 ： 蛋白胨10g， 葡萄糖5g， 磷酸氢二钾2g， 磷酸二氢钠 8g， 蒸馏水 1000mL， pH 值 7.2 7.4， 115灭菌 15min。 权 利 要 求 书 CN 101701200 B1/4 页 3 一株阴沟肠杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一株微生物及其应用， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 腐胺。
6、的化学名称为 1， 4- 丁二胺， 生物化学试剂和药物中间体。也是尼龙 -46、 尼 龙 -6 及尼龙 -66 的原料， 尤其是尼龙 -46 广泛用于汽车、 摩托车的零部件材料， 以代替金 属 ； 尼龙-66用于电子产品的材料 ； 酸性气体吸收剂。 目前， 制备方法有四种 ： (1)丙烯腈与 氰化氢反应， 生成乙二氰， 在催化剂作用下加氢而得 ； (2) 以吡咯为原料， 在碳酸钠存在下 与盐酸羟胺反应， 生成丁二肟， 再在钠汞齐作用下， 在无水乙醇中加热而得 ； (3) 以 2， 5- 二 氨基戊酸为原料， 加热催化脱羧而得。由此可见， 目前腐胺的生产方式能源消耗量大， 对环 境也有污染。 我。
7、国腐胺需求量大， 但国内企业生产能力和产品质量有限， 从国外进口价格很 高。 0003 通过微生物代谢产生腐胺 ( 鸟氨酸在微生物产生的鸟氨酸脱羧酶的作用下， 脱羧 产生腐胺 )， 获得高浓度腐胺液， 然后分离腐胺， 可降低腐胺的生产成本和能源消耗， 也成为 研究的主要课题。 发明内容 0004 本发明的目的在于 ： 针对目前腐胺生产存在的问题， 提供一种微生物并通过该微 生物代谢产生腐胺， 获得高浓度腐胺液。 0005 本 发 明 的 目 的 是 这 样 实 现 的 ： 一 株 阴 沟 肠 杆 菌 (Enterobacter cloacae) xlcad001， 其特征在于 ： 保藏号为 C。
8、GMCC No.3162， 菌落在 VRBDA 琼脂培养基上， 30培养 24h， 红白色菌落， 1.0-1.50.3-0.6m， 短杆， 革兰氏阴性， 发酵葡萄糖产酸， 该菌株在普 通显微镜下呈杆状， 该菌株 16S rDNA 的 Genbank 登陆号为 GQ890353。 0006 在本发明中， VRBDA 培养基为 ： 酵母浸膏 3g， 蛋白胨 7g， 胆盐 1.5g， 氯化钠 5g， 乳糖 10g， 中性红 0.03g， 结晶紫 0.002g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1000ml， PH 值 7.3-7.5。 0007 一株保藏号为 CGMCC No.3162 的阴沟肠杆菌的应用，。
9、 其特征在于 ： 从斜面挑取菌 落接种于装有 A 培养基的试管中， 37静置培养 24 小时， 试管中的接种量为 105cfu/ml。在 相同培养基反复活化五次后 ； 将最后活化后的菌液接种到 B 培养基中 37静止培养 4 天， 接种量为106cfu/ml ； 将培养后的菌液10000转离心10分钟， 取上清液， 获得高浓度腐胺液， 高浓度腐胺液的腐胺含量为 4452.74g/ml ； 0008 所述的 A 培养基为加入 0.1 L- 鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基 ； 所述的 B 液体 培养基为加入 0.005磷酸吡哆醛和 0.1 L- 鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。 0009 在本发明中，。
10、 肠细菌增菌肉汤培养基为 ： 蛋白胨 10g， 葡萄糖 5g， 磷酸氢二钾 2g， 磷 酸二氢钠 8g， 蒸馏水 1000mL， 在 115灭菌 15min， pH 值 7.2 7.4。 0010 本发明的优点在于 ： 由于阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)xlcad001 产腐胺 能力强， 在上述方法制得的培养液中， 腐胺含量可达到 4452.74g/ml， 用此方法生产腐胺 说 明 书 CN 101701200 B2/4 页 4 将极大降低生产成本和减少污染。 附图说明 0011 图 1 是阴沟肠杆菌在普通显微镜下的照片 ； 0012 图 2 是标样的高效液相色谱图 。
11、； 0013 图 3 是高效液相检测阴沟肠杆菌培养液的色谱图 ； 0014 图 4 是高效液相检测腐胺的标准曲线图。 具体实施方式 0015 实施例 1 0016 菌株的筛选和保藏 0017 培养基 0018 肠道菌增菌肉汤培养基 ： 蛋白胨10g， 葡萄糖5g， 磷酸氢二钾2g， 磷酸二氢钠8g， 蒸 馏水 1000mL， 在 115灭菌 15min， pH 值 7.2 7.4。 0019 下层培养基 ： 蛋白胨5g， 酵母膏5g， 牛肉膏5g， 氯化钠2.5g， 葡萄糖0.5g， 吐温1g， 硫酸镁 0.4g， 硫酸锰 0.03g， 磷酸氢二钾 2g， 柠檬酸三铵 2g， 碳酸钙 0.1g。
12、， 硫酸亚铁 0.04g， 维生素 B10.01g， 磷酸吡哆醛 0.05g， 琼脂 18 克， 鸟氨酸 (115灭菌 15min) ； 5 克， 1000ml 蒸 馏水， pH 5.0， 在 115高压灭菌 15 分钟 ； 0020 上层培养基 ： 溴甲酚紫 0.06g， 琼脂 20g， 1000ml 蒸馏水， pH5.0， 在 121灭菌 10min ； 0021 VRBDA 琼脂培养基为 ： 酵母浸膏 3g， 蛋白胨 7g， 胆盐 1.5g， 氯化钠 5g， 乳糖 10g， 中 性红 0.03g， 结晶紫 0.002g， 琼脂 15g， 蒸馏水 1000ml， PH 值 7.3-7.5。。
13、 0022 在无菌条件下取20克传统中式香肠， 无菌条件下剪碎后置于装有180ml已灭菌生 理盐水的三角瓶中， 室温 230 转摇床摇 10 分钟， 取 1ml 接种于肠道菌增菌肉汤培养基中， 37培养 24 小时， 取 1ml 培养液用 9ml 生理盐水逐级稀释到 10-100cfu/ml 浓度， 涂布于产 腐胺检测下层培养基上， 37培养 48 小时。缓慢倾入一薄层上层培养基， 10 分钟内结果记 录完毕， 显紫色的菌落为阳性， 显黄色为阴性， 其中， 阳性为能产生腐胺的菌株， 阴性为不能 产生腐胺的菌株。 0023 挑取阳性菌株， 在 VRBDA 固体培养基纯化三次以上， 用肠细菌增生肉。
14、汤培养基 37培养 24 小时， 离心后获得阴沟肠杆菌 (Enterobactercloacae)xlcad001 菌株。 0024 该 菌 株 的 菌 落 在 VRBDA 琼 脂 培 养 基 上， 30 培 养 24h，红 白 色 菌 落， 1.0-1.50.3-0.6m， 短杆， 革兰氏阴性， 发酵葡萄糖产酸， 该菌株在普通显微镜下呈杆 状。 0025 该菌株根据 Gen bank 比对结果， 命名阴沟肠杆菌 (Enterobactercloacae) xlcad001， 2009 年 7 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地 址为 ： 北京市朝阳区大屯路， 中。
15、国科学院微生物研究所， 邮编 100101， 菌种保藏号为 CGMCC No.3162。该菌株 16SrDNA 的 Genbank 登陆号为 GQ890353。 0026 该菌株加入无菌甘油， 在 -80冰箱保存。 0027 实施例 2 说 明 书 CN 101701200 B3/4 页 5 0028 高浓度腐胺培养液制备方法 0029 培养基 0030 肠道菌增菌肉汤培养基 ( 同实施例 1) ； 0031 制备方法 0032 从斜面挑取菌落接种于装有 A 培养基的试管中， 37静置培养 24 小时， 试管中的 接种量为105cfu/ml。 在相同培养基反复活化五次后 ； 将最后活化后的菌液。
16、接种到B培养基 中 37静止培养 4 天， 接种量为 106cfu/ml ； 将培养后的菌液 10000 转离心 10 分钟， 取上清 液， 获得高浓度腐胺液 . 0033 所述的 A 培养基为加入 0.1鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基 ； 所述的 B 液体培 养基为加入 0.005磷酸吡哆醛和 0.1鸟氨酸的肠细菌增菌肉汤培养基。 0034 实施例 3 0035 腐胺含量检测方法 ( 高效液相检测 ) 0036 1、 生物胺标准溶液的配制 0037 准确称取色胺、 苯乙胺、 酪胺、 尸胺、 腐胺、 亚精胺和精胺 50mg， 用 0.4mol/L 的高氯 酸 (HClO4) 定容至 50mL， 。
17、制成 1mg/ml 储备液备用。分别取以上标准品储备液， 用 0.4mol/L HClO4配制成终浓度分别为 5.0、 10、 20、 30、 40、 50g/ml 的标准溶液， 避光、 4冰箱保存。 0038 2、 样品溶液的衍生化 0039 取实施例 2 的样品 1mL 于 5ml 容量瓶中， 加入 200L 的 2N NaOH 使之呈碱性， 然 后加入 300L 的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲， 再加入 2ml 的丹磺酰氯 (dansyl chloride) 溶液 ( 浓度为 10mg/mL， 溶剂为丙酮 )， 然后放置于 40水浴黑暗中反应处理 40min。反应 结束后加入 100L 的氨。
18、水中止反应， 去除残留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容到 5mL。 衍生处理后用 0.22m 的有机滤膜过滤后， 获得样品溶液的衍生物。 0040 3、 标准溶液标样的衍生化 0041 分别取 5.0、 10、 20、 30、 40、 50g/ml 的标准溶液样品 1mL 于 5ml 容量瓶中， 加入 200L的2N NaOH使之呈碱性， 然后加入300L的饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲， 再加入2ml 的丹磺酰氯 (dansyl chloride) 溶液 ( 浓度为 10mg/mL， 溶剂为丙酮 )， 然后放置于 40水 浴黑暗中反应处理 40min。反应结束后加入 100L 的氨水中止反应， 去除。
19、残留的丹磺酰氯 溶液。最后用乙腈定容到 5mL。衍生处理后用 0.22m 的有机滤膜过滤后， 获得六组样品溶 液的衍生物。 0042 4、 检测方法为 ： 0043 Agilent 1100 检测系统， AgilentZORBAX XDB-C18(4.6250mm， 2， 5m)， 流速为 1mL min-1， 紫外检测波长为 254nm， 进样量 20L， 柱温 30， 流动相 A 为水， 流动相 B 为乙 腈， 采用梯度洗脱， 洗脱程序见表 1。 0044 表 1 梯度洗脱程序 说 明 书 CN 101701200 B4/4 页 6 0045 0046 在图 2 的生物胺标样的高效液相图中。
20、 ： 1 为色胺， 2 为苯乙胺， 3 为腐胺， 4 为尸胺， 5 为组胺， 6 为酪胺， 7 为亚精胺， 8 为精胺。本发明的样品溶液高效液相检测结果如图 3 所 示。由图 3 可见， 样品溶液中含有腐胺。 0047 利用上述的检测方法检测， 响应值为 24296892.9( 参见图 4)， 根据标准曲线计算 得到结果为 445.274g/mg， 但由于在检测过程中把原样稀释了 10 倍， 所以最终腐胺含量 为 4452.74ug/mg。 0048 以上各实施例不是对本发明的具体限定。 说 明 书 CN 101701200 B1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101701200 B2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 。