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新型呫吨酮化合物、其制备方法和作为药剂的用途
    简介

    本发明涉及新型呫吨酮化合物、其制备方法和作为药剂的用途。更具体地说，本发明涉及从番荔枝科植物黄花皂帽花(Dasymashalonsootepense Craib，Annonaceae)中分离新型呫吨酮天然产物sootepenseone的方法、其鉴定方法和衍生方法并涉及sootepenseone及其衍生物作为抗癌药的用途。发明领域

    癌症可能是当今世界上存在的对人类最具威胁的因素之一且全世界的科学家都在作预防和根除它的努力。

    在抗癌方面具有化疗价值的新药显然是高度重要的医学难题。而在癌症领域开发新药是一项艰巨的任务，即抗癌药必须杀伤肿瘤细胞或使其不能成活，但它们不应对正常细胞产生过度的损害。目前癌症生物学和医学化学领域还没有认可设计可以作为有效抗肿瘤药的新型分子。尽管在癌症生物学、分子药理学、药代动力学、医学化学和相关领域中已经取得了很大进展，但是在探索本领域后，其知识仍然难以理解。

    由于在近几十年过程中对恶性疾病的化疗治疗观念已经达到了极限，所以全世界的科学家已经深入研究了植物成分及其衍生物作为新型抗肿瘤抑制剂。来源于植物的重要抗癌药的实例是生物碱即长春花碱(长春碱)和长春新碱(长春新碱)，两者均分离自长春花。ShradhaSinha和Audha Jain在《药物研究进展》(Progess in Drug Research)第42卷第53-132页(1994)Basel(瑞士)中给出了有关天然产物作为抗癌药的综述。发明概述

    按照本发明，提供了一种通式I的化合物新型细胞毒性呫吨酮或其互变异构体、对映体或立体异构体或其生理上可接受的盐或其溶剂合物或其混合物：

    其中：

    R1是氢原子；甲基(-CH3)，C2-C6烷基残基、甲酰基(-CHO)；乙酰基残基(-COCH3)，-CO-C2-6-烷基，CO-C3-8-环烷基，-CO-C6-18-芳基或-CO-C7-24-芳烷基残基，各自可以带有或不带有一个或多个取代基，这些取代基选自下列基团组成的组：-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14-芳基、-N(C6-14-芳基)2、-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)、-NHCOR2、-NO2、-CN、-(CO)R3、-(CS)R4、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O-(CO)R5、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR6和-SO2R7，其中R2-R7彼此独立地代表氢原子、-C1-6-烷基、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14-芳基、-N(C6-14-芳基)2、-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基残基；

    -COO-C1-6-烷基残基，可以带有或不带有一个或多个取代基取代基，这些取代基选自下列基团组成的组：-OH、-SH、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14-芳基、-N(C6-14-芳基)2、-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)、-NHCOR8、-NO2、-CN、-(CO)R9、-(CS)R10、-F、-Cl、-Br、-I、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-O-(CO)R11、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基、-SOR12和-SO2R13，其中R8-R13彼此独立地代表氢原子、-C1-6-烷基、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14-芳基、-N(C6-14-芳基)2、-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)、-S-C1-6-烷基、-S-C6-14-芳基残基；

    -CONR14R15残基，其中R14和R15彼此独立地代表氢原子、-C1-6-烷基、-O-C1-6-烷基、-O-C6-14-芳基、-NH2、-NHC1-6-烷基、-N(C1-6-烷基)2、-NHC6-14-芳基、-N(C6-14-芳基)2、-N(C1-6-烷基)(C6-14-芳基)、-S-C1-6-烷基、-S-C1-6-芳基残基；

    或抗衡阳离子选自碱金属或碱土金属，诸如Li、Na、K、Ca、Mg、NR16R17R18R19(+)，其中R16-R19彼此独立地代表氢原子或C1-6-烷基残基；

    R2和R3形成C17＝C18-双键的部分或各自为氢。

    就上述通式I的化合物的带有二价或多价抗衡阳离子的酚盐形式而言，可以通过与生理上可接受地诸如Cl-或OH-这样的阴离子结合来补偿剩余的正电荷。

    已经给出了通式I的新型化合物，其中R1是氢原子且R2和R3形成部分C17-C18-双键，的名称为sootepensenone(1)。

    本发明的另一个方面提供了一种通式I化合物的制备方法，该方法通过从番荔枝科植物黄花皂帽花的叶中分离sootepenseone(1)且随后对其进行衍生来进行。

    本发明进一步提供了通式(I)的化合物作为药物、特别是用于治疗癌症疾病的药物的用途。

    本发明进一步提供了包括用于根据需要治疗患者的有效量的通式(I)化合物的药物制剂。将本文所用的通式(I)化合物的有效量定义为在对患者给药时抑制肿瘤细胞生长、杀伤恶性细胞、减小肿瘤体积或大小或完全消除所治疗患者体内的肿瘤的所述化合物的量。

    因此，可以使用药物上可接受的载体将本发明基本上纯的化合物配制成用于口服、局部或非肠道给药的溶瘤疗法所需的剂型。

    在一个优选的实施方案中，所述的患者是哺乳动物、特别是人。

    对患者给予的有效量一般以体表面积、体重和患者的情况为基础。动物或人的剂量的相互关系(以毫克/平方米的体表面积为基准)由Freireich，E.J.等在《癌症化疗研究》(Cancer Chemother.Rep.)50(4)219(1966)中描述。体表面积可以近似地根据患者的身高和体重来确定(例如，参见《Geigy药物科学表》(Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals)Ardly，N.Y.537-538页(1970))。优选的剂量水平还取决于值班的临床医师对患者特定癌症情况的性质和患者全身总体情况的评价。本呫吨酮化合物的有效抗肿瘤剂量在1微克/千克患者体重-约5000微克/千克患者体重(milligram)、更优选2微克/千克患者体重-约1000微克/千克患者体重的范围。正如本领域技术人员所认识到的，有效量还可以随给药途径、赋形剂的应用和与包括其它抗肿瘤药在内的治疗方法和放疗共同使用的可能性的不同而改变。

    本药物制剂可以经静脉内、肌内、经皮、皮下、腹膜内、局部或脂质体形式的静脉内给药。

    剂型的实例包括将活性剂溶于等渗盐水、5％葡萄糖或其它众所周知的药物上可接受的液体载体所得到的水溶液。可以将本领域技术人员众所周知的其它加溶剂用作转运所述活性剂的药物赋形剂。另一方面，可以以化学方式、例如通过形成药物上可接受的酚盐的方式修饰本化合物以便提高水溶性。

    还可以使用众所周知的方法将本化合物配制成用于其它给药途径的剂型。例如，可以将所述的药物组合物配制成用于口服给药的胶囊剂、凝胶密封剂或片剂的剂型。胶囊剂可以包括任意众所周知的药物上可接受的物质、诸如明胶或纤维素衍生物。可以按照常规方法、通过将所述活性剂与固体载体和本领域技术人员众所周知的润滑剂的混合物进行压制来配制片剂。固体载体的实例包括淀粉、糖、膨润土。还可以将本发明的化合物配制成例如含有乳糖或甘露糖醇作为粘合剂和常规填充剂和压片剂的硬壳片或胶囊的形式。

    在本文中将涉及动物治疗方法的术语“有效量”和“有效剂量”定义为使给药的动物体内的癌症疾病的生长减轻(remession)或抑制而不会导致不可耐受的毒性反应的那些生物碱的量。该有效量可以随给药方式、给药方案、肿瘤类型和其它相关因素的不同而改变，所有这些因素均可以改变而不会脱离本发明的范围或有效范围。一般来说，有效量可以在约0.001-100.0mg/kg体重/天的范围。

    本文所用的术语“癌症”或“肿瘤”包括但不限于肾上腺癌、成胶质细胞瘤(和其它脑部肿瘤)、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、肝癌、肺癌(小细胞和非小细胞癌)、淋巴瘤(包括非霍金奇细胞、伯基特细胞、弥散性大细胞、滤泡和弥散性霍金奇细胞)、黑素瘤(转移瘤)、成神经细胞瘤、骨原性肉瘤、卵巢癌、成视网膜细胞瘤、软组织肉瘤、睾丸肿瘤和对化疗有反应的其它肿瘤。

    从确切的描述中显然可以便利地得出本发明的其它目的和优点。发明详述

    本发明通式(I)的化合物带有五环呫吨酮环系(参见综述：Sultanbawa，M.U.S.“热带植物的类呫吨酮”(Xanthonoids oftropical plants)-《四面体》(Tetrahedron)36(1980)1465-1506)。报导下列天然化合物带有相似的环系：

    分离自藤黄的藤黄酸(2)(参见Amorosa，M.等《化学年鉴》(Ann.Chim)(Rome)，1966，56，232；Ahmad，A.S.等《化学协会杂志》(J.Chem.Soc.)(C)，1966，772(结构)；Arnone，A.等《四面体通讯》(Tetr.Lett.)1967，4201(pmr数据，结构))；藤黄素(3)分离自藤黄(参见：Rao，B.S.《化学协会杂志》(J.Chem.Soc.)，1937，853(分离)；Kartha，G.等《四面体通讯》(Tetr.Lett.)1963，459(晶体结构)；Nair，P.M.等《印度化学杂志》(Indian J.Chem.)1964，2，402(结构))；hanburin(4)分离自藤黄(参见：Asano，J.等《植物化学》(Phytochemistry)  1996，41，815(分离；uv、irpmr、cmr数据))；且分离自福氏藤黄的forbesione(5)(参见：Yuan-Wah eong，Leslie J.Harrison，Graham J.Bennett和Hugh T.-W Tan，《化学研究杂志》(J.Chem.Research)(S)1996，392-393)。

    这些化合物在C-5位上共同带有异戊二烯基侧链，有氢键键合的酚羟基。藤黄素(3)和藤黄酸(2)共同带有色烯环系。所有化合物(2)-(5)共同带有与2，2-二甲基-四氢呋喃环系稠合的二环[2.2.2]辛烯碳骨架(参见图1)。

    然而，这些化合物与本发明通式I的化合物相比显示出显著的结构差异：

    1.)C-5位上的异戊二烯基侧链被氧化成如(3)中的醛或氧化成如(2)中的羧酸；

    2.)3，4-位上的缩合二氢呋喃环如(4)中被缺失或代之以如(3)中的吡喃酮环存在于2，3-位上；

    3.)所述环系如(3)和(5)中被C-5位上的其它异戊二烯基侧链所取代。

    相反，本发明的化合物含有除2’碳上外的完全取代的与修饰的呫吨酮环系稠合的二氢呋喃环。

    就黄花皂帽花的分类学而言，参见V.H.Heywood的《世界上的开花植物》(Flowering Plants of the World)，University Press，Oxford，1978。

    本发明的化合物令人意外地表现出显著的抗肿瘤活性。此外，本化合物具有低毒性。

    因此，本发明的呫吨酮化合物是新的且具有创造性。

    将(2)-(5)的结构概括如下：

                      实施例1从黄花皂帽花(Dasymaschalon sootepense)分离sootepenseone(1；VR-3016，D-25637)

    于1994年11月在泰国北部Doitung，Chiangrai省采集植物。将叶在日光下风干(约30-35℃)3天并保存在布袋中。将干燥的粉状黄花皂帽花的叶(6.4kg)依次用己烷(110升)、氯仿(107升)和甲醇(180升)提取而分别得到204.2g、192.7g和1187.0g的相应粗提取物。将该粗提取物进一步用乙酸乙酯(12升)-水(4.35升)和正丁醇(10升)-水进行分配，从而分别得到103.6g、388.7g和401.8g的正丁醇和水级分。

    将乙酸乙酯级分(100g)进行硅胶层析(Merck no.7734，1.62kg，将该提取物预先与180g的硅胶混合)，用己烷-乙酸乙酯和乙酸乙酯-甲醇的混合物进行洗脱。合并基于TLC的级分(各300ml)而总计得到19种级分(F1-F19)。将用7-8％乙酸乙酯-己烷洗脱的级分F7(1.10g)和F8(0.84g)反复进行硅胶层析，其中使用己烷-乙酸乙酯作为洗脱溶剂。用30％乙酸乙酯-己烷洗脱的级分得到淡黄色固体，将其进一步通过径向色谱法纯化(硅胶，20％乙酸乙酯-己烷)并通过从二氯甲烷-甲醇中重结晶而得到VR-3016(0.2373g)。将母液通过HPLC(二氯甲烷)纯化、随后用相同溶剂重结晶而又得到0.1103g的VR-3016。已经根据光谱数据和单晶X射线衍射分析将该化合物鉴定为新修饰的呫吨酮衍生物，已经给予的其名称为sootepenseone 1。

    sootepenseone(1)的理化数据：m.p.192-193℃[α]28D-8.00，c＝0.075 in CHCl3元素分析：测定值：C，72.32；H，6.89.C28H32O6要求：C，72.39，H，6.94.IR，λmax CHCl3 cm-1：3560，3033，3011，2980，2932，1740，1638，1590，1470，1428，1382.UV，λmax EtOH nm(log e)：213(3.06)，263(2.18)，326(sh)(2.66)，355(2.74).质谱：m/z(70eV)464(2％)，436(100)，421(45)，367(17)，339(60)，297(40)，281(8)，241(7)，215(28)，69(90).NMR排布：1H和13C NMR(300和400Mhz，CDCl3)：参见单独的页

    图解1概括了所述的分离过程。

             sootepenseone(1)结构的表征

    根据对sootepenseone的光谱数据进行的分析揭示出了sootepenseone的本性，所述的光谱数据即红外光谱、紫外光谱、质谱且特别是1H n.m.r.和13C n.m.r.光谱。

                     表1sootepenseone(1)的1H-n.m.r.数据(δ单位，多样性)质子和排布Sootepenseone(1)    远程1H-13C-相关性      (相关的C-原子)C2-H 6.05(s)C1，C4，C9aC7-H 3.42(dd)C6，C8a，C5*，C2”C8-H 7.50(d)C4b，C6，C7C1’-H 1.40(d)C2’，C3’C2’-H 4.40(q)-C4’-H 1.18(s)C2’，C3’，C4’C5’-H 1.60(s)C2’，C3’，C4’C1”-CH2 2.27(dd)-C1”-CH2 1.37(dd)-C2”-H 2.45(d)C4b，C8a，C1”，C3”C4”-H 1.28(s)C2”，C3”C5”-H 1.73(s)C2”，C3”C1-CH2 2.58(bd)C4b，C5，C3，C4C1-CH2 2.50(dd)C4bC2-H 4.40(m)-C4-H 1.37(dd)C2，C3C5-H 1.10(dd)C2，C3C1-OH 13.10(s)C1，C2，C9a*：提示的相关性

                   表2sootepenseone(1)的13C-n.m.r.数据(δ单位，多样性)C-原子和排布Sootepenseone(1)C1 166.2(s)C2 92.6(s)C3 168.5(s)C4 113.6(d)C4a 156.0(s)C4b 90.9(s)C5 84.6(s)C6 203.6(s)C7 47.1(d)C8 134.1(d)C8a 133.7(s)C9 178.9(s)C9a 101.4(s)C1’ 13.5(q)C2’ 91.0(d)C3’ 43.2(s)C4’ 21.0(q)C5’ 23.9(q)C1” 26.0(t)C2” 49.6(d)C3” 82.9(s)C4” 28.9(q)C5” 30.7(q)C1 29.0(t)C2 117.8(d)C3 135.3(s)C4 25.5(q)C5 16.9(q)

    相对立体化学：

    已经通过单晶X射线衍射分析证实了sootepenseone(1)的相对立体化学结构。因此，其绝对构型是如下所述的立体化学结构或其相应的对映体形式：就通式(I)的sootepenseone衍生物而言，上述对sootepenseone(1)的相对立体化学结构也是正确的，但不包括那些在选择的反应条件下在C-5、C-7、C-10a、C-12和C-22的一个或多个手性中心上发生反转或外消旋化的衍生物。sootepenseone衍生物的制备

                       表3化合物号R1R2R31(Sootepen-seone)HR2和R3形成C17-C18双键的部分6乙酰基同上7药用抗衡离子*同上8C2-C20-烷基-羰基同上9甲基同上10C2-C20-烷基同上11苯甲酰基同上12被-OH和-OCH3取代的苯甲酰基同上13H HH*用于酚盐阴离子的合适抗衡离子是，例如Na+，K+，Mg++，Ca++，HN(C1-6-烷基)3+.

    可以使用sootepenseone(1)作为原料、通过对本领域技术人员来说是众所周知的有机化学标准衍生方法来完成化合物6-13的制备。

                         实施例2

           1-O-乙酰基-sootepenseone(6)的制备

    在室温下将1mg sootepensione(1)溶于1ml无水乙酐所得到的溶液搅拌1小时。在减压条件下使该溶剂在水浴中蒸发。产量：1mg的(6)、为粗残余物。

    例如，可以如Houben-Wey在Methoden der Organischen Chemie(《有机化学方法》(methods in organic chemistry))1963年第4版第6/2卷中“Sauerstoffverbindungen I(氧化合物I)、部分2”第35ff页中所述的方法和试剂制备sootepenseone(7)的盐。因此，例如可以使1当量的合适的碱与1当量的sootepenseone在适宜溶剂中反应且然后蒸发溶剂或过滤出沉淀的盐(7)。例如，合适的碱可以选自碱金属或碱土金属氢氧化物或有机胺组成的组。

    可以使用sootepenseone(1)与重氮甲烷作为原料、按照与Mustafa、Hishmat、JOCEAH在《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)22，1957，1644，1646所述类似的方法完成对OH-基团的甲基化(化合物9)。

    可以使用sootepenseone(1)作为原料、按照Houben-Wey在Methoden der Organischen Chemie(《有机化学方法》(methods inorganic chemistry))1985年第4版第E5卷中”Carbonsuren undCarbonsuren-Derivate(羧酸及其衍生物)”第691ff页中所述类似的方法和试剂完成对OH-基团的酰化(化合物6、8、11和12)。

    可以使用sootepenseone(1)作为原料、按照与标准方法类似的方法并通过使用Houben-Wey在Methoden der Organischen Chemie(《有机化学方法》(methods in organic chemistry))1965年第4版第V1/3卷中“Sauerstoffverbindungen I(氧化合物I)、部分3”第491ff页(Georg Thieme Verlag Stuttgart)中所述的标准试剂完成对C-1上OH-基团的烷基化(化合物10)。

    通过例如如Houben-Wey在Methoden der Organischen Chemie(《有机化学方法》(methods in organic chemistry))1981年第4版第IV/1c卷中“Reduktion(还原)、部分1”第15ff页(Georg ThiemeVerlag Stuttgart)中所述的标准方法可以使与C17-C17单键结合的异戊二烯基C17-C18双键氢化。生物活性：

    本发明的化合物的毒性低于标准化合物(参见表1)。另一方面，sootepenseone(1；D-25637)在中空纤维试验中比标准化合物更具活性(参见表3)。

    表1：sootepenseone的毒性(D-25637)化合物LD50(mg/kg i.p.小鼠)Sootepenseone(1；D-25637)＞100放线菌素D约1长春碱约6阿霉素约40博来霉素约80i.p.腹膜内结果讨论：

    Sootepenseone的毒性至少低于放线菌素D 100倍、低于长春碱的毒性约16倍且分别比阿霉素、博来霉素的毒性低60％和20％。

    2.体外抗肿瘤活性(XTT增殖/细胞毒性试验)

    如D.A.Scudiero等在《癌症研究》(Cancer Res.)48(1988年9月1日)4827-4833页中所述进行XTT-试验。将该过程的结果表示为与使用所述物质后的45小时后与对照组生长相比抑制50％生长的剂量。将所获得的剂量值称作ED50且将活性表示为ED50浓度≤30μg/ml。ED50浓度越低，测试物质的活性越高。将实施例1中获得的sootepenseone(1)的活性报导在下面的表2中。

                        表2化合物细胞系ED 50μg/mlSootepenseone(1；D-25637) KB 1.74 L1210 1.74 SK-OV-3 1.74 LNCAP 1.74放线菌素D KB 0.17 L1210 0.17 SK-OV-3 1.74 LNCAP 0.17阿霉素 KB 0.17 L1210 0.017 SK-OV-3 0.17 LNCAP 0.17博来霉素 KB 0.17 L1210 0.017 SK-OV-3 0.17 LNCAP 0.17长春碱 K8 0.17 L1210 0.017 SK-OV-3 0.17 LNCAP 0.17KB：口腔表皮癌L1210：小鼠淋巴白血病LNCaP：前列腺癌的淋巴瘤转移SK-OV-3：人卵巢癌MCF-7：人乳腺癌

    结果的讨论：

    D-25637对所有测试的肿瘤细胞系均具有显著的抗癌活性。

    3.sootepenseone(D-25637)的体内抗肿瘤活性(中空纤维试验)

    如Melinda G.Hollingshead等在《生命科学》(Life Sciences)1995年第57卷第2期第131-141页所述进行中空纤维试验(hollon-fiber test)。结果如表3中所示。

                             表3化合物      剂量     (mg/kg)  部位  ％抑制(细胞系) KB       MCF-7Sootepen-seone(1；D-25637)4×10 i.p.s.c.4941放线菌素D4×0.1 i.p.s.c.40-150阿霉素4×4 i.p.s.c.5241博来霉素4×8 i.p.s.c.53-67长春碱4×0.65 i.p.s.c.13-165KB：口腔表皮癌MCF-7：人乳腺癌s.c.：皮下i.p.：腹膜内

    结果的讨论：

    D-25637抗KB肿瘤细胞系的活性(49％的抑制作用)高于长春碱(13％)和放线菌素D(40％)且接近于博来霉素(53％)的活性。此外，D-25637对MCF-7细胞系表现出与阿霉素同样强的抗癌活性(41％)，而放线菌素D、博来霉素和长春碱可促进肿瘤的生长(负抑制值表明细胞生长比未治疗的对照组增加)。