用于治疗或预防眼病的 TNFα 拮抗剂和 VEGF 拮抗剂的组合 背景技术 视力损耗 （Vision loss） 已经成为发达经济的一个主要健康问题。失明或视力不 良影响着超过 300 万 40 岁以上的美国公民， 且这随着年龄显著增加。例如， 年龄为 80 岁或 以上的那些人占美国人口的约 8%， 但是尽管如此， 占失明的几乎 70%。通常与年龄有关的眼 病包括年龄相关性黄斑变性 (AMD)、 白内障、 糖尿病黄斑水肿、 视网膜静脉阻塞 (RVO) 和青 光眼。
年龄相关性黄斑变性 (AMD) 是发达国家中失明的主要原因。AMD 存在 2 个主要的 临床表现。萎缩性 ( 干燥性 )AMD 的特征在于视网膜色素上皮 (RPE) 和视神经视网膜的变 性。萎缩性 AMD 的早期与玻璃疣在 RPE 细胞层下的形成有关。早期的萎缩性 AMD 可以发展 成晚期疾病， 其中 RPE 彻底变性， 并在黄斑区域中形成边界清楚的 RPE 萎缩区域 ： “地理性萎 缩” 。在该疾病形式中， RPE 的变性导致黄斑视杆和视锥的继发性死亡， 且在这些情况下， 这 会导致严重的年龄相关的视力损耗。一部分 AMD 患者会发展， 可以视作所述疾病的不同形 式或另一种并发症。大约 10-20% 的 AMD 患者会发展脉络膜新血管生成 (CNV)。当发生时， 该疾病形式称作 “湿性 AMD” ， 且这可以与一些最严重的视力损耗相关联。在湿性 AMD 中， 新 的脉络膜血管生长穿过玻璃膜中的裂缝， 并增殖进入 RPE 和视神经视网膜中以及下面。目 前没有确定的方式用于治疗非常流行的萎缩型 AMD， 也没有确定的方式用于防止早期干燥 的 AMD 发展成地理性萎缩或湿性 AMD (Petrukhin K, Expert Opin Ther Targets (2007) 11: 625-639)。
糖尿病黄斑水肿 (DME) 是糖尿病患者的阅读视力损耗的最常见的原因。 DME 在 29 岁或以上的已经具有糖尿病的个体中的患病率是大约 30% (Klein R 等人 Ophthalmology 1984: 91; 1464-1474)。DME 与 IL-6、 VEGF 和其它细胞因子的水平的增加有关， 存在血 液 - 视网膜屏障的泛化故障， 从异常的视网膜毛细血管渗漏， 并在视网膜下空间形成微动 脉瘤。当前的 DME 治疗的目标是， 减轻水肿和渗漏， 产生提高的视敏度。良好的血糖控制 和激光光凝术或抗血管生成治疗的目标是， 防止或延迟糖尿病眼的中央黄斑区的进一步衰 退。还已经使用皮质类固醇的玻璃体内注射。
在穿过视网膜静脉的血流阻塞以后， 发生视网膜静脉阻塞。这可能是由于紧密关 联的视网膜动脉中的血块形成或压力增加 （由糖尿病、 青光眼或高血压引起） 。流出视网膜 的血流量的减少， 会导致眼血管中血压的泛化增加和眼中氧水平的降低。这又会导致异常 的血管生长、 出血和水肿、 组织损伤和视力损耗。RVO 存在 2 个主要形式 ： 视网膜分支静脉 阻塞 (BRVO) 和视网膜中央静脉阻塞 (CRVO)。 突然的视力模糊或视力损耗是 RVO 的常见特 征。 眼内的皮质类固醇已经被用于治疗 RVO， 尽管具有相关的白内障发展和眼内压升高的危 险 (Kiernan DF 等人 Exp Opinion in Pharmacotherapy 2009 10(15) 2511-2525)。 RVO 的患病率是 ~ 0.2% (CRVO) 至 ~0.7% (BRVO)。
葡萄膜炎主要影响工作年龄的人， 且包括葡萄膜 ( 虹膜、 睫状体和脉络膜 ) 的炎 症。前葡萄膜炎是葡萄膜炎的最常见形式， 占葡萄膜炎病例的约 75%， 它主要影响虹膜和睫 状体。葡萄膜炎被视作一种自身免疫病， 并且病原学仍然未知。在约 50% 的病例中， 存在与
HLA-B27 的关联。涉及后葡萄膜 ( 即脉络膜 ) 的炎症被称作后葡萄膜炎， 且视网膜的继发 累及是常见的。葡萄膜炎主要是， CD4 T- 细胞浸润进眼隔室中的炎性疾病 (Paroli MP 等 人 2007 17(6) 938-942 Eur J Ophthalmology)。皮质类固醇仍然是治疗的主要药物， 局 部地眼周地或全身地给药。
TNF-α ( 肿瘤坏死因子 -α) 是一种促炎细胞因子， 其已经与许多眼炎症相关联 (Theodossiadis 等人 , Am. J. Ophthalmol. (2009) 147: 825-830)。
已知 VEGF ( 血管内皮生长因子 ) 和 VEGF- 受体会刺激脉络膜血管和视网膜血管 的血管生成， 并调节这些血管的血管渗透性 (Gragoudas 等人 , N. Engl. J. Med (2004) 351: 2805)。
新生血管形成和渗漏是湿形式的年龄相关性黄斑变性的突出特征。 现在已经批准 TM 使用适体培加尼布 (Macugen ， 其中和 VEGF-A 亚型 165) 和 ranibizumab (LucentisTM， 其 阻断 VEGF-A 的所有亚型 )。
炎症应答也在新生血管形成中起重要的病理生理学作用 (Sakuri 等人 , Invest Ophthalmol Vis Sci (2003) 44: 5349-5354; Oh 等 人 Invest Ophthalmol Vis Sci (1999) 40: 1891-1898;Shi 等人 , Exp Eye Res (2006) 83: 1325-1334。
与 TNFα 拮抗剂有关的参考文献包括 ： Olson 等人 , Arch Opthalmol (2007) 125: 1221-1224; Shi 等人 , Exp Eye Res (2006) 83: 1325-1334Kociok 等人 , Invest Ophthalmol Vis Sci (2006) 11: 5057-5065Markomichelakis 等 人 Am J Ophthalmol (2005) 139: 537-540。
研究表明， 英夫利昔单抗的玻璃体内注射可能引起严重的眼内炎症反应， 所述 炎症反应表现为剂量相关的。使用阿达木单抗没有观察到这种不利事件 ( 计划 4247, 海报 D913, 用于治疗顽固性糖尿病黄斑水肿的玻璃体内的 TNF 抑制剂 ： 来自泛美共 同视网膜研究组的一项初步研究 （Intravitreal TNF inhibitors in the Treatment of Refractory Diabetic Macular Edema: A Pilot Study from the Pan American Collaborative Retina Study Group） ， 和计划 4749, 海报 D1087, 玻璃体内的 TNF 抑制剂 的眼的和全身的安全性 ： 来自泛美共同视网膜研究组、 视力和眼科学研究协会 (ARVO) 的一 项初步研究 （Ocular and Systemic Safety of Intravitreal TNF Inhibitors: A Pilot Study From the Pan American Collaborative Retina Study Group, The Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO)） ， 2010 年 5 月 2-6 日 . Ft. Lauderdale USA)。
需要可有效地预防眼疾病进展并为更广泛的患者群体提供改善的视力的治疗方 案。 发明内容 本发明涉及 TNFα 拮抗剂和 VEGF 拮抗剂的组合， 具体地， 所述组合用于治疗眼病。
抗 -VEGF 方案和抗 -TNF 方案都具有治疗 AMD 的基础， 这些模态在机理上可能不重 叠， 所以对抗 -VEGF 方案疗法没有成功地做出应答的患者可能对抗 -TNF 治疗做出应答， 反 之亦然。
与抗 -VEGF 分子的抗 - 血管生成活性相组合的抗 -TNF 的抗炎益处， 会在治疗这样
的眼病中提供提高的效能。
本发明涵盖了施用单独的 TNFα 拮抗剂和单独的 VEGF 拮抗剂的组合 ( 即分开的 TNFα 和 VEGF 拮抗剂分子 )。另外， 本发明涵盖了施用具有双靶向功能性的单个构建体， 所 述构建体起 TNFα 拮抗剂和 VEGF 拮抗剂的作用 ( 即能够结合和抑制、 优选地阻断 TNFα 或 TNFα 受体的功能， 并结合和抑制、 优选地阻断 VEGF 或 VEGF 受体的功能 )。单个构建体可 以基于抗体骨架或其它这样的合适的骨架。受体 -Fc 融合体也被视作本发明的一部分。
本发明具体地涉及抗原结合蛋白。
具体地， 本发明涉及 TNFα/VEGF 双靶向单个构建体， 其中所述 TNFα 拮抗剂部分 是或源自人抗 -TNFα 抗体。所述 TNFα 抗体可以是阿达木单抗或戈利木单抗。
本发明具体地涉及用于治疗眼病的抗原结合蛋白， 其包含与一个或多个表位 - 结 合域相连的蛋白骨架， 其中所述抗原结合蛋白具有至少 2 个抗原结合位点， 其中的至少一 个是来自表位结合域， 且其中的至少一个是来自成对的 VH/VL 结构域， 且其中至少一个抗 原结合位点能够结合 TNFα 或 TNFα 受体例如 TNFR1， 且至少一个抗原结合位点能够结合 VEGF 或 VEGF 受体例如 VEGFR2。
与一个或多个表位 - 结合域相连的受体 -Fc 融合体也是本发明的一部分， 例如与 VEGF 或 VEGF 受体 - 结合域相连的 TNFα 受体 -Fc 融合体， 或与 TNFα 或 TNFα 受体 - 结合 域相连的 VEGF 受体 -Fc 融合体。 本发明提供了一种双靶向抗原结合分子， 其包含 TNFα 拮抗剂部分、 VEGF 拮抗剂 部分以及使所述 TNFα 拮抗剂部分与所述 VEGF 拮抗剂部分相连的连接物， 其中所述 TNFα 拮抗剂部分包含在表 1 中列出的任一种 TNFα 拮抗剂的氨基酸序列 ； 所述 VEGF 拮抗剂部分 包含在表 2 中列出的任一种 VEGF 拮抗剂的氨基酸序列 ； 所述连接物是长度为 1–150 个氨 基酸的氨基酸序列 ； 且所述双靶向分子不是 DMS4000 或 DMS4031。连接物也可以是基于非 肽的连接物， 包括， 例如， 聚乙二醇 (PEG) 和基于 PEG 的连接物。
本发明也提供了一种编码本发明的抗原结合蛋白的多核苷酸序列， 例如编码本文 所述的任意抗原结合蛋白的重链的多核苷酸序列， 和编码本文所述的任意抗原结合蛋白的 轻链的多核苷酸。这样的多核苷酸代表与等效多肽序列相对应的编码序列。但是， 应该理 解， 可以将这样的多核苷酸序列与起始密码子、 适当的信号序列和终止密码子一起克隆进 表达载体中。
本发明也提供了一种转化的或转染的重组宿主细胞， 其包含一个或多个编码本发 明的抗原结合蛋白 （例如本文所述抗原结合蛋白的重链和轻链） 的多核苷酸。
本发明另外提供了一种用于生产本文所述的任意抗原结合蛋白的方法， 所述方法 包括下述步骤 ： 在合适的培养基 （例如无血清的培养基） 中培养宿主细胞， 所述宿主细胞包 含至少一种含有编码本发明的抗原结合蛋白的多核苷酸的载体， 例如第一载体和第二载 体， 所述第一载体包含编码本文所述的抗原结合蛋白的重链的多核苷酸， 且所述第二载体 包含编码本文所述的抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸。
本发明提供了一种适合全身递送或向眼局部递送的药物组合物， 其包含本文所述 的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可以另外包含其它的活性 剂。
本发明提供了一种用于预防或治疗眼病的选自下述的 TNFα 拮抗剂 ： 阿达木单
抗、 英夫利昔单抗、 依那西普、 ESBA105、 PEP1-5-19、 PEP1-5-490、 PEP1-5-493、 SEQ ID NO:2 的 adnectin、 戈利木单抗、 塞妥珠单抗、 ALK-6931 以及包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 其中所述 TNFα 拮抗剂将与选自下述的 VEGF 拮抗剂组合施用 ： 贝伐单抗、 ranibizumab、 r84、 aflibercept、 CT01、 DOM15-10-11、 DOM15-26-593、 PRS-050、 PRS-051、 MP0012、 CT-322、 ESBA903、 EPI-0030、 EPI-0010 和 DMS1571。
本发明也提供了一种用于预防或治疗眼病的选自下述的 VEGF 拮抗剂 ： 贝伐单抗、 ranibizumab、 r84、 aflibercept、 CT01、 DOM15-10-11、 DOM15-26-593、 PRS-050、 PRS-051、 MP0012、 CT-322、 ESBA903、 EPI-0030、 EPI-0010 和 DMS1571， 其 中 所 述 VEGF 拮 抗 剂 将 与 选自下述的 TNFα 拮抗剂组合施用 ： 阿达木单抗、 英夫利昔单抗、 依那西普、 ESBA105、 PEP1-5-19、 PEP1-5-490、 PEP1-5-493、 SEQ ID NO:2 的 adnectin、 戈利木单抗、 塞妥珠单抗、 ALK-6931 以及包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体。
本发明也提供了一种双靶向抗原结合分子， 其包含 TNFα 拮抗剂部分、 VEGF 拮抗 剂部分以及使所述 TNFα 拮抗剂部分与所述 VEGF 拮抗剂部分相连的连接物， 其中 ： 所述 TNFα 拮抗剂部分包含在表 1 中列出的任一种 TNFα 拮抗剂的氨基酸序列 ； 所述 VEGF 拮抗剂部分包含在表 2 中列出的任一种 VEGF 拮抗剂的氨基酸序列 ； 所述连接物是长度为 1–150 个氨基酸的氨基酸序列 ； 且 所述双靶向分子不是 DMS4000 或 DMS4031。
本发明也提供了一种双靶向抗原结合分子， 其包含 TNFα 拮抗剂部分、 VEGF 拮抗 剂部分以及使所述 TNFα 拮抗剂部分与所述 VEGF 拮抗剂部分相连的连接物， 其中 ： 所述 TNFα 拮抗剂部分包含在表 1 中列出的任一种 TNFα 拮抗剂的氨基酸序列 ； 所述 VEGF 拮抗剂部分包含在表 2 中列出的任一种 VEGF 拮抗剂的氨基酸序列 ； 所述连接物是长度为 1–150 个氨基酸的氨基酸序列 ； 且其中所述双靶向抗原结合分 子是用于预防或治疗眼病， 且每 4-6 周玻璃体内地给药。
本发明也提供了一种抗原结合蛋白， 其包含 SEQ ID NO:69、 70、 71 或 72 的重链序 列和 SEQ ID NO:12 的轻链序列。
也提供了一种预防或治疗遭受眼病的患者的方法， 所述方法包括 ： 全身地或局部 地向患者的眼施用预防或治疗有效量的本文公开的组合物或双靶向蛋白。 附图说明 图 1 显示了抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAb-dAb DMS4000 的 SDS-PAGE 分析。
图 2 显示了抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAb-dAb DMS4000 的尺寸排阻色谱曲线。
图 3 显示了 DMS4000 的抗 -VEGF 活性。
图 4 显示了 DMS4000 的抗 -TNFα 活性。
图 5 显示了 DMS4000 的药代动力学 (PK) 性质。
图 6 显示了 ELISA 的结果， 并证实了双特异性的 BPC1821 会结合 VEGFR2 和 B7-1。
图 7 显示了 ELISA 的结果， 并证实了双特异性的 BPC1825 显示出与 VEGF 和 B7-1 的结合。
图 8 描述了用于构建本发明的双靶向抗原结合分子的矩阵。
图 9 显示了 PEP-DOM 构建体的 BIAcore 分析。
图 10 显示了 PEP-DOM 构建体的 BIAcore 分析 ( 图 9 结合曲线的 TNF/VEGF 结合 区的放大图 )。
图 11 是表 10 所示数据的图解表示。以 2µl 的体积， 通过玻璃体内注射， 施用所有 化合物。黑色条表示第 7 天的结果。白色条表示第 14 天的结果。
图 12 是表 11 所示数据的图解表示。以 2µl 的体积， 通过玻璃体内注射， 施用所有 化合物。黑色条表示第 7 天的结果。白色条表示第 14 天的结果。
图 13 显示了在激光 PC 以后 7 天 ( 第 1 次 FS) 和 14 天 ( 第 2 次 FS) 时的红外 (IR， 左上图 )、 自发荧光 (AF， 左下图 ) 和荧光素血管造影术 (FS， 大图 )——显示了实施例 图像。1. 媒介物治疗的眼， 2. 用 2µg DMS1571 治疗的眼， 8. 用 30µg EnbrelTM 治疗的眼。 值得注意的是，CNV 损伤显得比与 DMS1571 治疗相对应的损伤更突出和弥散性更低。
图 14 是表 12 所示数据的图解表示。以 2µl 的体积， 通过玻璃体内注射， 施用所有 化合物。
图 15 显示了用 ED1 单抗 （mab） 染色的平坦固定的视网膜的实施例显微照片。图 1A-1B 和图 Enbrel 8.4 显示了来自用抗 -VEGF (DMS1571) (1A)、 仅媒介物 (1B) 或 Enbrel (Enbrel 8.4) 处理过的眼的视网膜的平坦固定。用 ED1 (CD 68， 黑色 ) X20 显影与激光烧 伤部位有关的巨噬细胞。图 1D 显示了视网膜的恒冷箱切片 (20µm)， 它显示了已经渗入视 网膜的内核层 (INL) 中的与激光烧伤部位有关的巨噬细胞 (ED1+， 黑色 )。 RGC， 视网膜神经 节细胞层 ； BV， 血管。x20。 定义 本文使用的术语 ‘蛋白骨架’包括、 但不限于免疫球蛋白 (Ig) 骨架， 例如 IgG 骨架， 其 可以是 4 链或 2 链抗体， 或者其可以仅包含抗体的 Fc 区， 或者其可以包含一个或多个抗体 恒定区， 所述恒定区可以属于人或灵长类动物来源， 或者其可以是人和灵长类动物恒定区 的人工嵌合体。 除了一个或多个恒定区以外， 这样的蛋白骨架可以包含抗原结合位点， 例如 其中所述蛋白骨架包含完整的 IgG。 这样的蛋白骨架将能够与其它蛋白结构域相连， 例如具 有抗原结合位点的蛋白结构域， 例如表位 - 结合域或 ScFv 结构域。
本文使用的术语 ‘受体 -Fc 融合体’ 表示， 与抗体的 Fc 区相连的受体或细胞表面蛋 白的可溶性配体或胞外结构域。 在该定义内包括受体或细胞表面蛋白的这种可溶性配体或 胞外结构域的片段， 只要它们保留全长蛋白的生物学功能， 即只要它们保留抗原结合能力。 “结构域” 是折叠的蛋白结构， 其具有独立于蛋白的其余部分的三级结构。通常， 结构域负责 蛋白的离散的功能性质， 并且在许多情况下， 可以添加、 去除或转移给其它蛋白， 而不丧失 该蛋白的其余部分和 / 或该结构域的功能。 “抗体单个可变结构域”是折叠的多肽结构域， 其包含抗体可变结构域特有的序列。因此， 它包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结 构域 ( 例如， 其中一个或多个环已经被不是抗体可变结构域特有的序列所置换 )， 或者已被 截短或包含 N- 端或 C- 端延伸的抗体可变结构域， 以及至少保留全长结构域的结合活性和 特异性的可变结构域的折叠片段。
“人源化的抗体” 表示一类工程化的抗体， 其具有源自非人供体免疫球蛋白的 CDR， 该分子的其余的免疫球蛋白 - 衍生的部分源自一种或多种人免疫球蛋白。此外， 框架支持 残基可以被改变， 以保持结合亲和力 ( 参见， 例如， Queen 等人 Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson 等人 Bio/Technology, 9:421 (1991))。 合适的人接受
体抗体可以是选自常规数据库的一种 （通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性） ， 所述常规数据库例如 KABAT® 数据库、 Los Alamos 数据库和 Swiss 蛋白数据库。特征在于 与供体抗体的框架区的同源性 （在氨基酸的基础上） 的人抗体， 可以适合提供重链恒定区和 / 或重链可变框架区， 用于插入供体 CDR。以类似的方式， 可以选择能够供给轻链恒定或可 变框架区的合适的接受体抗体。应当指出， 接受体抗体重链和轻链不需要源自相同的接受 体抗体。现有技术描述了生产这样的人源化抗体的几种方法， 参见例如 EP-A-0239400 和 EP-A-054951。在一个实施方案中， 本发明的抗体是人源化的抗体。
“CDR” 被定义为抗原结合蛋白的互补性决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重 链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中， 存在 3 个重链和 3 个轻链 CDR ( 或 CDR 区 )。因而， 本文使用的 “CDR” 表示所有 3 个重链 CDR、 所有 3 个轻链 CDR、 所有重链和轻链 CDR 或至少 2 个 CDR。
“CDR 变体” 包括被至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列， 其中所述修饰可以是氨基 酸序列的化学改变或部分改变 ( 例如改变了不超过 10 个氨基酸 )， 所述修饰允许变体保留 未修饰的序列的生物学特征。例如， 所述变体是结合和中和 IL-18 的功能变体。CDR 氨基酸 序列的部分改变可以是 ： 删除或置换 1 个至几个氨基酸， 或添加或插入 1 个至几个氨基酸， 或它们的组合 ( 例如改变了不超过 10 个氨基酸 )。所述 CDR 变体可以在氨基酸序列中含 有 1、 2、 3、 4、 5 或 6 个氨基酸置换、 添加或删除的任意组合。所述 CDR 变体或结合单位变体 可以在氨基酸序列中含有 1、 2 或 3 个氨基酸置换、 插入或删除的任意组合。氨基酸残基的 置换可以是保守置换， 例如， 用一个疏水氨基酸置换一个被替代的疏水氨基酸。 例如可以用 缬氨酸或异亮氨酸置换亮氨酸。
术语 “人抗体” 表示源自人免疫球蛋白基因序列的抗体。这些全人抗体会提供重 新工程化的或去免疫的啮齿动物单克隆抗体的替代品 ( 例如人源化的抗体 )， 作为低免疫 原性治疗抗体的来源， 且它们通常使用噬菌体展示或转基因小鼠平台来制备。在一个实施 方案中， 本发明的抗体是人抗体。
短语 “免疫球蛋白单个可变结构域” 表示抗体可变结构域 (VH、 VHH、 VL) ： 其独立于 不同的 V 区或结构域而特异性地结合抗原或表位。免疫球蛋白单个可变结构域可以以含 有其它不同的可变区或可变结构域的形式 ( 例如， 同源多聚体或异源多聚体 ) 存在， 其中 其它区域或结构域不是单个免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所必需的 ( 即其中免疫球 蛋白单个可变结构域与抗原的结合独立于另外的可变结构域 )。 “结构域抗体” 或 “dAb” 与 “免疫球蛋白单个可变结构域” 同义， 后者作为本文所用的术语， 能够结合抗原。免疫球蛋 白单个可变结构域可以是人抗体可变结构域， 但是也包括来自其它物种的单个抗体可变结 构域， 诸如啮齿动物 ( 例如， 如在 WO 00/29004 中所公开的 )、 铰口鲨和骆驼类 (Camelid ) VHHdAb。 骆驼类 VHH 是这样的免疫球蛋白单个可变结构域多肽 ： 其源自包括骆驼、 骆马、 羊驼、 单峰骆驼和原驼在内的物种， 且生产天然地缺少轻链的重链抗体。根据本领域可利用的标 准技术， 可以人源化这样的 VHH 结构域， 且这样的结构域仍然被视作根据本发明的 “结构域 抗体” 。本文使用的 “VH” 包括骆驼类 VHH 结构域。NARV 是在包括铰口鲨在内的软骨鱼中鉴 别出的另一类免疫球蛋白单个可变结构域。 这些结构域也称作新颖的抗原受体可变区 ( 通 常缩写为 V(NAR) 或 NARV)。关于其它细节， 参见 Mol. Immunol. (2006) 44: 656-665 和 US20050043519A。术语 “表位 - 结合域” 表示这样的结构域 ： 其独立于不同的 V 区或结构域而特异 性地结合抗原或表位， 这可以是结构域抗体 (dAb)， 例如人、 骆驼类或鲨鱼免疫球蛋白单 个可变结构域， 或它可以是作为选自下述的骨架的衍生物的结构域 ： CTLA-4 (Evibody) ； 脂质运载蛋白 ； 蛋白 A 衍生出的分子诸如蛋白 A( 亲和体、 SpA) 的 Z- 结构域、 A- 结构 域 (Avimer/Maxibody) ； 热休克蛋白诸如 GroEl 和 GroES ； 转铁蛋白 ( 反体 ) ； 锚蛋白重 复蛋白 (DARPin) ； 肽适体 ； C- 型凝集素结构域 ( 四连接素 ) ； 人 γ- 晶体蛋白和人泛 素 (affilins) ； PDZ 结构域 ； 人蛋白酶抑制剂的全蝎毒素 kunitz 型结构域 ； 和纤连蛋白 (adnectin) ； 其已经进行蛋白工程化， 以便实现与除了天然配体以外的配体的结合。
CTLA-4 ( 细胞毒性的 T 淋巴细胞 - 相关的抗原 4) 是主要在 CD4+ T- 细胞上表达 的 CD28- 家族受体。它的胞外结构域具有可变结构域 - 样 Ig 折叠。可以用异源序列置换 与抗体的 CDR 相对应的环， 以赋予不同的结合性质。被工程化成具有不同的结合特异性的 CTLA-4 分子也称作 Evibodies。关于其它细节， 参见 Journal of Immunological Methods (2001) 248 (1-2): 31-45。
脂质运载蛋白是运输小疏水分子 （诸如类固醇、 后胆色素、 类视色素和脂质） 的胞 外蛋白家族。它们具有刚性的 β- 折叠二级结构， 该结构在圆锥形结构的开放末端处具有 许多环， 它们可以被工程化成结合不同的靶抗原。Anticalin 的长度是 160-180 个氨基酸， 且源自脂质运载蛋白。 关于其它细节， 参见 Biochim Biophys Acta (2000) 1482: 337-350, US7250297B1 和 US20070224633。 亲和体是源自金黄色葡萄球菌的蛋白 A 的骨架， 其可以被工程化成结合抗原。该 结构域由大约 58 个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化， 已经制备了文库。关 于其它细节， 参见 Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17: 455-462 和 EP1641818A1。
Avimer 是源自 A- 结构域骨架家族的多结构域蛋白。大约 35 个氨基酸的天然 结构域采取确定的二硫键连接的结构。通过 A- 结构域家族表现出的天然变体的重排 （shuffling） ， 产生多样性。关于其它细节， 参见 Nature Biotechnology (2205) 23(12): 1556 - 1561 和 Expert Opinion on Investigational Drugs (June 2007) 16(6): 909-917。
转铁蛋白是单体的血清运输糖蛋白。通过将肽序列插入允许的表面环中， 可 以将转铁蛋白工程化成结合不同的靶抗原。工程化的转铁蛋白骨架的实例包括反体 (Trans-body)。关于其它细节， 参见 J. Biol. Chem (1999) 274: 24066-24073。
设计的锚蛋白重复蛋白 (DARPins) 源自锚蛋白， 所述锚蛋白是介导完整的膜蛋白 与细胞骨架的连接的蛋白家族。单个锚蛋白重复是由 2 个 α- 螺旋和 1 个 β- 转角组成 的 33 残基基序。通过将每个重复的第一个 α- 螺旋和 β- 转角中的残基随机化， 可以将 它们工程化成结合不同的靶抗原。通过增加模块的数目， 可以增加它们的结合界面 ( 亲和 力成熟方法 )。关于其它细节， 参见 J. Mol. Biol. (2003) 332: 489-503; PNAS (2003) 100(4): 1700-1705; 和 J. Mol. Biol. (2007) 369: 1015-1028 和 US20040132028A1。
纤连蛋白是可以被工程化成结合抗原的骨架。Adnectin 由人纤连蛋白 III 型 (FN3) 的 15 个重复单位的第 10 个结构域的天然氨基酸序列主链组成。 可以工程化在 β- 夹 心的一个末端处的 3 个环， 以使 Adnectin 能够特异性地识别目标治疗靶物。关于其它细 节， 参见 Protein Eng. Des. Sel. (2005) 18: 435-444、 US20080139791、 WO2005056764 和
US6818418B1。
肽适体是组合的识别分子， 其由恒定的骨架蛋白组成， 所述骨架蛋白通常是含有 插入在活性部位处的受限可变肽环的硫氧还蛋白 (TrxA)。关于其它细节， 参见 Expert Opin. Biol. Ther. (2005) 5: 783-797。
微体源自长度为 25-50 个氨基酸的天然存在的微蛋白， 所述微蛋白含有 3-4 个半 胱氨酸桥， 微蛋白的实例包括 KalataB1 和芋螺毒素和 knottins。所述微蛋白具有一个环， 该环可以被工程化成包含最多 25 个氨基酸， 而不影响微蛋白的总体折叠。关于工程化的 knottin 结构域的其它细节， 参见 WO2008098796。
其它表位结合域包括这样的蛋白 ： 所述蛋白已经被用作骨架， 以工程化不同的靶 抗原结合性质， 包括人 γ- 晶体蛋白和人泛素 (affilins)、 人蛋白酶抑制剂的 kunitz 类型 结构域、 Ras- 结合蛋白 AF-6 的 PDZ- 结构域、 全蝎毒素 ( 蝎毒素 )、 C- 型凝集素结构域 ( 四 连接素 )， 综述参见 ： Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, Stefan Dubel 编 ) 中 的第 7 章 – Non-Antibody Scaffolds， 和 Protein Science (2006) 15:14-27。 本发明的 表位结合域可以源自这些替代性的蛋白结构域中的任一种。
“双 可 变 结 构 域 免 疫 球 蛋 白 (DVD-Ig)”是 双 特 异 性 的、 四价的免疫球蛋白 G (IgG)- 样分子 (Wu 等人 Nature Biotechnology (2007) 25: 1290-1297)。可以将 DVD-Ig 定义为包含多肽链的结合蛋白， 其中所述多肽链包含 VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n， 其中 VD1 是 第一可变结构域， VD2 是第二可变结构域， C 是恒定结构域， X1 代表氨基酸或多肽 ( 连接 物 )， X2 代表 Fc 区， 且 n 是 0 或 1 (WO 2007024715)。在本发明的上下文中， VDI 会结合 TNFα 或 TNFα 受体， 且 VD2 会结合 VEGF 或 VEGF 受体， 或反之亦然。
本文使用的术语 “成对的 VH 结构域” 、 “成对的 VL 结构域” 和 “成对的 VH/VL 结构域” 表示， 当与它们的配偶体可变结构域成对时， 仅特异性地结合抗原的抗体可变结构域。 在任 一对中， 总是存在一个 VH 和一个 VL， 术语 “成对的 VH 结构域” 表示 VH 配偶体， 术语 “成对的 VL 结构域” 表示 VL 配偶体， 且术语 “成对的 VH/VL 结构域” 表示在一起的 2 个结构域。
本文使用的术语 “抗原结合蛋白” 表示能够结合 TNFα 和 / 或 VEGF 的抗体、 抗体 片段， 例如结构域抗体 (dAb)、 ScFv、 FAb、 FAb2 和其它蛋白构建体， 诸如受体 -Fc 融合体。 抗原结合分子可以包含至少一个 Ig 可变结构域， 例如抗体、 结构域抗体、 多个结构域抗体 例如哑铃状体、 dAb-dAb 线内融合体、 Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fv、 ScFv、 双特异抗体、 mAbdAb、 DVD-Ig、 亲和体、 异源缀合物抗体或双特异性体， 包括具有对 TNFα 或 TNFα 受体的第一特 异性和对 VEGF 或 VEGF 受体的第二特异性的双特异性抗体。在一个实施方案中， 所述抗原 结合分子是抗体。在另一个实施方案中， 所述抗原结合分子是 dAb， 即免疫球蛋白单个可变 结构域， 诸如 VH、 VHH 或 VL， 其独立于不同的 V 区或结构域特异性地结合抗原或表位。抗原 结合分子可以能够结合 2 种靶物， 即它们可以是双靶向蛋白。抗原结合分子可以是抗体和 抗原结合片段的组合， 例如， 与单克隆抗体相连的一个或多个结构域抗体和 / 或一个或多 个 ScFv。抗原结合分子也可以包含非 -Ig 结构域， 例如作为选自下述的骨架的衍生物的结 构域 ： CTLA-4 (Evibody) ； 脂质运载蛋白 ； 蛋白 A 衍生的分子诸如蛋白 A ( 亲和体、 SpA) 的 Z- 结构域、 A- 结构域 (Avimer/Maxibody) ； 热休克蛋白诸如 GroEl 和 GroES ； 转铁蛋白 ( 反 体)； 锚蛋白重复蛋白 (DARPin) ； 肽适体 ； C- 型凝集素结构域 ( 四连接素 ) ； 人 γ- 晶体蛋 白和人泛素 (affilins) ； PDZ 结构域 ； 人蛋白酶抑制剂的全蝎毒素 kunitz 类型结构域 ； 和纤连蛋白 (adnectin) ； 它们已经就那些蛋白工程化， 以便实现与 TNFα 和 / 或 VEGF 的结合。 本文使用的 “抗原结合蛋白” 能够拮抗和 / 或中和人 TNFα 和 / 或 VEGF。另外， 抗原结合蛋 白可以如下阻断 TNFα 和 / 或 VEGF 活性 ： 通过结合 TNFα 和 / 或 VEGF， 并阻止天然配体结 合和 / 或活化受体。
本文使用的 “VEGF 拮抗剂” 包括能够降低和 / 或消除 VEGF 的至少一种活性的任 意化合物。作为实例， VEGF 拮抗剂可以结合 VEGF， 且该结合可以直接地降低或消除 VEGF 活 性， 或它可以通过阻断至少一种配体与受体的结合而间接地起作用。
本文使用的 “TNFα 拮抗剂”包括能够降低和 / 或消除 TNFα 的至少一种活性的任 意化合物。 作为实例， TNFα 拮抗剂可以结合 TNFα， 且该结合可以直接地降低或消除 TNFα 活性， 或它可以通过阻断至少一种配体与受体的结合而间接地起作用。
与抗原结合蛋白关联地使用的术语 “特异性地结合” 是指， 该抗原结合蛋白会结合 它的靶蛋白 ( 例如 TNFα、 TNFR、 BEGF、 VEGFR)， 且不结合或不显著地结合其它的 ( 例如， 无 关的 ) 蛋白。但是， 该术语不排除下述事实， 即针对特定物种 ( 例如人 ) 中的靶蛋白的抗体 也可能与其它物种 ( 例如非人灵长类动物 ) 中的其它靶蛋白形式交叉反应。
术语 “KD” 表示平衡解离常数。在本发明的一个实施方案中， 所述抗原结合位点会 以最大 1mM 的 KD 结合抗原， 例如对于每个抗原 10nM、 1nM、 500pM、 200pM、 100pM 的 KD（通过 TM Biacore 测得） 。在本发明的一个实施方案中， 所述抗原结合位点会以对于每个抗原 10nM 或更小、 1nM 或更小、 500pM 或更小、 200pM 或更小、 100pM 或更小的 KD （通过 BiacoreTM 测得） 结合抗原。
本文使用的术语 “抗原结合位点” 表示能够特异性地结合抗原的构建体上的位点， 这可以是单个结构域， 例如表位 - 结合域， 或它可以是在标准抗体上可以发现的成对的 VH/ VL 结构域。在本发明的有些方面， 单链 Fv (ScFv) 结构域可以提供抗原结合位点。
术语 “mAb/dAb” 和 dAb/mAb”在本文中用于表示本发明的抗原结合蛋白。这 2 个 术语可以互换使用， 且意在具有本文使用的相同含义。
术语 “恒定的重链 1” 在本文中用于表示免疫球蛋白重链的恒定结构域 CH1。
术语 “恒定的轻链” 在本文中用于表示免疫球蛋白轻链的恒定结构域 CL。
术语 “文库” 表示异质多肽或核酸的混合物。文库由成员组成， 每个成员具有单个 多肽或核酸序列。就这一方面而言， “文库” 与 “所有组分” 同义。
“通用框架”是这样的单个抗体框架序列 ： 其对应着在 Kabat 所定义的序列 (“Sequences of Proteins of Immunological Interest” , 美国卫生和人类服务部 ) 中 保守的抗体区域， 或对应着 Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol. (1987) 196: 910-917 所定 义的人种系免疫球蛋白所有组分或结构。 具体实施方式
本发明提供了适用于眼的组合物， 其包含 TNFα 拮抗剂和 / 或 VEGF 拮抗剂。本发 明也提供了用于预防或治疗眼病的 TNFα 拮抗剂和 VEGF 拮抗剂的组合。 本发明也提供了一 种预防或治疗眼病的方法， 其中施用与 VEGF 拮抗剂相组合的 TNFα 拮抗剂。可以单独地、 顺序地或同时地施用 TNFα 拮抗剂和 VEGF 拮抗剂。
本发明涵盖了施用单独的 TNFα 拮抗剂和单独的 VEGF 拮抗剂的组合 ( 即分开的TNFα 和 VEGF 拮抗剂分子 )。另外， 本发明涵盖了施用能够结合 2 种或更多种抗原的单个 分子或构建体， 例如本发明涵盖了具有双靶向功能性的分子， 其起 TNFα 拮抗剂和 VEGF 拮 抗剂的作用 ( 即能够结合和抑制、 优选地阻断 TNFα 或 TNFα 受体的功能， 并结合和抑制、 优选地阻断 VEGF 或 VEGF 受体的功能 )。例如， 本发明提供了一种双靶向分子， 其能够结合 TNFα 和 VEGFR2 等。在一个实施方案中， 所述双靶向分子能够结合 TNF 受体和 VEGF 受体。
本发明的 TNFα 拮抗剂可以使通过 TNF 受体的信号传递抑制了 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98% 或 100%。本发明的 VEGF 拮抗剂可以使通过 VEGF 受体的信号传 递抑制了 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98% 或 100%。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是人抗原结合蛋白， 具体地人抗 -TNFα 抗 体或其片段或人抗 -TNFR 抗体或其片段。在一个实施方案中， 所述 VEGF 拮抗剂是人抗原结 合蛋白， 具体地人抗 -VEGF 抗体或其片段或人抗 -VEGFR 抗体或其片段。 在一个实施方案中， 所述抗原结合蛋白是 TNFα/VEGF 双靶向单个构建体， 其中所述 TNFα 拮抗剂部分是人。 在 一个具体实施方案中， 所述 TNF 拮抗剂是或源自阿达木单抗或戈利木单抗。
所述拮抗剂可以基于本文所述的抗体骨架或其它这样的合适的骨架。 这样的拮抗 剂可以是抗体或表位结合域， 例如 dAb。受体 -Fc 融合体被视作本发明的一部分。
本发明的拮抗剂可以作为单独分子的混合物共同施用， 它们可以同时施用 ( 同时 地 )， 或者相互在指定的时间段内施用 ( 顺序地 )， 例如相互在 1 个月、 1 周内或 24 小时内， 例如相互在 20 小时内、 或在 15 小时内、 或在 12 小时内、 或在 10 小时内、 或在 8 小时内、 或 在 6 小时内、 或在 4 小时内、 或在 2 小时内、 或在 1 小时内、 或在 30 分钟内。本发明的拮抗 剂可以作为分开的制剂或作为单个制剂 （例如含有 2 种拮抗剂的脂质体） 共同施用。
在本发明范围内的 TNFα 拮抗剂 （其可以与本发明的 VEGF 拮抗剂组合施用， 或其 可以用于制备本发明的双靶向分子） 包括下面在表 1 中列出的那些。
表 1: TNFα 拮抗剂。除了通过表 1 中的名称指出的 TNFα 拮抗剂以外， 根据本发明的 TNFα 拮抗剂包 括含有 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO: 31 的轻链的抗体。
在本发明范围内的 VEGF 拮抗剂 （其可以与本发明的 TNFα 拮抗剂组合施用， 或其 可以用于制备本发明的双靶向分子） 包括下面在表 2 中列出的那些。
表 2: VEGF 拮抗剂。本发明提供了用于治疗眼病的抗原结合蛋白， 其包含与一个或多个表位 - 结合域 相连的蛋白骨架， 其中所述抗原结合蛋白具有至少 2 个抗原结合位点， 其中的至少一个是 来自表位结合域， 且其中的至少一个是来自成对的 VH/VL 结构域， 且其中至少一个抗原结合
位点会结合 TNFα 或 TNFα 受体， 且至少一个抗原结合位点会结合 VEGF 或 VEGF 受体。
这样的抗原结合蛋白包含与一个或多个表位 - 结合域 （例如结构域抗体） 相连的蛋 白骨架， 例如 Ig 骨架诸如 IgG， 例如单克隆抗体， 其中所述结合蛋白具有至少 2 个抗原结合 位点， 其中的至少一个是来自表位结合域， 且其中至少一个抗原结合位点会结合 TNFα 或 TNFα 受体， 至少一个抗原结合位点会结合 VEGF 或 VEGF 受体， 以及它们的生产和使用方法， 特别是用于眼治疗中。
本发明的这样的抗原结合蛋白也称作 mAbdAb。
在一个实施方案中， 本发明的抗原结合蛋白的蛋白骨架是 Ig 骨架， 例如 IgG 骨架或 IgA 骨架。IgG 骨架可以包含抗体的所有结构域 ( 即 CH1、 CH2、 CH3、 VH、 VL、 CL)。本发明 的抗原结合蛋白可以包含选自 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4 或 IgG4PE 的 IgG 骨架。
本发明的抗原结合蛋白具有至少 2 个抗原结合位点， 例如它具有 2 个结合位点， 例 如其中第一结合位点具有对抗原上的第一表位的特异性， 且第二结合位点具有对相同抗原 上的第二表位的特异性。在另一个实施方案中， 存在 4 个抗原结合位点、 或 6 个抗原结合位 点、 或 8 个抗原结合位点、 或 10 个或更多个抗原结合位点。在一个实施方案中， 所述抗原结 合蛋白具有对超过一种抗原 （例如 2 种抗原、 或 3 种抗原或 4 种抗原） 的特异性。
在另一个方面， 本发明涉及能够结合 TNFα 或 TNFα 受体以及 VEGF 或 VEGF 受体 的抗原结合蛋白， 其包含至少一个具有 2 个或更多个式 I 结构的同源二聚体 ：其中 X 表示包含重链恒定结构域 2 (CH2) 和重链恒定结构域 3 (CH3) 的恒定抗体区 ； R1、 R4、 R7 和 R8 各自表示表位 - 结合域 ； R2 表示选自下述的结构域 ： 恒定的重链 1(CH1) 和表位 - 结合域 ； 3 R 表示选自下述的结构域 ： 成对的 VH 和表位 - 结合域 ； 5 R 表示选自下述的结构域 ： 恒定的轻链 (CL) 和表位 - 结合域 ； 6 R 表示选自下述的结构域 ： 成对的 VL 和表位 - 结合域 ； n 表示独立地选自下述的整数 ： 0、 1、 2、 3和4； m 表示独立地选自下述的整数 ： 0 和 1， 其中所述恒定的重链 1 (CH1) 和所述恒定的轻链 (CL) 结构域相结合 ； 其中存在至少一个表位结合域 ； 且当 R3 表示成对的 VH 结构域时， R6 表示成对的 VL 结构域， 使得 2 个结构域一起能够结 合抗原。
在一个实施方案中， R6 表示成对的 VL， R3 表示成对的 VH。
在另一个实施方案中， R7 和 R8 中的任一个或二者表示表位结合域。
在另一个实施方案中， R1 和 R4 中的任一个或二者表示表位结合域。在一个实施方案中， R4 存在。
在一个实施方案中， R1、 R7 和 R8 表示表位结合域。
在一个实施方案中， R1、 R7 和 R8 和 R4 表示表位结合域。
在一个实施方案中， (R1)n、 (R2)m、 (R4)m 和 (R5)m= 0， 即不存在， R3 是成对的 VH 结构 域， R6 是成对的 VL 结构域， R8 是 VHdAb， 且 R7 是 VLdAb。
在另一个实施方案中， (R1)n、 (R2)m、 (R4)m 和 (R5)m 是 0， 即不存在， R3 是成对的 VH 结 构域， R6 是成对的 VL 结构域， R8 是 VHdAb， 且 (R7)m= 0， 即不存在。 2 5
在另一个实施方案中， (R )m， 和 (R )m 是 0， 即不存在， R1 是 dAb，R4 是 dAb， R3 是成 对的 VH 结构域， R6 是成对的 VL 结构域， (R8)m 和 (R7)m= 0， 即不存在。
在本发明的一个实施方案中， 所述表位结合域是 dAb。
在本发明的另一个方面， 所述抗原结合蛋白是双特异性抗体， 其具有对 TNFα 或 TNFα 受体的第一特异性和对 VEGF 或 VEGF 受体的第二特异性。
在 本 发 明 的 另 一 个 方 面， 所述抗原结合蛋白是双可变结构域免疫球蛋白 (DVD-Ig)。
在本发明的另一个方面， 所述抗原结合蛋白是 dAb-dAb 线内融合体。 在本发明的另一个方面， 所述抗原结合蛋白是受体 -Fc 融合体， 其可以与一个或 多个表位 - 结合域相连。 受体 -Fc 融合体包含免疫球蛋白骨架， 即它们包含抗体的 Fc 部分， 该 Fc 部分与受体或细胞表面蛋白的可溶性配体或胞外结构域以及一个或多个表位结合域 相连。这样的受体 -Fc- 表位结合域融合体也可以称作受体 -Ig- 表位结合域融合体。Fc 部 分可以选自任意同种型的抗体， 例如 IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4 或 IgG4PE。
在一个实施方案中， 本发明的抗原结合蛋白具有对 VEGF 的特异性， 例如它们包含 受体 -Fc 融合体， 该融合体连接到会结合 VEGF 的表位结合域上， 例如 dAb、 anticalin 或会 结合 VEGF 的 adnectin。
在一个实施方案中， 本发明的抗原结合蛋白具有对 VEGFR2 的特异性， 例如它们包 含受体 -Fc 融合体， 该融合体连接到会结合 VEGFR2 的表位结合域上， 例如 dAb 或会结合 VEGFR2 的 adnectin。
在一个实施方案中， 本发明的抗原结合蛋白具有对 TNFα 的特异性， 例如它们包 含受体 -Fc 融合体， 该融合体连接到会结合 TNFα 的表位结合域上， 例如 dAb 或会结合 TNFα 的 adnectin。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白具有对 TNFα 或 TNFα 受体以及 VEGF 或 VEGF 受体的特异性， 例如它们包含 TNFα 受体 -Fc 融合体， 该融合体连接到会结合 VEGF 或 VEGF 受体的表位结合域上。另一个实例是包含 VEGF 受体 -Fc 融合体的抗原结合蛋白， 该融合体连接到会结合 TNFα 或 TNFα 受体的表位结合域上。
应该理解， 本文所述的任意抗原结合蛋白能够中和一种或多种抗原， 例如它们能 够中和 TNFα， 和 / 或它们还能够中和 VEGF。
贯穿本说明书关于本发明的抗原结合蛋白使用的术语 “中和” 和其语法变体是指， 与在没有这样的抗原结合蛋白存在下的靶物活性相比， 在有本发明的抗原结合蛋白存在 下， 完全地或部分地降低了靶物的生物活性。中和可以是由于但不限于下述的一个或多个 原因 ： 阻断配体结合， 阻止配体活化受体， 减量调节受体， 或影响效应物功能。
可以以几种方式测量中和水平， 例如在 IL-8 分泌试验中， 在 MRC-5 细胞中， 这可以 如例如在实施例 1.3 中所述地进行。在该试验中， 通过评估在有中和抗原结合蛋白存在下 IL-8 分泌的抑制， 测量 TNFα 的中和。 还可以在测量配体与受体的结合的抑制的试验中， 测 量中和水平， 这可以如例如在实施例 1.3 中所述地进行。在该试验中， 通过评估在有中和抗 原结合蛋白存在下配体和它的受体之间的结合的减少， 测量 VEGF 的中和。
其它评估中和的方法 （例如， 通过评估在有中和抗原结合蛋白存在下配体和它的 受体之间的结合的减少） 是本领域已知的， 且包括， 例如， BiacoreTM 试验。
在本发明的一个替代性的方面， 提供了抗原结合蛋白， 其具有与本文例证的抗原 结合蛋白至少基本上等效的中和活性。
本发明的抗原结合蛋白具有对 TNFα 或 TNFα 受体的特异性， 例如它们包含能够 结合 TNFα 的表位 - 结合域， 和 / 或它们包含会结合 TNFα 的成对的 VH/VL。所述抗原结合 蛋白可以包含能够结合 TNFα 的抗体。 所述抗原结合蛋白可以包含能够结合 TNFα 的 dAb。
本发明的抗原结合蛋白也具有对 VEGF 或 VEGF 受体的特异性。 在一个实施方案中， 本发明的抗原结合蛋白能够同时地结合 TNFα 和 VEGF。
应该理解， 本文所述的任意抗原结合蛋白可以能够同时地结合 2 种或更多种抗 原， 例如， 使用合适的试验 （诸如在实施例 3 中所述的试验） 通过化学计量分析测得。
这样的抗原结合蛋白的实例包括 VEGF 抗体， 其具有作为 TNFα 拮抗剂的表位结合 域， 例如抗 -TNFα adnectin， 所述表位结合域连接至重链的 C- 端或 N- 端或轻链的 C- 端 或 N- 端。实例包括这样的抗原结合蛋白 ： 其包含在 SEQ ID NO: 20 或 22 中所述的重链序 列和在 SEQ ID NO: 21 中所述的轻链序列， 其中重链和轻链之一或二者另外包含一个或多 个结合 TNFα 的表位 - 结合域， 例如选自在 SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 17 中所述的那些 的表位结合域。
在一个实施方案中， 所述抗原结合蛋白包含连接至作为 TNFα 拮抗剂的表位结合 域上的抗 -VEGF 抗体， 其中所述抗 -VEGF 抗体具有与下述抗体相同的 CDR ： 所述抗体具有 SEQ ID NO:20 或 22 的重链序列和 SEQ ID NO: 21 的轻链序列。
这样的抗原结合蛋白的实例包括 TNFα 抗体， 其具有作为 VEGF 拮抗剂的表位结合 域， 所述表位结合域连接至重链的 C- 端或 N- 端或轻链的 C- 端或 N- 端。实例包括这样的 抗原结合蛋白 ： 其包含在 SEQ ID NO: 10 中所述的重链序列和在 SEQ ID NO: 12 中所述的 轻链序列， 其中重链和轻链之一或二者另外包含一个或多个能够拮抗 VEGF（例如通过结合 VEGF 或结合 VEGF 受体例如 VEGFR2） 的表位 - 结合域。这样的表位 - 结合域可以选自在 SEQ ID NO: 1、 18、 19、 23 或 44 中所述的那些。
在一个实施方案中， 本发明的抗原结合构建体包含 ： SEQ ID NO: 14 的重链序列和 SEQ ID NO: 12 的轻链序列， 或 SEQ ID NO ： 15 的重链序列和 SEQ ID NO ： 12 的轻链序列， 或 SEQ ID NO ： 24 的重链序列和 SEQ ID NO ： 12 的轻链序列。
在 一 个 实 施 方 案 中，本 发 明 的 抗 原 结 合 构 建 体 包 含 在 WO0212502、 US2007/0003548、 US7250165、 EP01309691 或 WO0212500（它们都通过引用整体并入本文） 中 公开的抗 -TNFα 结合蛋白。
在一个实施方案中， 所述抗原结合蛋白包含连接至作为 VEGF 拮抗剂的表位结合 域上的抗 -TNFα 抗体， 其中所述抗 -TNFα 抗体具有与下述抗体相同的 CDR ： 所述抗体具有SEQ ID NO:10 的重链序列和 SEQ ID NO: 12 的轻链序列。
这样的抗原结合蛋白的其它实例包括具有抗 -VEGF 表位结合域的抗 -TNFα 抗 体， 所述表位结合域连接至重链的 C- 端或 N- 端或轻链的 C- 端或 N- 端上， 其中所述 VEGF 表位结合域是选自下述的 VEGF dAb ： 在 WO2007080392 ( 它通过引用并入本文 ) 中所述 的 任 一 个 VEGF dAb 序 列， 具 体 地 在 SEQ ID NO:117、 119、 123、 127-198、 539 和 540 中 所 述的 dAb ； 或选自下述的 VEGF dAb ： 在 WO2008149146 ( 它通过引用并入本文 ) 中所述的 任 一 个 VEGF dAb 序 列， 具 体 地 被 描 述 为 DOM15-26-501、 DOM15-26-555、 DOM15-26-558、 DOM15-26-589、 DOM15-26-591、 DOM15-26-594 和 DOM15-26-595 的 dAb ； 或选自下述的 VEGF dAb ： 在 WO2007066106 ( 它通过引用并入本文 ) 中所述的任一个 VEGF dAb 序列 ； 或选自下 述的 VEGF dAb ： 在 WO 2008149147 ( 它通过引用并入本文 ) 中所述的任一个 VEGF dAb 序 列； 或选自下述的 VEGF dAb ： 在 WO 2008149150 ( 它通过引用并入本文 ) 中所述的任一个 VEGF dAb 序列。
在 WO2007080392、 WO2008149146、 WO2007066106、 WO2008149147 和 WO 2008149150 中的这些具体的序列和有关的公开内容通过引用并入本文， 如同明确地写入本文中， 意图 提供公开内容， 用于整合进本文的权利要求书中， 和作为用于本发明的上下文中的可变结 构域和拮抗剂的实例。
这样的抗原结合构建体的其它实例包括具有一个或多个抗 -TNFα 表位结合域的 抗 -VEGF 抗体， 所述表位结合域连接至重链的 C- 端或 N- 端或轻链的 C- 端或 N- 端上， 其 中所述 TNFα 表位结合域是选自下述的 TNF-α dAb ： 在 WO04003019 ( 它通过引用并入本 文 ) 中公开的任一种 TNFα dAb， 具体地被描述为 TAR1-5-19、 TAR1-5 和 TAR1-27 的 dAb。 在 WO04003019 中的这些具体的序列和有关的公开内容通过引用并入本文， 如同明确地写入本 文中， 意图提供公开内容， 用于整合进本文的权利要求书中， 和作为用于本发明的上下文中 的可变结构域和拮抗剂的实例。
这样的抗原结合构建体的其它实例包括具有一个或多个抗 -TNFR1 表位结合域的 抗 -VEGF 抗体， 所述表位结合域连接至重链的 C- 端或 N- 端或轻链的 C- 端或 N- 端上， 其中 所述 TNFR1 表位结合域是选自下述的 TNFR1 dAb ： 在 WO04003019 ( 它通过引用并入本文 ) 中公开的任一种 TNFR1 dAb 序列， 具体地被描述为 TAR2-10 和 TAR2-5 的 dAb ； 或选自下述 的 TNFR1 dAb ： 在 WO2006038027 ( 它通过引用并入本文 ) 中公开的任一种 TNFR1 dAb 序列， 具体地在 SEQ ID NO: 32-98、 167-179、 373-401、 431、 433-517 和 627 中所述的 dAb ； 或选自 下述的 TNFR1 dAb ： 在 WO2008149144 ( 它通过引用并入本文 ) 中公开的任一种 TNFR1 dAb 序列， 具体地被描述为 DOM1h-131-511、 DOM1h-131-201、 DOM1h-131-202、 DOM1h-131-203、 DOM1h-131-204、 DOM1h-131-205 的 dAb ； 或选自下述的 TNFR1 dAb ： 在 WO2008149148 ( 它 通过引用并入本文 ) 中公开的任一种 TNFR1 dAb 序列， 具体地被描述为 DOM1h-131-206 的 dAb。
在 WO2006038027 和 WO2008149144 中的这些具体的序列和有关的公开内容通过 引用并入本文， 如同明确地写入本文中， 意图提供公开内容， 用于整合进本文的权利要求书 中， 和作为用于本发明的上下文中的可变结构域和拮抗剂的实例。
抗原结合蛋白的其它实例包括连接到具有对 VEGFR2 的特异性的表位结合域上的 TNFR2-Ig 融合体， 所述表位结合域例如抗 -VEGFR2 adnectin， 其连接至 TNFR2-Ig 融合体的C- 端或 N- 端， 例如包含在 SEQ ID NO:34 中所述的 TNFR2-Ig 序列的抗原结合蛋白， 其另外 包含一个或多个结合 VEGFR2 的表位 - 结合域， 例如在 SEQ ID NO:18 中所述的 adnectin。
这样的抗原结合蛋白的其它实例包括连接到具有对 VEGF 的特异性的表位结合域 上的 TNFR2-Ig 融合体， 所述表位结合域例如例如抗 -VEGF dAb 或抗 -VEGF anticalin， 其连 接至 TNFR2-Ig 融合体的 C- 端或 N- 端， 例如包含在 SEQ ID NO:34 中所述的 TNFR2-Ig 序列 的受体 -Fc- 表位结合域融合体， 其另外包含一个或多个结合 VEGF 的表位 - 结合域， 例如在 SEQ ID NO:1 中所述的 dAb， 或在 SEQ ID NO:19 中所述的 anticalin。
贯穿本说明书， 根据 Kabat 编号规则， 对可变结构域序列和全长抗体序列的氨基 酸残基编号。类似地， 在实施例中使用的术语 “CDR” 、 “CDRL1” 、 “CDRL2” 、 “CDRL3” 、 “CDRH1” 、 “CDRH2” 、 “CDRH3” 遵守 Kabat 编号规则。关于其它信息， 参见 Kabat 等人 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 4 版 , 美国卫生和人类服务部 , National Institutes of Health (1987)。
但是， 尽管我们在本说明书中使用可变结构域序列和全长抗体序列的氨基酸残基 的 Kabat 编号规则， 本领域技术人员会明白， 存在可变结构域序列和全长抗体序列的氨基 酸残基的替代性的编号规则。也存在 CDR 序列的替代性的编号规则， 例如在 Chothia 等人 (1989) Nature 342: 877-883 中所述的那些。抗体的结构和蛋白折叠可以是指， 其它残基 被视作 CDR 序列的一部分， 且是技术人员会理解成这样的。
技术人员可利用的 CDR 序列的其它编号规则包括 “AbM” (University of Bath) 和 “接触”(University College London) 方法。可以确定使用 Kabat、 Chothia、 AbM 和接 触方法中的至少 2 种方法时的最小重叠区， 以提供 “最小结合单位” 。最小结合单位可以是 CDR 的子部分。
具有 CDR 变体的抗原结合蛋白也被视作本发明的一部分。这样的抗原结合蛋白也 可以具有一个或多个具有相同或不同的抗原 - 特异性的其它表位结合域， 所述表位结合域 连接至重链的 C- 端和 / 或 N- 端、 和 / 或轻链的 C- 端和 / 或 N- 端、 和 / 或受体 -Fc 或受 体 -Fc-dAb 融合体的 N- 端或 C- 端上。
在本发明的一个实施方案中， 提供了本文所述的根据本发明的抗原结合蛋白， 其 包含恒定区， 使得所述抗体或受体 -Fc 融合体具有减少的 ADCC 和 / 或补体活化或效应物功 能。在一个这样的实施方案中， 所述重链恒定区可以包含 IgG2 或 IgG4 同种型的天然有缺 陷的恒定区或突变的 IgG1 恒定区。 合适的修饰的实例描述在 EP0307434 中。 一个实例包含 在位置 235 和 237 处的丙氨酸残基的置换 (EU 索引编号 , Kabat 等人 , (1983)“Sequences of Proteins of Immunological Interest” , 美国卫生和人类服务部 )。
在一个实施方案中， 所述抗原结合蛋白的 Fc 部分是功能上有缺陷的。这样的 Fc 缺陷可以给抗原结合蛋白提供提高的安全性特性。
本发明也提供了一种降低抗原结合蛋白的 CDC 功能的方法， 其中将表位结合域放 置在抗体的重链上， 具体地， 将表位结合域放置在重链的 C- 端上。
在一个实施方案中， 本发明的抗原结合蛋白会保留 Fc 功能性， 例如能够具有 ADCC 和 CDC 活性之一或二者。
本发明的抗原结合蛋白可以具有一些效应物功能。例如如果免疫球蛋白骨架含 有源自具有效应物功能的抗体的 Fc 区， 例如如果免疫球蛋白骨架包含来自 IgG1 的 CH2 和CH3。 根据已知的技术， 可以改变效应物功能的水平， 所述技术例如 ： 通过 CH2 结构域中的突 变， 例如， 其中 IgG1 CH2 结构域具有一个或多个在选自 239 和 332 和 330 的位置处的突变， 例如所述突变选自 S239D 和 I332E 和 A330L， 使得所述抗体具有增强的效应物功能 ； 和/或 例如， 改变本发明的抗原结合蛋白的糖基化特性， 使得存在 Fc 区的岩藻糖基化的减少。
在一个实施方案中， 所述抗原结合蛋白包含作为结构域抗体 (dAb) 的表位 - 结合 域， 例如所述表位结合域可以是人 VH 或人 VL， 或骆驼类 VHH 或鲨鱼 dAb (NARV)。
在一个实施方案中， 所述抗原结合蛋白包含作为选自下述的骨架的衍生物的表 位 - 结合域 ： CTLA-4 (Evibody) ； 脂质运载蛋白 ； 蛋白 A 衍生出的分子诸如蛋白 A( 亲和体、 SpA) 的 Z- 结构域、 A- 结构域 (Avimer/Maxibody) ； 热休克蛋白诸如 GroEl 和 GroES ； 转铁 蛋白 ( 反体 ) ； 锚蛋白重复蛋白 (DARPin) ； 肽适体 ； C- 型凝集素结构域 ( 四连接素 ) ； 人 γ- 晶体蛋白和人泛素 (affilins) ； PDZ 结构域 ； 人蛋白酶抑制剂的全蝎毒素 kunitz 型结 构域 ； 和纤连蛋白 (adnectin) ； 其已经进行蛋白工程化， 以便实现与除了天然配体以外的 配体的结合。
本发明的抗原结合蛋白可以包含连接至 adnectin 表位结合域上的蛋白骨架， 例 如具有连接至重链 C- 端上的 adnectin 的 IgG 骨架， 或它可以包含连接至 adnectin 上的 蛋白骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的 adnectin 的 IgG 骨架， 或它可以包含连接至 adnectin 上的蛋白骨架， 例如具有连接至轻链 C- 端上的 adnectin 的 IgG 骨架， 或它可以 包含连接至 adnectin 上的蛋白骨架， 例如具有连接至轻链 N- 端上的 adnectin 的 IgG 骨 架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至 CTLA-4 表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的 CTLA-4 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接 至重链 C- 端上的 CTLA-4 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的 CTLA-4 的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的 CTLA-4 的 IgG 骨架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至脂质运载蛋白表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的脂质运载蛋白的 IgG 骨架， 或它可以包含例 如具有连接至重链 C- 端上的脂质运载蛋白的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的脂质运载蛋白的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的脂质运载蛋白 的 IgG 骨架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至 SpA 表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的 SpA 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至重链 C- 端上的 SpA 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的 SpA 的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的 SpA 的 IgG 骨架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至亲和体表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的亲和体的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至重 链 C- 端上的亲和体的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的亲和体的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的亲和体的 IgG 骨架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至 affimer 表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的 affimer 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连 接至重链 C- 端上的 affimer 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的affimer 的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的 affimer 的 IgG 骨架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至 GroEI 表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的 GroEI 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至重 链 C- 端上的 GroEI 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的 GroEI 的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的 GroEI 的 IgG 骨架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至转铁蛋白表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的转铁蛋白的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接 至重链 C- 端上的转铁蛋白的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的转铁 蛋白的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的转铁蛋白的 IgG 骨架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至 GroES 表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的 GroES 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至重 链 C- 端上的 GroES 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的 GroES 的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的 GroES 的 IgG 骨架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至 DARPin 表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的 DARPin 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接 至重链 C- 端上的 DARPin 的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的 DARPin 的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的 DARPin 的 IgG 骨架。
在其它实施方案中， 它可以包含连接至肽适体表位结合域上的蛋白骨架， 例如 IgG 骨架， 例如具有连接至重链 N- 端上的肽适体的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至重 链 C- 端上的肽适体的 IgG 骨架， 或它可以包含例如具有连接至轻链 N- 端上的肽适体的 IgG 骨架， 或它可以包含具有连接至轻链 C- 端上的肽适体的 IgG 骨架。
在本发明的一个实施方案中， 存在 4 个表位结合域， 例如 4 个结构域抗体， 2 个表位 结合域可以具有对相同抗原的特异性， 或在所述抗原结合蛋白中存在的所有表位结合域可 以具有对相同抗原的特异性。
通过使用连接物， 可以将本发明的蛋白骨架连接至表位 - 结合域上。类似地， 通过 使用连接物， 可以将本发明的受体 -Fc 融合体连接至表位结合域上。通过使用连接物， 也可 以将 DVD-Ig 的 VDI 和 VD2 结构域连接到一起， 等等。合适的连接物的实例包括这样的氨基 酸序列 ： 其长度可以是 1 个氨基酸至 150 个氨基酸， 或 1 个氨基酸至 140 个氨基酸， 例如，1 个氨基酸至 130 个氨基酸， 或 1 至 120 个氨基酸， 或 1 至 80 个氨基酸， 或 1 至 50 个氨基酸， 或 1 至 20 个氨基酸， 或 1 至 10 个氨基酸， 或 5 至 18 个氨基酸。这样的序列可以具有它们 自己的三级结构， 例如， 本发明的连接物可以包含单个可变结构域。在一个实施方案中， 连 接物的大小等于单个可变结构域。合适的连接物的大小可以是 1 至 20 埃， 例如小于 15 埃、 或小于 10 埃、 或小于 5 埃。
在本发明的一个实施方案中， 使用包含 1-150 个氨基酸 （例如 1-20 个氨基酸， 例如 1-10 个氨基酸） 的连接物， 将至少一个表位结合域直接连接至 Ig 骨架上。
这样的连接物可以选自在 SEQ ID NO: 3-8、 SEQ ID NO:25 或 SEQ ID NO:66-68 中 所述的那些中的任一种， 或多个这样的连接物。例如， 所述连接物可以是 ‘TVAAPS’ ， 或者所 述连接物可以是 ‘GGGGS’ 或多个这样的连接物。
在本发明的一个实施方案中， 所述连接物是 ‘STG’(SEQ ID NO:25)。连接物可以是具有 1 个或 2 个氨基酸变化的本文所述的任意连接物。用于本发明 的抗原结合蛋白中的连接物可以包含包含单独的或与其它连接物组合的一个或多个 GS 残 基集合， 例如 ‘GSTVAAPS’ 或 ‘TVAAPSGS’ 或 ‘GSTVAAPSGS’ 或多个这样的连接物。在一个实 施方案中， 所述连接物包含 ‘GSTVAAPSGS’ 或由其组成。
在 一 个 实 施 方 案 中，所 述 连 接 物 包 含 GS(TVAAPSGS) x2 ( 例 如 ‘GSTVAAPSGSTVAAPSGS’ SEQ ID NO:66) 或由其组成。在一个实施方案中， 所述连接物包 含 GS(TVAAPSGS) x 3 ( 例如 ‘GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS’ SEQ ID NO:67) 或由其组 成。在一个实施方案中， 所述连接物包含 GS(TVAAPSGS) x 4 ( 例如 ‘GSTVAAPSGSTVAAPSGS TVAAPSGSTVAAPSGS’SEQ ID NO:68) 或由其组成。
在一个实施方案中， 所述表位结合域通过连接物 ‘(PAS)n(GS)m’ 连接至 Ig 骨架上。 在另一个实施方案中， 所述表位结合域通过连接物 ‘(GGGGS)n 或 p(GS)m’ 连接至 Ig 骨架上。 在另一个实施方案中， 所述表位结合域通过连接物 ‘(TVAAPS)n 或 p(GS)m’ 连接至 Ig 骨架上。 在另一个实施方案中， 所述表位结合域通过连接物 ‘(GS)m(TVAAPSGS)n 或 p’ 连接至 Ig 骨架 上。在另一个实施方案中， 所述表位结合域通过连接物 ‘(GS)m(TVAAPS)p(GS)m’ 连接至 Ig 骨 架上。在另一个实施方案中， 所述表位结合域通过连接物 ‘(PAVPPP)n(GS)m’ 连接至 Ig 骨架 上。 在另一个实施方案中， 所述表位结合域通过连接物 ‘(TVSDVP)n(GS)m’ 连接至 Ig 骨架上。 在另一个实施方案中， 所述表位结合域通过连接物 ‘(TGLDSP)n(GS)m’ 连接至 Ig 骨架上。在 所有这样的实施方案中， n = 1-10， 且 m = 0-4， 且 p=2-10。
这样的连接物的实例包括 ： (PAS)n(GS)m， 其 中 n=1， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 145)， (PAS)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 146)， (PAS)n(GS)m， 其中 n=3， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 147)， (PAS)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=1， (PAS)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=0， (PAS)n(GS)m， 其中 n=3， 且 m=0， (PAS)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=0。
这样的连接物的实例包括 ： (GGGGS)n(GS)m， 其中 n=1， 且 m=1， (GGGGS)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=1， (GGGGS)n(GS)m， 其中 n=3， 且 m=1， (GGGGS)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=1， (GGGGS)n(GS) 其中 n=2， 且 m=0 (SEQ ID NO ： 148)， (GGGGS)n(GS)m， 其中 n=3， 且 m=0 (SEQ ID NO ： 149)， m， (GGGGS)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=0。
这样的连接物的实例包括 ： (GS)m(TVAAPS)p， 其中 p=1， 且 m=1， (GS)m(TVAAPS)p， 其 中 p=2， 且 m=1， (GS)m(TVAAPS)p， 其中 p=3， 且 m=1， (GS)m(TVAAPS)p， 其中 p=4， 且 m=1)， (GS) 其中 p=5， 且 m=1， 或 (GS)m(TVAAPS)p， 其中 p=6， 且 m=1。 m(TVAAPS)p，
这样的连接物的实例包括 ： (TVAAPS)n(GS)m， 其中 n=1， 且 m=1， (TVAAPS)n(GS)m ， 其中 n=2， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 150)， (TVAAPS)n(GS)m， 其中 n=3， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 151)， (TVAAPS)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=1， (TVAAPS)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=0， (TVAAPS)n(GS)m， 其中 n=3， 且 m=0， (TVAAPS)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=0。
这样的连接物的实例包括 ： (GS)m(TVAAPSGS)n， 其中 n=1， 且 m=1， (GS)m(TVAAPSGS) 其中 n=2， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 66)， (GS)m(TVAAPSGS)n， 其中 n=3， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 67)， n， 或 (GS)m(TVAAPSGS)n， 其中 n=4， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 68)， (GS)m(TVAAPSGS)n， 其中 n=5， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 152)， (GS)m(TVAAPSGS)n， 其中 n=6， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 153)， (GS)m(TVAAPSGS) 其中 n=1， 且 m=0 (SEQ ID NO ： 8)， (GS)m(TVAAPSGS)n， 其中 n=2， 且 m=10， (GS)m(TVAAPSGS) n， 其中 n=3， 且 m=0， 或 (GS)m(TVAAPSGS)n， 其中 n=0。 n，这样的连接物的实例包括 ： (TVAAPSGS)p(GS)m， 其中 p=2， 且 m=1， (TVAAPSGS)p(GS) 其中 p=3， 且 m=1 ， (TVAAPSGS)p(GS)m， 其中 p=4， 且 m=1， (TVAAPSGS)p(GS)m， 其中 p=2， 且 m， m=0， (TVAAPSGS)p(GS)m， 其中 p=3， 且 m=0， (TVAAPSGS)p(GS)m， 其中 p=4， 且 m=0。
这样的连接物的实例包括 ：(PAVPPP)n(GS)m， 其中 n=1， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 154)， (PAVPPP)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 155)， (PAVPPP)n(GS)m， 其中 n=3， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 156)， (PAVPPP)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=1， (PAVPPP)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=0， (PAVPPP) 其中 n=3， 且 m=0， (PAVPPP)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=0。 n(GS)m，
这样的连接物的实例包括 ：(TVSDVP)n(GS)m， 其中 n=1， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 157)， (TVSDVP)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 158)， (TVSDVP)n(GS)m， 其中 n=3， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 159)， (TVSDVP)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=1， (TVSDVP)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=0， (TVSDVP) 其中 n=3， 且 m=0， (TVSDVP)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=0。 n(GS)m，
这样的连接物的实例包括 ： (TGLDSP)n(GS)m， 其中 n=1， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 160)， (TGLDSP)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 161)， (TGLDSP)n(GS)m， 其中 n=3， 且 m=1 (SEQ ID NO ： 162)， (TGLDSP)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=1， (TGLDSP)n(GS)m， 其中 n=2， 且 m=0， (TGLDSP) 其中 n=3， 且 m=0， (TGLDSP)n(GS)m， 其中 n=4， 且 m=0。 n(GS)m，
在另一个实施方案中， 在表位结合域和 Ig 骨架之间没有连接物。在另一个实施方 案中， 所述表位结合域通过连接物 ‘TVAAPS’ 连接至 Ig 骨架上。在另一个实施方案中， 所述 表位结合域通过连接物 ‘TVAAPSGS’ 连接至 Ig 骨架上。在另一个实施方案中， 所述表位结 合域通过连接物 ‘GS’ 连接至 Ig 骨架上。在另一个实施方案中， 所述表位结合域通过连接 物 ‘ASTKGPT’ 连接至 Ig 骨架上。
在一个实施方案中， 本发明的抗原结合蛋白包含至少一个抗原结合位点， 例如至 少一个能够结合人血清白蛋白的表位结合域。
在一个实施方案中， 存在至少 3 个抗原结合位点， 例如存在 4 或 5 或 6 或 8 或 10 个抗原结合位点， 且所述抗原结合蛋白能够结合至少 3 或 4 或 5 或 6 或 8 或 10 种抗原， 例 如它能够同时地结合 3 或 4 或 5 或 6 或 8 或 10 种抗原。
本发明也提供了用于药学中的本文公开的抗原结合蛋白， 例如用于制备药物， 所 述药物用于治疗眼的疾病 ( 或者在本文中称作 ‘眼病’ )， 例如糖尿病黄斑水肿 (DME)、 囊样 黄斑水肿、 葡萄膜炎、 AMD ( 年龄相关性黄斑变性 )、 脉络膜新生血管 AMD、 地理性萎缩、 糖尿 病视网膜病变、 视网膜静脉阻塞 (BRVO 和 / 或 CRVO) 和其它黄斑病变和眼血管病变。在一 个实施方案中， 要治疗的疾病是 AMD。在另一个实施方案中， 要治疗的疾病是 DME。
本发明提供了一种治疗遭受眼病的患者的方法， 所述眼病例如糖尿病黄斑水肿、 囊样黄斑水肿、 葡萄膜炎、 AMD ( 年龄相关性黄斑变性 )、 脉络膜新生血管 AMD、 地理性萎缩、 糖尿病视网膜病变、 视网膜静脉阻塞 (BRVO 和 / 或 CRVO) 和其它黄斑病变和眼血管病变， 所 述方法包括 ： 施用治疗量的本发明的抗原结合蛋白。
本发明的抗原结合蛋白可以用于治疗眼病， 例如糖尿病黄斑水肿、 囊样黄斑水肿、 葡萄膜炎、 AMD ( 年龄相关性黄斑变性 )、 脉络膜新生血管 AMD、 地理性萎缩、 糖尿病视网膜 病变、 视网膜静脉阻塞 (BRVO 和 / 或 CRVO) 和其它黄斑病变和眼血管病变或与 TNFα 和 / 或 VEGF 的过量产生有关的任意其它疾病。
在一个具体实施方案中， 所述疾病是 AMD， 具体地脉络膜新生血管 AMD。在本发明中使用的蛋白骨架包括 ： 含有抗体的所有结构域的完整单克隆抗体骨 架、 常规抗体的 Fc 部分， 或者本发明的蛋白骨架可以包含非常规的抗体结构， 诸如单价抗 体或非常规的抗体结构的 Fc 部分。这样的单价抗体可以包含成对的重链和轻链， 其中重链 的铰链区被修饰， 使得所述重链不会同源二聚体化， 诸如在 WO2007059782 中所述的单价抗 体。 其它单价抗体可以包含成对的重链和轻链， 其与缺少功能可变区和 CH1 区的第二重链二 聚体化， 其中所述第一和第二重链被修饰， 使得它们会形成异源二聚体而不是同源二聚体， 产生具有 2 个重链和 1 个轻链的单价抗体， 诸如在 WO2006015371 中所述的单价抗体。这样 的单价抗体可以提供本发明的蛋白骨架， 表位结合域可以与其相连。这样的单价抗体的 Fc 区可以提供本发明的免疫球蛋白骨架， 受体或细胞表面蛋白的可溶性配体、 胞外结构域和 表位结合域可以与其相连。在这样的单价结构中， 可能具有与第一重链相连的受体或细胞 表面蛋白的可溶性配体或胞外结构域， 和一个或多个与第二重链相连的表位结合域。
在本发明中使用的表位 - 结合域是独立于不同的 V 区或结构域而特异性地结合抗 原或表位的结构域， 这样可以是结构域抗体， 或可以是作为选自下述的骨架的衍生物的结 构域 ： CTLA-4 (Evibody) ； 脂质运载蛋白 ； 蛋白 A 衍生出的分子诸如蛋白 A( 亲和体、 SpA) 的 Z- 结构域、 A- 结构域 (Avimer/Maxibody) ； 热休克蛋白诸如 GroEl 和 GroES ； 转铁蛋白 ( 反体 ) ； 锚蛋白重复蛋白 (DARPin) ； 肽适体 ； C- 型凝集素结构域 ( 四连接素 ) ；人 γ- 晶 体蛋白和人泛素 (affilins) ； PDZ 结构域 ； 人蛋白酶抑制剂的全蝎毒素 kunitz 型结构域 ； 和纤连蛋白 (adnectin) ； 其已经进行蛋白工程化， 以便实现与除了天然配体以外的配体的 结合。 在一个实施方案中， 这可以是结构域抗体或其它合适的结构域， 诸如选自下述的结构 域： CTLA-4、 lipocallin、 SpA、 亲和体、 avimer、 GroEl、 转铁蛋白、 GroES 和纤连蛋白。在一 个实施方案中， 这可以选自 ： dAb、 亲和体、 锚蛋白重复蛋白 (DARPin) 和 adnectin。在另一 个实施方案中， 这可以选自 ： 亲和体、 锚蛋白重复蛋白 (DARPin) 和 adnectin。在另一个实 施方案中， 这可以是结构域抗体， 例如选自人、 骆驼类或鲨鱼 (NARV) 结构域抗体的结构域 抗体。
表位 - 结合域可以连接至蛋白骨架的一个或多个位置处。这些位置包括蛋白骨架 的 C- 端和 N- 端， 例如 IgG 的重链 C- 端和 / 或轻链 C- 端， 或例如 IgG 的重链 N- 端和 / 或 轻链 N- 端。
在一个实施方案中， 将第一表位结合域连接至蛋白骨架上， 并将第二表位结合域 连接至第一表位结合域上， 例如在蛋白骨架是 IgG 骨架的情况下， 可以将第一表位结合域 连接至 IgG 骨架的重链 C- 端上， 并可以将该表位结合域在它的 C- 端处连接至第二表位结 合域上， 或者例如， 可以将第一表位结合域连接至 IgG 骨架的轻链 C- 端上， 并可以将该第一 表位结合域在它的 C- 端处进一步连接至第二表位结合域上， 或者例如， 可以将第一表位结 合域连接至 IgG 骨架的轻链 N- 端上， 并可以将该第一表位结合域在它的 N- 端处进一步连 接至第二表位结合域上， 或者例如， 可以将第一表位结合域连接至 IgG 骨架的重链 N- 端上， 并可以将该第一表位结合域在它的 N- 端处进一步连接至第二表位结合域上。
当所述表位 - 结合域是结构域抗体时， 可以将一些结构域抗体安置在骨架内的特 定位置。
用于本发明中的结构域抗体可以连接在常规 IgG 的重链和 / 或轻链的 C- 端末端。 另外， 有些 dAb 可以连接至常规抗体的重链和轻链的 C- 端末端。表位 - 结合域可以连接至受体 -Fc 融合体的一个或多个位置处。这些位置包括受 体 -Fc 融合体的 C- 端和 N- 端。例如， 它们可以直接地连接至受体 -Fc 融合体的 Fc 部分 上， 或者它们可以连接至受体 -Fc 融合体的受体或细胞表面蛋白部分的可溶性配体或胞外 结构域上。在受体或细胞表面蛋白的可溶性配体或胞外结构域连接至 Fc 部分的 N- 端上的 情况下， 表位 - 结合域可以直接地连接至 Fc 部分的 C- 端上， 或直接地连接至受体或细胞表 面蛋白的可溶性配体或胞外结构域的 N- 端上。
在一个实施方案中， 将第一表位结合域连接至受体 -Fc 融合体上， 并将第二表位 结合域连接至第一表位结合域上， 例如可以将第一表位结合域连接至受体 -Fc 融合体的 C- 端上， 并可以将该表位结合域在它的 C- 端处连接至第二表位结合域上， 或者例如， 可以 将第一表位结合域连接至受体 -Fc 融合体的 N- 端上， 并可以将该第一表位结合域在它的 N- 端处进一步连接至第二表位结合域上。当所述表位 - 结合域是结构域抗体时， 可以将一 些结构域抗体安置在骨架内的特定位置。
在将 dAb 的 N- 端与抗体恒定结构域 (CH3 或 CL) 融合的构建体中， 肽连接物可以 帮助 dAb 结合抗原。实际上， dAb 的 N- 端末端的位置紧密靠近参与抗原结合活性的互补 性 - 决定区 (CDR)。 因而， 短的肽连接物会起蛋白骨架的表位 - 结合域和恒定结构域之间的 隔离物的作用， 这可以允许 dAb CDR 更容易地到达抗原， 其因此可以以高亲和力进行结合。
使 dAb 连接至 IgG 上的环境随它们所融合的抗体链而异。当融合在 IgG 骨架的抗 体轻链的 C- 端末端处时， 预期每个 dAb 位于抗体铰链和 Fc 部分附近。这样的 dAb 的位置 可能彼此远离。在常规抗体中， Fab 片段之间的角度以及每个 Fab 片段和 Fc 部分之间的角 度可以存在非常显著的差异。对于 mAbdAb， Fab 片段之间的角度不可能存在很大差异， 同 时关于每个 Fab 片段和 Fc 部分之间的角度， 也可以观察到一些角度限制。
当融合在 IgG 骨架的抗体重链的 C- 端末端处时， 预期每个 dAb 位于 Fc 部分的 CH3 结构域附近。预期这不会影响 Fc 对 Fc 受体 ( 例如 FcγRI、 II、 III， FcRn) 的结合性质， 因 为这些受体会与 CH2 结构域 ( 对于 FcγRI、 II 和 III 类受体 ) 啮合， 或与 CH2 和 CH3 结构 域之间的铰链 ( 例如 FcRn 受体 ) 啮合。这样的抗原结合蛋白的另一个特征是， 预期两种 dAb 在空间上彼此靠近， 条件是， 通过提供适当的连接物来提供柔性， 这些 dAb 甚至可以形 成同源二聚体物质， 因此产生 Fc 部分的 ‘拉链样’ 四级结构， 这可以增强构建体的稳定性。
这样的结构考虑可以辅助选择最合适的位置， 以将表位 - 结合域 （例如 dAb） 连接 到蛋白骨架 （例如抗体） 上， 或连接到受体 -Fc 融合体上。
抗原大小、 其位置 ( 在血液中或在细胞表面上 )、 其四级结构 ( 单体或多聚体 结构 ) 可变化。因存在铰链区， 常规抗体无需特别设计就能作为衔接构建体 (adaptor construct) 起作用， 其中在 Fab 片段的末端的两个抗原结合位点的方向可大幅度地变化， 因此能适应抗原的分子特性及其环境。相比之下， 连接到抗体或其它蛋白骨架 ( 例如包含 无铰链区抗体的蛋白骨架 ) 上的 dAb 可能直接或间接地具有较小的结构柔韧性。
理解溶液状态和 Ab 的结合模式也是有帮助的。积累了很多证据表明， 体外 dAb 在 溶液中可主要以单体、 同源二聚体或多聚体形式存在 (Reiter 等人 , J Mol Biol (1999) 290: 685-698; Ewert 等人 , J Mol Biol (2003) 325: 531-553, Jespers 等人 , J Mol Biol (2004) 337: 893-903; Jespers 等人 , Nat Biotechnol (2004) 22: 1161-1165; Martin 等人 ,Protein Eng. (1997) 10: 607-614; Sepulvada 等人 , J Mol Biol (2003)333: 355-365)。这很容易让人联想到在体内观察到的 Ig 结构域的多聚体化事件， 例如 Bence-Jones 蛋白 ( 它们为免疫球蛋白轻链的二聚体 (Epp 等人 , Biochemistry (1975) 14: 4943-4952; Huan 等人 , Biochemistry (1994) 33: 14848-14857; Huang 等人 , Mol immunol (1997) 34: 1291-1301) 和淀粉样蛋白纤维 (James 等人 J Mol Biol. (2007) 367: 603-8) 。
例如， 可能希望使倾向于在溶液中二聚体化的结构域抗体与 Fc 部分的 C- 端末端 连接， 这优先于与轻链 C- 端末端或受体 -Fc 融合体的 N- 端末端连接， 因为与 Fc 的 C- 端末 端连接将使得那些 dAb 在本发明的抗原结合蛋白的背景下二聚体化。
本发明的抗原结合蛋白可包含对单一抗原具有特异性的抗原结合位点， 或可具 有对两种或更多种抗原具有特异性或对单一抗原上的两个或多个表位具有特异性的抗原 结合位点， 或可存在每一个都对相同或不同的抗原上的不同表位具有特异性的抗原结合位 点。
具体地， 本发明的抗原结合蛋白可以用于治疗与 TNFα 和 VEGF 有关的疾病， 例如 眼病， 例如糖尿病黄斑水肿、 囊样黄斑水肿、 葡萄膜炎、 AMD ( 年龄相关性黄斑变性 )、 脉络膜 新生血管 AMD、 地理性萎缩、 糖尿病视网膜病变、 视网膜静脉阻塞 (BRVO 和 / 或 CRVO) 和其 它黄斑病变和眼血管病变。
可以组合地施用来治疗任一种前述眼病 （具体地 AMD） 的具体的 TNFα 拮抗剂和 VEGF 拮抗剂如下。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 贝伐单抗。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ranibizumab。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 r84。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 aflibercept。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT01。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-050。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是阿达木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是贝 伐单抗。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ranibizumab。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 r84。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 aflibercept。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT01。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-050。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是英夫利昔单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是贝伐单 抗。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ranibizumab。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 r84。 在一个实施 方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 aflibercept。 在一个实施方 案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT01。在一个实施方案中， 所 述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 PRS-050。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 PRS-051。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂 是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那 西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT-322。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且 所述 VEGF 拮抗剂是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是依那西普， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是贝伐单 抗。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ranibizumab。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 r84。在一个实施 方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 aflibercept。在一个实施方 案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT01。在一个实施方案中， 所 述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 PRS-050。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮 抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 MP0112。 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ESBA105， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
在 一 个 实 施 方 案 中， 所 述 TNFα 拮 抗 剂 是 PEP1-5-19， 且 所 述 VEGF 拮 抗 剂 是 贝 伐 单 抗。 在 一 个 实 施 方 案 中， 所 述 TNFα 拮 抗 剂 是 PEP1-5-19， 且 所 述 VEGF 拮 抗 剂 是 ranibizumab。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 r84。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 aflibercept。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT01。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-050。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-19， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗剂是贝 伐单抗。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ranibizumab。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 r84。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗剂是 aflibercept。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT01。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-050。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-490， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂是贝 伐单抗。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ranibizumab。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 r84。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂是 aflibercept。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT01。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-050。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 PEP1-5-493， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是贝伐单抗。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且 所述 VEGF 拮抗剂是 ranibizumab。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 r84。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 aflibercept。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗 剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT01。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案 中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-26-593。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 PRS-050。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂 是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0010. 。在一个实施 方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 SEQ ID NO:2 的 adnectin， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 贝伐单抗。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ranibizumab。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 r84。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 aflibercept。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT01。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-050。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是戈利木单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 贝伐单抗。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ranibizumab。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 r84。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 aflibercept。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT01。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-050。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗 剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂 是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是塞妥珠单抗， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是贝伐单 抗。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ranibizumab。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 r84。在一个实 施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 aflibercept。在一个实 施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT01。在一个实施方案 中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案 中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-26-593。在一个实施方 案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 PRS-050。在一个实施方案 中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 MP0112。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ESBA903。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗 剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂 是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0010。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是 ALK-6931， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是贝伐单抗。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮 抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是ranibizumab。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 r84。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮 抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 aflibercept。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT01。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮 抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-10-11。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DOM15-26-593。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮 抗剂是 PRS-050。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 PRS-051。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 MP0112。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 CT-322。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包 含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 ESBA903。 在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻 链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0030。在一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 EPI-0010。在 一个实施方案中， 所述 TNFα 拮抗剂是包含 SEQ ID NO:30 的重链和 SEQ ID NO:31 的轻链 的抗体， 且所述 VEGF 拮抗剂是 DMS1571。
上述组合中的每一个也可以用于制备本发明的双靶向分子。 本发明的双靶向分子 的具体的且非限制性的实例如下 ： Fc 活化的 DMS4000 (SEQ ID NO:14 和 SEQ ID NO:12)、 Fc 有缺陷的 DMS4000 (SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO: 12)、 DMS4031 (SEQ ID NO: 16 和 SEQ ID NO:12)、 DOM-PEP 线内融合体 (SEQ ID NO:62)、 PEP-DOM 线内融合体 (SEQ ID NO: 64)、 具有选自 SEQ ID NO:69-72 的重链和 SEQ ID NO:12 的轻链的双靶向分子、 以及在 SED ID NO:72-140 中列出的那些。
通过用包含本发明的抗原结合蛋白的编码序列的表达载体转染宿主细胞， 可以生 产本发明的抗原结合蛋白。 通过将抗原结合蛋白的这些编码序列置于与常规的调节控制序 列的可操作关联下， 生产表达载体或重组质粒， 所述调节控制序列能够控制在宿主细胞中 的复制和表达和 / 或从宿主细胞的分泌。调节序列包括启动子序列， 例如 CMV 启动子和信 号序列， 其可以源自其它已知的抗体。类似地， 可以产生具有 DNA 序列的第二表达载体， 所 述 DNA 序列编码互补的抗原结合蛋白轻链或重链。在某些实施方案中， 除了所涉及的编码 序列和选择标记之外， 这种第二表达载体与第一表达载体相同， 以确保尽可能地有功能地 表达每条多肽链。 或者， 抗原结合蛋白的重链和轻链编码序列可以存在于单个载体上， 例如 在相同载体的 2 个表达盒中。
通过常规技术， 用第一载体和第二载体共转染选定的宿主细胞 （或仅用单个载体 转染） ， 以创建包含重组的或合成的轻链和重链的本发明的转染的宿主细胞。然后通过常 规技术， 培养转染的细胞， 以生产本发明的工程化的抗原结合蛋白。通过合适的试验， 例如 ELISA 或 RIA， 从培养物筛选包括重组重链和 / 或轻链的结合体的抗原结合蛋白。可以采用相似的常规技术， 构建其它抗原结合蛋白。
本领域技术人员可以选择适用于在本发明的方法和组合物构建中采用的克隆和 亚克隆步骤的载体。 例如， 可以使用常规的 pUC 克隆载体系列。 一种载体 pUC19 可从供应点 商业获得， 例如 Amersham (Buckinghamshire, United Kingdom) 或 Pharmacia (Uppsala, Sweden)。另外， 能够容易地复制的、 具有丰富的克隆位点和选择基因 （例如， 抗生素抗性） 并 且易于操作的任何载体， 可以用于克隆。因而， 克隆载体的选择不是本发明的限制因素。
通过适用于放大异源 DNA 序列的表达的基因， 例如， 哺乳动物二氢叶酸还原酶基 因 (DHFR)， 也可以表征表达载体。 其它载体序列包括 ： 聚腺苷酸 （poly A） 信号序列， 例如来 自牛生长激素 （BGH） 的， 以及 β 珠蛋白启动子序列 （betaglopro） 。通过本领域技术人员公 知的技术， 可以合成在本文中有用的表达载体。
这些载体的组件， 例如复制子、 选择基因、 增强子、 启动子、 信号序列等， 可以从商 业来源或天然来源获得， 或通过已知的方法合成， 用于指导重组 DNA 的产物在选定的宿主 中的表达和 / 或分泌。为了这个目的， 也可以选择其它合适的表达载体， 其中许多类型在本 领域已知用于哺乳动物、 细菌、 昆虫、 酵母和真菌表达。
本发明还包括用含有本发明的抗原结合蛋白的编码序列的重组质粒转染的细胞 系。对于这些克隆载体的克隆和其它操作而言有用的宿主细胞也是常规的。然而， 来自各 种大肠杆菌菌株的细胞可以用于克隆载体的复制和本发明的抗原结合蛋白的构建中的其 它步骤。 适用于表达本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞或细胞系包括 ： 哺乳动物细胞诸如 NS0、 Sp2/0、 CHO ( 例如 DG44)、 COS、 HEK、 成纤维细胞 ( 例如， 3T3) 和骨髓瘤细胞， 例如它们 可以在 CHO 或骨髓瘤细胞中表达。可以使用人细胞， 因而允许分子用人糖基化模式来修饰。 或者， 可以采用其它真核细胞系。 合适的哺乳动物宿主细胞的选择， 以及用于转化、 培养、 扩 增、 筛选和产物生产和纯化的方法， 是本领域已知的。参见， 例如， 以上引述的 Sambrook 等 人。
可以证明， 细菌细胞可用作宿主细胞， 其适合表达本发明的重组 Fab 或其它实施 方案 ( 参见， 例如， Plückthun, A., Immunol. Rev. (1992) 130: 151-188)。但是， 由于在 细菌细胞中表达的蛋白倾向于未折叠的形式或不正确地折叠的形式或非糖基化形式， 必须 筛选在细菌细胞中生产的任何重组 Fab， 以保留抗原结合能力。 如果细菌细胞表达的分子以 适当地折叠的形式产生， 该细菌细胞将是期望的宿主， 或者， 在替代性的实施方案中， 可以 在细菌宿主中表达分子， 然后进行重新折叠。例如， 用于表达的各种大肠杆菌菌株， 是生物 链霉菌属、 其它芽孢杆菌属等的各种菌株， 也 技术领域中公知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、 可以用于该方法中。
当希望时， 本领域技术人员已知的酵母细胞菌株也可用作宿主细胞， 以及昆虫 细胞 （例如果蝇和鳞翅目昆虫）和病毒表达系统。参见， 例如， Miller 等人 , Genetic Engineering (1986) 8: 277-298, Plenum Press 和其中引用的参考文献。
可以构建载体的一般方法、 生产本发明的宿主细胞所需的转染方法、 从这些宿主 细胞生产本发明的抗原结合蛋白所必需的培养方法， 都可以是常规技术。 通常， 本发明的培 养方法是无血清培养方法， 通常通过在悬浮液中无血清地培养细胞。同样地， 生产以后， 可 以根据本领域的标准方法， 从细胞培养物内容物纯化本发明的抗原结合蛋白， 所述方法包
括硫酸铵沉淀、 亲和柱、 柱色谱法、 凝胶电泳等。这些技术属于本领域技能， 不会限制本发 明。例如， 在 WO 99/58679 和 WO 96/16990 中描述了改变的抗体的制备。
表达抗原结合蛋白的又一个方法可以利用在转基因动物中的表达， 例如如美国专 利号 4,873,316 所述。这涉及利用动物的酪蛋白启动子的表达系统， 当其被转基因地掺入 哺乳动物中时， 允许雌性动物在它的奶中产生希望的重组蛋白。
在本发明的另一个方面， 提供了一种生产本发明的抗体的方法， 所述方法包括下 述步骤 ： 培养用编码本发明的抗体的轻链和 / 或重链的载体转化或转染的宿主细胞， 并回 收由此生产的抗体。
根据本发明， 提供了一种生产本发明的抗原结合蛋白的方法， 所述方法包括下述 步骤 ； (a) 提供一种载体， 所述载体包含编码所述抗原结合蛋白的多核苷酸 ； (b) 用所述载体转化哺乳动物宿主细胞 ( 例如 CHO) ； (c) 在有助于所述抗原结合蛋白从所述宿主细胞分泌进所述培养基中的条件下， 培养 步骤 (b) 的宿主细胞 ； (d) 回收步骤 (c) 的分泌的抗原结合蛋白。
根据本发明， 提供了一种生产本发明的抗原结合蛋白的方法， 所述方法包括下述步骤 ； (a) 提供编码抗原结合蛋白的重链的第一载体 ； (b) 提供编码抗原结合蛋白的轻链的第二载体 ； (c) 用所述第一载体和第二载体转化哺乳动物宿主细胞 （例如， CHO） ； (d) 在有助于所述抗原结合蛋白从所述宿主细胞分泌进所述培养基中的条件下， 培养 步骤 （c） 的宿主细胞 ； (e) 回收步骤 （d） 的分泌的抗原结合蛋白。
通过希望的方法表达以后， 然后使用合适的试验， 检查抗原结合蛋白的体外活性。 采用当前常规的 ELISA 试验形式来评估抗原结合蛋白与它的靶物的定性和定量结合。另 外， 也可以使用其它体外试验来证实中和效力， 然后进行的人类临床研究， 以评价抗原结合 蛋白在体内的持久性， 不考虑一般的清除机制。
治疗的剂量和持续时间与本发明的分子在人循环中的相对持续时间有关， 可以由 本领域技术人员根据要治疗的病症和患者的一般健康来调整。预见到， 可能需要在延长的 时间段 （例如， 四到六个月） 内的重复给药 （例如， 每周一次或每 2 周一次） 来实现最大治疗 效果。
本发明的治疗剂的给药模式可以是向宿主的眼递送药物的任何适合的途径。全 身给药可以足以递送有效量的本发明的抗原结合蛋白和药物组合物， 这是通过被动给药， 例如静脉内给药或皮下给药。本发明的抗原结合蛋白和药物组合物也可以更局部地递送 至眼， 这是通过局部施用例如滴眼剂或凝胶、 玻璃体内注射、 前眼房给药或眼周给药， 即经 由眼球后、 眼球周、 subtenon 或结膜下注射进行巩膜下给药， 或通过递送至下直肌、 上直肌 或外直肌。其它局部给药途径可以允许本发明的抗原结合蛋白和药物组合物在更低的剂 量更容易地到达眼的后段。已经描述， 在兔模型中局部施用会使抗体片段渗透至眼的后段 (Williams KA等人 , (2005))。 已经描述了抗体片段或完整的单克隆抗体的玻璃体内注射，且对于产品 ranibizumab 和贝伐单抗而言， 能够被 AMD 患者良好地耐受。
在一个实施方案中， 玻璃体内地施用 TNF 拮抗剂和 VEGF 拮抗剂。在一个实施方案 中， 玻璃体内地施用 VEGF 拮抗剂， 并通过其它局部给药方式 （例如也玻璃体内地或结膜下 地） 施用 TNF 拮抗剂， 具体地 ESBA105。在一个实施方案中， 玻璃体内地施用 TNF 拮抗剂， 且 局部地施用 VEGF 拮抗剂。
可能有用的是， 靶向递送抗原结合蛋白至眼的特定区域， 诸如眼的表面， 或泪小管 或泪腺， 或者可以进行眼内递送 ( 例如至眼的前房或后房， 诸如玻璃质液 )， 和递送至诸如 虹膜、 睫状体、 泪腺等眼结构。因此， 本发明另外提供了一种将组合物直接地递送至眼的方 法， 所述方法包括， 通过选自下述的方法， 给眼施用所述组合物 ： 眼内注射、 局部递送 ( 例如 滴眼剂 )、 眼周给药和使用缓释制剂。
也可能有用的是， 与眼渗透促进剂 （例如癸酸钠） 或与粘度增强剂 （例如羟丙基甲 基纤维素 (HPMC)） 一起， 将所述抗原结合蛋白递送至眼， 例如通过局部递送 ( 例如作为滴 眼剂 )。 因此， 本发明另外提供了用于例如向眼局部递送的组合物， 其包含 ： (a) 本发明的抗 原结合蛋白， 以及 (b) 眼渗透促进剂和 / 或 (c) 粘度增强剂。
通过玻璃体内的植入物， 也可以递送本发明的抗原结合蛋白和药物组合物。使用 专门的 23 至 26 计量注射针， 可以实现眼球后注射和眼球周注射， 且比玻璃体内注射具有 更少的侵害。Subtenon 注射会使所述组合物接触巩膜更长的时间， 这可以辅助穿透后眼。 已经描述了在兔模型中将蛋白注射在结膜之下紧邻处， 这允许分子更直接地跨巩膜扩散， 以到达眼的后段。
也可以使用持续释放药物递送系统， 其允许物质在更长的时间范围内释放进眼中 或眼周围， 所以可以以更低的频率给药。这样的系统包括胶束、 凝胶、 水凝胶、 纳米颗粒、 微胶囊或植入物， 它们可以填充或包被治疗组合物。通过注射， 或通过以前所述的任一种 其它更低侵害的途径 （即通过眼周或巩膜下途径） ， 可以将这些递送进眼的玻璃质中。这样 的持续释放系统和局部递送途径的实例包括 ： 热敏感的缓释水凝胶， 其用于巩膜下施用或 玻璃体内施用基于纳米颗粒的制剂， 该制剂靶向后视网膜和 RPE 层 (Janoira KG, 等人 , (2007) ； Birch DG (2007))。 递送系统和局部给药途径的许多其它组合是可能的， 且可以考 虑用于抗原结合蛋白的组合物和本发明的药物组合物。
在一个具体实施方案中， 通过玻璃体内注射， 玻璃体内地施用本发明的抗原结合 蛋白。在一个具体实施方案中， 每 4-8 周， 优选地每 6-8 周， 玻璃体内地施用本发明的抗原 蛋白， 具体地双靶向构建体。 在一个具体实施方案中， 通过结膜下注射， 施用抗原结合蛋白。 在一个具体实施方案中， 局部地施用本发明的抗原结合蛋白。 在另一个实施方案中， 经由持 续释放药物递送系统， 施用本发明的抗原结合蛋白。 在一个具体实施方案中， 经由静脉内注 射， 施用本发明的抗原结合蛋白。在一个具体实施方案中， 经由皮下注射， 施用本发明的抗 原结合蛋白。
在本发明的一个具体实施方案中， 所述抗原结合蛋白是 DMS4000 或由 SEQ ID NO:69、 70、 71 或 72 的重链序列和 SEQ ID NO:12 的轻链序列组成的抗原结合蛋白， 其每 4-8 周通过玻璃体内注射进行施用。
本发明的治疗剂可以制备成药物组合物， 其含有在药学上可接受的载体中的有效 量的本发明的抗原结合蛋白作为活性成分。在本发明的预防药中， 可以在生理 pH 缓冲水性混悬液或溶液， 其含有准备好注射的形式的抗原结合蛋白。用于肠胃外施用的组合物通常 包含溶于药学上可接受的载体 （例如水性载体） 中的本发明的抗原结合蛋白或其混合液的 溶液。可以使用多种水性载体， 例如， 0.9% 盐水、 0.3% 甘氨酸等。这些溶液可以制成无菌 的， 一般没有颗粒物质。 通过常规的公知的灭菌技术 （例如， 过滤） ， 可以将这些溶液灭菌。 组 合物可以含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质， 例如 pH 调节剂和缓冲剂等。 本发明的抗原结合蛋白在这种药物制剂中的浓度可以广泛地变化， 即， 从低于约 0.5%、 通常 在或至少约 1% 到多达 15 或 20%（按重量计算） ， 主要基于液体体积、 粘度等， 根据选定的特 定给药模式， 进行选择。
因而， 用于肌肉内注射的本发明的药物组合物可以制备成含有 1 mL 无菌缓冲 水， 和约 1 ng 至约 200 mg（例如约 50 ng 至约 30 mg 或更多、 或约 5 mg 至约 25 mg） 本 发明的抗原结合蛋白。类似地， 用于静脉内输注的本发明的药物组合物可以制备成含有 约 250 ml 无菌林格氏溶液， 和约 1 至约 30 或约 5 mg 至约 25 mg 本发明的抗原结合蛋 白 /ml 林格氏溶液。用于制备肠胃外施用的组合物的实际方法是公知的， 或者对于本 领域技术人员而言是显而易见的， 更详细地描述在， 例如， Remington's Pharmaceutical Science, 第 15 版 , Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania。关于静脉内 施用的本发明抗原结合蛋白制剂的制备， 参见 ： Lasmar U 和 Parkins D“The formulation of Biopharmaceutical products” , Pharma. Sci.Tech.today, 第 129-137 页 , 第 3 卷 (2000 年 4 月 3 日 ) ； Wang, W “Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals” , Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188; Stability of Protein Pharmaceuticals A 部 和 B 部， Ahern T.J., Manning M.C. 编 , New York, NY: Plenum Press (1992) ； Akers,M.J. “Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations” , J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300; Imamura, K 等人 “Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state” , J Pharm Sci 92 (2003) 266-274; Izutsu, Kkojima, S. “Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying” , J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039; Johnson, R, “Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization” , J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922; 和 Ha, E Wang W, Wang Y.J.“Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability” , J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)， 它们的所有内容通过 引用并入本文， 并向读者特别地提及。
在一个实施方案中， 当在药物制品中时， 本发明的治疗剂以单位剂量形式存在。 本领域技术人员可容易地确定合适的治疗有效剂量。根据患者的体重， 可以为患者计算 合适的剂量， 例如合适的剂量可以是在下述范围内 ： 0.00001-20mg/kg， 例如 0.0001-20mg/ kg， 例如 0.1-20mg/kg， 例如 1-20mg/kg 或例如 1-15mg/kg， 例如 10-15mg/kg。为了有效地 治疗本发明适用的人类病症， 合适的剂量可以是在下述范围内的本发明的抗原结合蛋白 ： 0.0001-1000 mg， 例 如 0.001-1000mg， 例 如 0.01-500mg， 例 如 500mg， 例 如 0.1-100mg 或 0.1-80mg 或 0.1-60mg 或 0.1-40mg 或例如 1-100mg 或 1-50mg， 其可以肠胃外地 （例如皮下 地、 静脉内地或肌肉内地） 或局部地施用。如果必要， 可以按照医师酌情选择的合适时间间 隔， 重复这种剂量。在要将治疗剂直接地施用进眼中 （例如通过玻璃体内注射） 的情况下， 优选地， 所 述剂量应当使得， 施用给每只人眼的蛋白总量不超过 2 mg。 在一个实施方案中， 施用给单只 人眼的蛋白总量是大约 2 mg。在一个实施方案中， 施用给单只人眼的蛋白总量是大约 1.8 mg。 在一个实施方案中， 施用给单只人眼的蛋白总量是大约 1.6 mg。 在一个实施方案中， 施 用给单只人眼的蛋白总量是大约 1.4 mg。在一个实施方案中， 施用给单只人眼的蛋白总量 是大约 1.2 mg。在一个实施方案中， 施用给单只人眼的蛋白总量是大约 1.0 mg。在一个实 施方案中， 施用给单只人眼的蛋白总量是小于 2.0 mg、 小于 1.8 mg、 小于 1.6 mg、 小于 1.4 mg、 小于 1.2 mg 或小于 1.0 mg。
可以低压冻干本文所述的抗原结合蛋白进行保存， 并在使用前在适合的载体中重 构。 已经证实， 这种技术对于常规的免疫球蛋白是有效的， 且可以采用本领域已知的低压冻 干法和重构技术。
存在几种本领域已知的方法， 它们可以用于找到在本发明中使用的表位 - 结合 域。
术语 “文库” 表示异质多肽或核酸的混合物。文库由成员组成， 每个成员具有单个 多肽或核酸序列。就这一方面而言， “文库” 与 “所有组分” 同义。文库成员之间的序列差异 是造成文库中存在多样性的原因。文库可呈简单的多肽或核酸的混合物的形式， 或可呈用 核酸文库转化的生物体或细胞的形式， 例如细菌、 病毒、 动物或植物细胞等等。在一个实例 中， 每一个单独的生物体或细胞仅含有一个或有限个数的文库成员。 有利的是， 为了表达由 核酸编码的多肽， 将所述核酸整合进表达载体中。因此， 在一个方面， 文库可呈宿主生物体 群体的形式， 每一生物体含有表达载体的一个或多个拷贝， 所述表达载体含有核酸形式的 单个文库成员， 其可被表达以产生它的对应的多肽成员。 因此， 宿主生物体群体具有编码多 种多肽的众多所有组分的可能性。
“通用框架”是这样的单个抗体框架序列 ： 其对应着在 Kabat 所定义的序列 (“Sequences of Proteins of Immunological Interest” , 美国卫生和人类服务部 ) 中 保守的抗体区域， 或对应着 Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol. (1987) 196: 910-917 所定 义的人种系免疫球蛋白所有组分或结构。可以存在单个框架或一组这样的框架， 业已发现 它们可衍生出几乎任意的结合特异性， 尽管只在高变区中变化。
在一个实施方案中， 用算法 BLAST 2 Sequences， 使用缺省参数 (Tatusova, T. A. 等人 , FEMS Microbiol Lett, (1999) 174: 187-188)， 制备并测定本文所定义的氨基 酸和核苷酸序列比对和同源性、 相似性或同一性。
当在本文所述方法中使用展示系统 ( 例如联系核酸的编码功能与核酸编码的肽 或多肽的功能特性的展示系统 ) 时， 例如选择 dAb 或其它表位结合域时， 通常有利的是扩增 或增加编码所选择的肽或多肽的核酸的拷贝数。这提供了有效方法来获得足够量核酸和 / 或肽或多肽， 以用于通过本文所述方法或其它合适的方法进行另外轮次的选择， 或用于制 备另外的谱 ( 例如亲和力成熟谱 )。因此， 在某些实施方案中， 选择表位结合域的方法包括 使用展示系统 ( 例如联系核酸的编码功能和核酸编码的肽或多肽的功能特性的展示系统， 例如噬菌体展示 )， 并另外包括扩增或增加编码所选择的肽或多肽的核酸的拷贝数。 可用任 何合适的方法例如通过噬菌体扩增、 细胞生长或聚合酶链式反应扩增核酸。
在一个实例中， 所述方法采用联系核酸编码功能和核酸编码的多肽的物理、 化学和 / 或功能特性的展示系统。这样的展示系统可包含多个可复制的遗传包 (genetic package)， 例如噬菌体或细胞 ( 细菌 )。展示系统可包含文库， 例如噬菌体展示文库。噬菌 体展示是展示系统的实例。
业已阐述多种合适的噬菌体展示系统 ( 例如单价展示和多价展示系统 ) ( 参 见， 例如，Griffiths 等人 , 美国专利号 6,555,313 B1 ( 通过引用并入本文 ) ； Johnson 等人 , 美国专利号 5,733,743 ( 通过引用并入本文 ) ； McCafferty 等人 , 美国专利号 5,969,108 ( 通过引用并入本文 ) ； Mulligan-Kehoe, 美国专利号 5,702,892 ( 通过引用 并入本文 ) ； Winter, G. 等人 , Annu. Rev. Immunol.(1994) 12 : 433-455; Soumillion, P. 等人 , Appl. Biochem. Biotechnol. (1994) 47(2-3): 175-189; Castagnoli, L. 等 人 , Comb. Chem.High Throughput Screen (2001) 4(2): 121-133)。在噬菌体展示系统中 展示的肽或多肽可在任何合适的噬菌体上展示， 举例而言， 所述细菌噬菌体例如丝状噬菌 体 ( 例如 fd、 M13、 F1)、 裂解性噬菌体 ( 例如 T4、 T7、 λ) 或 RNA 噬菌体 ( 例如 MS2)。
通常产生或提供展示作为含合适噬菌体衣壳蛋白 ( 例如 fd pIII 蛋白 ) 的融合蛋 白的肽或噬菌体多肽的谱的噬菌体文库。 融合蛋白可在噬菌体衣壳蛋白的末端或若需要在 内部位置展示肽或多肽。例如， 被展示的肽或多肽可存在于 pIII 的氨基末端到结构域 1 的 位置。(pIII 的结构域 1 也被称为 N1)。可将被展示的多肽直接融合到 pIII ( 例如 pIII 的结构域 1 的 N- 末端 )， 或用接头融合到 pIII。若有需要， 融合体可进一步包含标签 (tag) ( 例如 myc 表位、 His 标签 )。用任何合适的方法可产生包含作为含噬菌体衣壳蛋白的融 合蛋白展示的肽谱或多肽谱的文库， 例如通过将编码被展示的肽或多肽的噬菌体载体或噬 菌粒载体的文库引入到合适的宿主细菌， 并培养所得到的细菌以产生噬菌体 ( 例如若有需 要， 则用合适的辅助噬菌体或补充质粒 (complementing plasmid))。可用任何合适的方法 ( 例如沉淀和离心 ) 从培养物回收噬菌体文库。
展示系统可包含含有任何所需多样性量的肽谱或多肽谱。例如， 所述谱可含有具 有对应于由一种生物体、 一组生物体、 所需组织或所需细胞类型表达的天然存在多肽的氨 基酸序列的肽或多肽， 或可含有具有随机或随机化氨基酸序列的肽或多肽。 若有需要， 多肽 可享有共同核心或骨架。例如， 谱或文库中的所有多肽可基于选自以下的骨架 ： 蛋白 A、 蛋 白 L、 蛋白 G、 纤连蛋白结构域、 anticalin、 CTLA4、 所需酶 ( 例如聚合酶、 纤维素酶 ) 或来自 免疫球蛋白超家族的多肽， 例如抗体或抗体片段 ( 例如抗体可变结构域 )。在谱或文库中 的多肽可包含随机或随机化氨基酸序列的限定区及共有氨基酸序列的区。在某些实施方 案中， 谱中所有或基本上所有多肽为所需类型， 例如所需的酶 ( 例如聚合酶 ) 或所需的抗体 的抗原结合片段 ( 例如人 VH 或人 VL)。在某些实施方案中， 多肽展示系统包含多肽谱， 其中 每一个多肽包含抗体可变结构域。例如， 谱中的每一个多肽可含有 VH、 VL 或 Fv ( 例如单链 Fv)。
可用任何合适的方法将氨基酸序列多样性引入到肽或多肽或骨架的任何所需区 域中。例如， 可通过用任何合适的诱变方法 ( 例如低保真度 PCR、 寡核苷酸介导的诱变或定 点诱变、 用 NNK 密码子多样化 ) 或任何其它合适的方法制备编码多样化的多肽的核酸文库， 来将氨基酸序列多样性引入靶区域， 例如抗体可变结构域的互补决定区或疏水结构域。若 有需要， 可使待多样化的多肽区域随机化。 构成谱的多肽的大小是主要的选择问题， 多肽大 小不必一致。谱中的多肽可具有至少三级结构 ( 即形成至少一个结构域 )。选择 / 分离 / 回收 可用任何合适的方法从谱或文库 ( 例如在展示系统中 ) 选择、 分离和 / 或回收表位 结合域或结构域群。例如， 基于选择特性 ( 例如物理特性、 化学特性、 功能特性 ) 来选择或 分离结构域。合适的选择性功能特性包括谱中的肽或多肽的生物活性， 例如结合通用配体 ( 例如超抗原 )、 结合靶配体 ( 例如抗原、 表位、 底物 )、 结合抗体 ( 例如通过在肽或多肽上表 达的表位 ) 和催化活性。( 参见例如，Tomlinson 等人 , WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655)。
在某些实施方案中， 从基本上所有结构域共享共同的选择性特征的肽或多肽文库 或谱中选择和 / 或分离蛋白酶抗性肽或多肽。例如， 结构域可选自其中基本上所有结构域 具有以下特征的文库或谱 ： 结合共同的通用配体、 结合共同的靶配体、 结合共同抗体 ( 或被 共同抗体结合 ) 或拥有共同的催化活性。该选择类型尤其可用于制备基于具有所需生物活 性的母体肽或多肽的结构域谱， 例如当实施免疫球蛋白单一可变结构域的亲和力成熟时。 基于结合共同通用配体的选择可产生含有作为原始文库或谱组分的所有或基本上所有结 构域的结构域集或群。例如， 可通过淘选或用合适的亲和基质选择、 分离和 / 或回收结合靶 配体或通用配体 ( 例如蛋白 A、 蛋白 L 或抗体 ) 的结构域。可通过将配体 ( 例如通用配体、 靶配体 ) 溶液加入到合适的容器 ( 例如试管、 培养皿 ) 中并使配体沉积或覆盖在容器壁上 来实施淘选。 可洗掉过量配体， 可将结构域加到容器中， 并将容器保持在适于肽或多肽结合 固定化配体的条件下。可洗掉未结合的结构域， 并可例如用任何合适的方法 ( 例如刮擦或 降低 pH) 来回收结合的结构域。 合适的配体亲和基质通常含有配体共价或非共价连接其上的固相支持体或珠粒 ( 例如琼脂糖 )。可在适用于使结构域与基质上的配体结合的条件下用批处理、 柱处理或任 何其它合适的处理使亲和基质与肽或多肽 ( 例如业已与蛋白酶温育的谱 ) 结合。可洗掉不 结合亲和基质的结构域， 用任何合适的方法洗脱并回收已结合的结构域， 例如用较低 pH 的 缓冲液、 用温和变性剂 ( 例如尿素 ) 或用竞争结合配体的肽或结构域洗脱。在一个实例中， 在适用于使谱中的结构域与靶配体结合的条件下让生物素化的靶配体与谱结合。 用固定化 ( 例如在珠粒上 ) 的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素回收已结合的结构域。
在某些实施方案中， 通用配体或靶配体是抗体或其抗原结合片段。与在文库或谱 的肽或多肽中基本上保守的肽或多肽的结构特征结合的抗体或抗原结合片段尤其可用作 通用配体。适于用作分离、 选择和 / 或回收蛋白酶抗性肽或多肽所用的配体的抗体和抗原 结合片段可为单克隆或多克隆的， 并可用任何合适的方法制备。
文库 / 所有组分 可用任何合适的方法制备或获得编码和 / 或含有表位结合域的文库。可设计文库以编 码基于目标结构域或骨架 ( 例如选自文库的结构域 ) 的结构域， 或可用本文所述方法从另 一文库中选择文库。例如， 可用合适的多肽展示系统来制备富含结构域的文库。
可用任何合适的方法容易地产生编码所需结构域类型的所有组分的文库。例如， 可获得编码所需多肽类型 ( 例如免疫球蛋白可变结构域 ) 的核酸序列， 并且可例如通过用 易错的聚合酶链式反应 (PCR) 系统扩增核酸、 通过化学诱变 (Deng 等人 ,J. Biol. Chem. ,
269:9533 (1994)) 或用细菌增变株 (Low 等人 ,J. Mol. Biol. , 260:359 (1996)) 来制备 每一个含有一个或多个突变的核酸集合。在其它实施方案中， 为了多样化可以特定的核酸区作为靶标。用于在所选择的位 置进行突变的方法在本领域亦众所周知， 包括例如在用或不用 PCR 时使用错配的寡核苷酸 或简并的寡核苷酸。例如， 通过将突变靶向抗原结合环来产生合成的抗体文库。业已将随 机或半 - 随机抗体 H3 和 L3 区添加到种系免疫球蛋白 V 基因区段， 以产生含未突变框架区 的大文库 (Hoogenboom 和 Winter (1992) 同上 ; Nissim 等人 (1994) 同上 ; Griffiths 等人 (1994) 同上 ; DeKruif 等人 (1995) 同上 )。业已将所述多样性延伸到包括某些或 所有其它抗原结合环 (Crameri 等人 Nature Med. (1996) 2: 100; Riechmann 等人 Bio/ Technology (1995) 13: 475; Morphosys, WO 97/08320, 同上 )。在其它实施方案中， 为 了多样化可通过例如采用第一 PCR 产物为 “大引物 (mega-primer)” 的两步 PCR 策略来靶向 核酸的特定区 ( 参见， 例如，Landt, O. 等人 , Gene (1990) 96: 125-128)。例如通过 SOE PCR 也可完成靶向的多样化 ( 参见， 例如， Horton, R.M. 等人 ,Gene (1989)77 : 61-68)。
可通过改变确定多肽序列的编码序列致使可将许多可能的氨基酸 ( 例如所有 20 种氨基酸或其子集 ) 引入到该位置来实现在所选位置的序列多样性。用 IUPAC 命名法， 最 多能的密码子是 NNK， 其编码所有氨基酸以及 TAG 终止密码子。 可使用 NNK 密码子以引入所 需多样性。也使用达到同样目的的其它密码子， 包括 NNN 密码子， 该密码子导致产生另外的 终止密码子 TGA 和 TAA。这样的靶向方法可使得靶区域的全序列范围得到探索。
某些文库包含作为免疫球蛋白超家族成员 ( 例如抗体或其部分 ) 的结构域。 例如， 文库可包含具有已知主链构象的结构域 ( 参见， 例如， Tomlinson 等人 , WO 99/20749)。
可在合适的质粒或载体中制备文库。本文所用载体指分离的元件 (discrete element)， 其用于将异源 DNA 引入到细胞中用于表达和 / 或其复制。可使用任何合适的载 体， 包括质粒 ( 例如细菌质粒 )、 病毒或噬菌体载体、 人工染色体和游离型载体。 这样的载体 可用于简单克隆和诱变， 或表达载体可用于驱动文库表达。载体和质粒通常含有一个或多 个克隆位点 ( 例如多接头 )、 复制起始点和至少一个选择标记基因。 表达载体可进一步含有 驱动多肽转录及翻译的元件， 例如增强子元件、 启动子、 转录终止信号、 信号序列等等。 可以 以使其可操作地连接编码多肽的克隆插入物的方式排列这些元件， 由此当所述表达载体保 持在适于表达的条件下 ( 例如在合适的宿主细胞中 ) 时可表达并产生所述多肽。
克隆载体和表达载体通常含有使得所述载体可在一个或多个所选择的宿主细胞 中复制的核酸序列。在克隆载体中， 通常该序列为能使得载体独立于宿主染色体 DNA 复制 的序列， 包括复制起始点或自主复制序列。 对于多种细菌、 酵母和病毒， 所述序列众所周知。 来自质粒 pBR322 的复制起始点适用于大部分革兰氏阴性细菌， 2 微米质粒起始适用于酵母 菌， 各种病毒复制起始点 ( 例如 SV40、 腺病毒 ) 可用于在哺乳动物细胞中克隆载体。除非 在哺乳动物细胞 ( 例如 COS 细胞 ) 中使用的复制起始点能够复制高水平 DNA， 否则哺乳动物 表达载体通常不需要复制起始点。
克隆载体或表达载体可含有也被称为选择标记的选择基因。 此类标记基因编码使 转化的宿主细胞在选择培养基中存活或生长必不可少的蛋白质。因此， 未用含有选择基因 的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。 典型的选择基因编码的蛋白赋予抗生素及 其它毒素 ( 例如氨苄青霉素 (ampicillin)、 新霉素 (neomycin)、 甲氨蝶呤 (methotrexate) 或四环素 (tetracycline)) 抗性， 互补的营养缺陷或提供在生长培养基中不能获得的关键 营养素。合适的表达载体可含有多种组分， 例如复制起始点、 选择标记基因、 诸如转录调控 元件 ( 例如启动子、 增强子、 终止子 ) 等一种或多种表达调控元件和 / 或一种或多种翻译信 号、 信号序列或前导序列等。 若存在， 表达调控元件和信号序列或前导序列可由载体或其它 来源提供。例如， 编码抗体链的已克隆的核酸的转录和 / 或翻译调控序列可用于指导表达。
可提供启动子用于在所需宿主细胞中进行表达。启动子可为组成型或诱导型。例 如， 可让启动子可操作地连接编码抗体、 抗体链或其部分的核酸， 致使其指导该核酸转录。 可利用多种适用于原核宿主的启动子 ( 例如用于大肠杆菌的 β- 内酰胺酶和乳糖启动子系 统、 碱性磷酸酶、 色氨酸 (trp) 启动子系统、 lac、 tac、 T3、 T7 启动子 ) 和真核宿主的启动子 ( 例如 , 猴肾病毒 40 早期或晚期启动子、 劳氏肉瘤病毒长末端重复启动子、 巨细胞病毒启 动子、 腺病毒晚期启动子、 EG-1a 启动子 )。
另外， 表达载体通常包含用于选择携带载体的宿主细胞的选择标记， 并在可复制 的表达载体情况下包含复制起点。 编码赋予抗生素或药物抗性的产物的基因为常用选择标 记， 可用于原核细胞 ( 例如 β- 内酰胺酶基因 ( 氨苄青霉素抗性 )、 四环素抗性的 Tet 基因 ) 和真核细胞 ( 例如新霉素 (G418 或遗传霉素 (geneticin))、 gpt ( 霉酚酸 )、 氨苄青霉素或 潮霉素 (hygromycin) 抗性基因 )。二氢叶酸还原酶标记基因使得可用甲氨蝶呤在多种宿 主中选择。在酵母中通常将编码宿主的营养缺陷型标记物的基因产物的基因 ( 例如 LEU2、 URA3、 HIS3 ) 用作选择标记。还涵盖使用病毒 ( 例如杆状病毒 ) 或噬菌体载体和能够整合 到宿主细胞基因组的载体 ( 例如逆转录病毒载体 )。
适用于在原核细胞 ( 例如细菌细胞， 例如大肠杆菌 ) 或哺乳动物细胞中表达的表 达载体包括例如 ： pET 载体 ( 例如， pET-12a、 pET-36、 pET-37、 pET-39、 pET-40， Novagen 等 )、 噬菌体载体 ( 例如 pCANTAB 5 E, Pharmacia)、 pRIT2T ( 蛋白 A 融合载体 , Pharmacia)、 pCDM8 、 pCDNA1.1/amp 、 pcDNA3.1 、 pRc/RSV 、 pEF-1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 、 pCMV-SCRIPT、 pFB、 pSG5、 pXT1 (Stratagene, La Jolla, CA)、 pCDEF3 (Goldman, L.A., 等人 ,Biotechniques ,21 :1013-1015 (1996))、 pSVSPORT (GibcoBRL, Rockville, MD)、 pEF-Bos (Mizushima, S.,等人 , Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322) 等。 可利用适用 于不同表达宿主的表达载体， 所述不同表达宿主例如原核细胞 ( 大肠杆菌 )、 昆虫细胞 ( 果 蝇 (Drosophila Schnieder ) S2 细胞 , Sf9)、 酵母 ( 甲醇毕赤酵母 (P. methanolica )、 巴斯 德毕赤酵母 (P. pastoris )、 酿酒酵母 (S. cerevisiae )) 细胞和哺乳动物细胞 ( 例如 COS 细胞 )。
载体的某些实例为能使对应于多肽文库成员的核苷酸序列表达的表达载体。因 此， 可通过让表达多肽文库成员的单个克隆单独增殖并表达来进行用通用配体和 / 或靶配 体的选择。如上所述， 特定的选择展示系统为噬菌体展示。因此， 可使用噬菌体或噬菌粒 载体， 例如， 载体可为具有大肠杆菌复制起始点 ( 用于双链复制 ) 以及此外的噬菌体复制 起始点 ( 用于产生单链 DNA) 的噬菌粒载体。所述载体的操作及表达在本领域众所周知 (Hoogenboom 和 Winter (1992) 同上 ; Nissim 等人 (1994) 同上 )。简而言之， 载体可含 有 β- 内酰胺酶基因以赋予噬菌粒选择性， 并含有表达盒上游的 lac 启动子， 所述表达盒 可含有合适的前导序列、 多个克隆位点、 一个或多个肽标签、 一个或多个 TAG 终止密码子和 噬菌体蛋白 pIII。因此， 用各种大肠杆菌阻抑菌株和非阻抑菌株并加入葡萄糖、 异丙基硫 代 -β-D- 半乳糖苷 (IPTG) 或辅助噬菌体 ( 例如 VCS M13)， 载体能够作为不表达而只产生大量的多肽文库成员的质粒进行复制， 或作为生产噬菌体进行复制， 所述生产噬菌体中某 些在其表面含有多肽 -pIII 融合体的至少一个拷贝。
抗体可变结构域可包含靶配体结合位点和 / 或通用配体结合位点。在某些实施方 案中， 通用配体结合位点为超抗原 ( 例如蛋白 A、 蛋白 L 或蛋白 G) 的结合位点。可变结构 域可基于任何所需的可变结构域， 例如人 VH ( 例如 VH1a、 VH1b、 VH2、 VH3、 VH4、 VH5、 VH6)、 人 Vλ ( 例如 VλI、 VλII、 VλIII、 VλIV、 VλV、 VλVI 或 Vκ1) 或人 Vκ ( 例如 Vκ2、 Vκ3、 Vκ4、 Vκ5、 Vκ6、 Vκ7、 Vκ8、 Vκ9 或 Vκ10)。
另一类技术涉及选择人工隔室 (artificial compartment) 的所有组分， 所述人工 隔室使得基因可与其基因产物相连接。例如， 可在由油包水乳剂形成的微胶囊中选择编码 所需基因产物的核酸的选择系统阐述于 WO99/02671、 WO00/40712 和 Tawfik & Griffiths Nature Biotechnol (1998) 16(7): 652-6 中。可将编码具有所需活性的基因产物的遗传 元件分区到微胶囊中， 然后在微胶囊内转录和 / 或翻译以产生其各自的基因产物 (RNA 或蛋 白质 )。随后挑选产生具有所需活性的基因产物的遗传元件。本方法通过经由多种手段检 测所需活性来选择目的基因产物。
表位结合域的表征 可通过为本领域技术人员所熟悉的方法检测结构域与其特异性抗原或表位的结合， 所 述方法包括 ELISA。在一个实例中， 用单克隆噬菌体 ELISA 检测结合。
可按照任何合适程序实施噬菌体 ELISA ： 以下提出例示性方案。
可通过 ELISA 针对所选择的抗原或表位的结合情况来筛选每一轮选择产生的噬 菌体群， 以鉴定 “多克隆” 噬菌体抗体。然后可通过 ELISA 筛选来自这些群中的单个受感染 的细菌菌落的噬菌体， 以鉴定 “单克隆” 噬菌体抗体。也期需针对与抗原或表位的结合情况 来筛选可溶性抗体片段， 这还可通过 ELISA 用例如针对 C- 或 N- 末端标签的试剂来进行 ( 参 见例如 Winter等人 Ann. Rev. Immunology (1994) 12: 433-55 和其中引用的参考文献 )。
通过 PCR 产物的凝胶电泳 (Marks 等人 1991, 同上 ; Nissim 等人 1994 同上 )、 用 探针探测 (Tomlinson等人 , 1992) J. Mol. Biol. 227, 776)、 或通过对载体 DNA 测序、 或 通过用常见的切割酶 （诸如 BSTNI） 进行限制酶切消化分析， 也可以评估所选择的噬菌体单 克隆抗体的多样性。
dAb 的结构 在例如用本文所述噬菌体展示技术从所选择的 V- 基因所有组分选择 dAb 的情况下， 这 些可变结构域包含通用框架区， 由此可以通过本文所定义的特定通用配体来识别它们。通 用框架区、 通用配体等的使用阐述于 WO99/20749 中。
当使用 V- 基因所有组分时， 多肽序列中的变化可位于可变结构域结构环内。任一 可变结构域的多肽序列可通过 DNA 改组或通过突变来改变， 致使提高每一可变结构域与其 互补对的相互作用。 DNA 改组为本领域所知， 由例如 Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 和美国专利号 6,297,053 教导， 它们通过引用并入本文。其它诱变方法为本领域技术人员 所熟知。
用于构建 dAb 的骨架 i. 选择主链构象 免疫球蛋白超家族成员在其多肽链方面都共享相似的折叠。例如， 尽管抗体就其一级序列而言高度不同， 但与预期的相反， 序列比较和晶体结构显示抗体的 6 个抗原结合环中 的 5 个 (H1、 H2、 L1、 L2、 L3) 采用少数主链构象或规范结构 (Chothia 和 Lesk J. Mol. Biol. (1987) 196: 901; Chothia 等人 Nature (1989) 342: 877)。因此， 环长度及关键残基分 析使得可预测在大部分人抗体中存在的 H1、 H2、 L1、 L2 和 L3 的主链构象 (Chothia 等人 J. Mol. Biol. (1992) 227: 799; Tomlinson 等人 EMBO J. (1995) 14: 4628; Williams 等 人 J. Mol. Biol. (1996) 264: 220)。尽管就序列、 长度及结构 ( 由于使用 D 区段 ) 而言 H3 区更多样， 但其由于环长度短而同样形成少数主链构象， 这要视长度及环中及抗体框架 中关键位置的特定残基的存在情况或残基类型而定 (Martin 等人 J. Mol. Biol. (1996) 263: 800; Shirai 等人 FEBS Letters (1996) 399: 1)。
有利地的是， 从结构域文库 ( 例如 VH 结构域文库和 / 或 VL 结构域文库 ) 组装 dAb。 在一个方面， 对结构域文库进行设计， 其中选择某些环长度和关键残基以确保成员的主链 构象是已知的。 有利的是， 为了使其无功能的几率最小化， 它们是在自然界发现的免疫球蛋 白超家族分子的真正构象， 其如上所述。种系 V 基因区段用作一个合适的基本框架用于构 建抗体或 T- 细胞受体文库 ； 其它序列也有用。可以以低频率发生变化， 以使少数功能成员 可拥有改变的主链构象， 所述构象并不影响其功能。
规范结构理论还可用于评估由配体编码的不同的主链构象的数量， 以基于配体序 列预测主链构象， 并为多样化选择不影响规范结构的残基。已知在人 Vκ 结构域中， L1 环可 采用 4 种规范结构中的 1 种， L2 环具有单一的规范结构， 对于 L3 环 90% 的人 Vκ 结构域采 用 4 种或 5 种规范结构中的 1 种 (Tomlinson 等 (1995) 见上述 ) ； 因此， 在单独的 Vκ 结构 域中， 不同的规范结构可联合以产生一系列不同的主链构象。已知 Vλ 结构域编码 L1、 L2 和 L3 环的一系列不同的规范结构， 且 Vκ 和 Vλ 结构域可与可编码 H1 和 H2 环的若干规范 结构的任何 VH 结构域配对， 那么在这 5 种环中观察到的规范结构组合的数目将极大。这表 明主链构象多样性的产生对于产生大范围的结合特异性可能是必需的。然而， 通过基于单 一已知主链构象构建抗体文库， 业已发现与预期相反， 对于产生足以靶向基本上所有抗原 的多样性并不需要主链构象多样性。甚至更意想不到的是， 单一主链构象不必为共有结构 – 单一天然存在的构象可用作整个文库的基础。因此， 在一个特别的方面， dAb 拥有单一 的已知主链构象。
所选择的单一主链构象可以是所考虑的免疫球蛋白超家族类型分子中的普通的 一种。当观察到大量天然存在的分子采用该构象时， 所述构象就是普通构象。因此， 在一个 方面， 单独考虑对于免疫球蛋白结构域的每一结合环的不同主链构象的天然存在情况， 然 后为不同环选择天然存在的可变结构域， 所述可变结构域拥有所期需的主链构象组合。如 果没有一个可以利用， 那么可选择最接近的等同物。可通过选择编码所需主链构象的种系 基因区段来产生对于不同环的所期需的主链构象组合。在一个实例中， 所选择的种系基因 区段在自然界中频繁表达， 具体而言， 在所有天然种系基因区段中它们可能是最频繁地表 达。
在设计文库的过程中， 可以单独考虑对于 6 个抗原结合环中的每一个的不同的主 链构象发生率。 对于 H1、 H2、 L1、 L2 和 L3， 选择 20%-100% 的天然存在的分子的抗原结合环所 采用的既定构象。通常， 其观察到的发生率超过 35% ( 即 35% 至 100% 之间 )， 理想情况为超 过 50% 或甚至超过 65%。由于绝大多数 H3 环不具有规范结构， 因而优选选择在这些不展示规范结构的环中普通的主链构象。 因此， 对于每一种环， 选择在天然所有组分中最经常观察 到的构象。在人抗体中， 对于每一种环而言最普遍的规范结构 (CS) 如下 ： H1-CS 1 (79% 所 表达的所有组分 )、 H2 - CS 3 (46%)、 L1 - CS 2 Vκ(39%)、 L2 - CS 1 (100%)、 L3 - CS 1 Vκ(36%) ( 计算假设 κ:λ 比率为 70:30, Hood等人 , Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. (1967) 48: 133)。对于具有规范结构的 H3 环， 在第 94 位残基 - 第 101 位残基含有 盐桥的长 7 个残基的 CDR3 (Kabat等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 美国卫生和人类服务部 ) 似乎是最普遍的。在 EMBL 数据库中有至少 16 种人抗 体序列含有形成该构象所需的 H3 长度和关键残基， 在用作抗体建模的基础的蛋白质数据 库中有至少两种晶体结构 (2cgr 和 1tet)。规范结构的这种组合的最频繁表达的种系基因 区段为 VH 区段 3-23 (DP-47)、 JH 区段 JH4b、 Vκ 区段 O2/O12 (DPK9) 和 Jκ 区段 Jκ1。VH 区 段 DP45 和 DP38 也是合适的。因此， 可将这些区段组合用作构建具有所期需单一主链构象 的文库的基础。
或者， 代替基于处于孤立状态的每一结合环的不同的主链构象的天然发生率来选 择单一主链构象， 将主链构象组合的天然发生率作为用于选择单一主链构象的基础。 例如， 在抗体情况下， 可确定对于抗原结合环中的任何两个、 三个、 四个、 五个或所有六个的规范 结构组合的自然发生率。此时所选择的构象可为天然存在的抗体中的普通构象， 并且可在 天然所有组分中最经常地观察到。因此， 例如在人抗体中， 当考虑 5 种抗原结合环 H1、 H2、 L1、 L2 和 L3 的天然组合时， 确定规范结构的最频繁的组合， 然后与 H3 环的最普遍的构象联 合， 作为选择单一主链构象的基础。
规范序列的多样化 选择了几种已知主链构象或单一已知主链构象后， 就可通过改变分子的结合位点来构 建 dAb， 以产生含结构和 / 或功能多样性的所有组分。这意味着产生变体， 致使在其结构和 / 或其功能方面具有足够的多样性， 由此它们能够提供一系列的活性。
通常通过在一个或多个位置改变所选择的分子来产生所期需的多样性。 可随机选 择待改变的位置， 或它们可能已被选定。然后通过以下方式来实现变异 ： 随机化， 在随机化 期间由任意氨基酸或其天然或合成的类似物取代氨基酸残基产生极大量的变体 ； 或者用一 种或多种限定的氨基酸子集置换氨基酸残基， 产生更有限数目的变体。
业已报道用于引入所述多样性的各种方法。可用易错 PCR (Hawkins 等人 , J. Mol. Biol. (1992) 226: 889)、 化学诱变 (Deng 等人 , J. Biol. Chem. (1994) 269: 9533) 或细菌增变株 (Low等人 , J. Mol. Biol. (1996) 260: 359) 来将随机突变引入编码 分子的基因中。用于突变所选位置的方法在本领域亦众所周知， 包括用或不用 PCR 使用错 配的寡核苷酸或简并寡核苷酸。例如， 通过以抗原结合环作为目标进行突变产生若干合成 的抗体文库。使结合人破伤风类毒素 - Fab 的 H3 区随机化以产生一系列新的结合特异性 (Barbas 等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 4457)。随机或半 - 随机 H3 和 L3 区业已被添加到种系 V 基因区段以产生含未突变框架区的大文库 (Hoogenboom & Winter J. Mol. Biol. (1992) 227: 381; Barbas 等人 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 4457; Nissim 等人 , EMBO J. (1994) 13: 692; Griffiths 等人 EMBO J. (1994) 13: 3245; De Kruif等人 , J. Mol. Biol. (1995) 248: 97)。 所述多样化业已延伸到包括某些 或所有其它抗原结合环 (Crameri 等人 Nature Med. (1996) 2: 100; Riechmann 等人 Bio/Technology (1995) 13: 475; Morphosys, WO97/08320, 同上 )。
由于环随机化有可能产生大约超过 1015 种针对单独的 H3 的结构， 以及同样大量的 其它 5 种环的变体， 因而用目前的转化技术或甚至通过用无细胞系统以产生代表所有可能 组合的文库是不可行的。甚至对于在超过 6 x 1012 种不同抗体中构建的最大文库中的一 些， 使用诸如核糖体展示等技术， 在该设计的文库中仅能表示一部分潜在的多样性 (He 和 Taussig, Nucleic Acid Research 1997 25(24): 5132)。
在一个实施方案中， 仅那些直接参与产生或修饰所期需的分子功能的残基被多样 化。对于很多分子而言， 功能应为结合靶标， 因此多样性应该集中在靶标结合位点， 同时避 免改变对于分子的整体包装或对于维持所选择的主链构象很重要的残基。
在一个方面， 使用其中仅那些抗原结合位点的残基被改变的 dAb 文库。这些残基 在人抗体所有组分中极具多样性， 并且已知为高分辨的抗体 / 抗原复合体的接触点。例如， 在 L2 中， 已知在天然存在的抗体中位置 50 和 53 是多变的， 并观察到其与抗原接触。相比 之下， 常规方法将使由 Kabat 等 (1991, 上述 ) 定义的相应的互补决定区 (CDR1) 中的所有 残基多样化， 与文库中多样化的两个残基相比某些有 7 个残基被多样化。就产生一系列抗 原结合特异性所需的功能多样性而言， 这代表显著改进。
实际上， 抗体多样性是两个过程的结果 ： 种系 V、 D 和 J 基因区段的体细胞重组致使 产生天然的初始所有组分 (primary repertoire) ( 所谓的种系和连接多样性 ) 和导致产 生重排的 V 基因的体细胞超突变。人抗体序列分析显示， 初始所有组分多样性集中在抗原 结合位点中心， 而体细胞超突变将多样性散布在在初始所有组分中高度保守的抗原结合位 点的外围区域 ( 参见 Tomlinson 等人 , J. Mol. Biol. (1996) 256: 813)。这种互补很可 能进化为搜寻序列间隔的有效策略， 尽管对于抗体明显是独特的， 但这可能容易地应用到 其它多肽所有组分。被改变的残基是形成靶标结合位点的那些残基的子集。若有需要， 靶 标结合位点中不同的 ( 包括重叠的 ) 残基子集在选择期间在不同阶段被多样化。
在抗体所有组分情况下， 当某些而不是所有抗原结合位点残基被多样化时， 产生 了初始 “天然的” 所有组分。本文上下文所用术语 “天然的” 或 “假的” 指没有预先确定靶 标的抗体分子。 这些分子类似于尚未经历免疫多样化的个体的免疫球蛋白基因所编码的分 子， 所述尚未经历免疫多样化的个体的例子为胎儿及新生儿个体， 其免疫系统尚未受到多 种抗原刺激物的攻击。然后针对一系列抗原或表位选择该所有组分。若有需要， 可在初始 所有组分中被多样化的区域之外引入另外的多样性。 可选择这种成熟的所有组分用于改变 功能、 特异性或亲和力。
应该理解， 本文所述序列包括与本文所述序列具有基本同一性的序列， 例如至少 90% 同一性， 例如至少 91%、 或至少 92%、 或至少 93%、 或至少 94% 或至少 95%、 或至少 96%、 或 至少 97% 或至少 98%、 或至少 99% 同一性。
对于核酸， 术语 “基本同一性” 表明当对两种核酸或其指定序列以适当的核苷酸插 入或缺失进行最佳比对及比较时， 它们有至少约 80% 的核苷酸、 通常至少约 90%-95%、 或至 少约 98%-99.5% 的核苷酸相同。或者， 当区段在选择性杂交条件下与互补链杂交时存在基 本上同一性。
对于核苷酸和氨基酸序列， 术语 “同一” 表明当两个核酸或氨基酸序列之间以适当 插入或缺失进行最佳比对和比较时的相同程度。或者， 当 DNA 区段在选择性杂交条件与互补链杂交时存在基本上同一性。
两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一位置数量的函数 ( 即 % 同一性 = 同一位置数目 / 位置总数 x 100)， 为了两个序列的最佳比对需要考虑空位数目及每一空位 长度。可用数学算法完成序列比较和两个序列之间同一性百分比的测定， 其如以下非限制 性实施例所述。
可用 GCG 软件包中的 GAP 程序、 用 NWSgapdna.CMP 矩阵和 40、 50、 60、 70 或 80 的空 位权重和 1、 2、 3、 4、 5 或 6 的长度权重， 来测定两个核苷酸序列之间的同一性百分比。 还可用 被整合到 ALIGN 程序 (2.0 版 ) 的 E. Meyers 和 W. Miller 算法 (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))、 用 PAM120 权重残基表、 空位长度罚分 12 和空位罚分 4 来测定两个核苷 酸或氨基酸序列之间的同一性百分比。另外， 可用业已整合到 GCG 软件包中的 GAP 程序的 Needleman 和 Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 算法、 用 Blossum 62 矩阵或 PAM250 矩阵和空位权重 16、 14、 12、 10、 8、 6 或 4 和长度权重 1、 2、 3、 4、 5 或 6， 来测定两个氨 基酸序列之间的同一性百分比。
举例而言， 本发明的多肽序列可与 SEQ ID NO: 14 编码的参照序列同一， 也就是说 100% 同一， 或其与参照序列比较可包括至多特定整数数目的氨基酸改变， 使得 % 同一性小 于 100%。这样的改变选自至少一个氨基酸缺失、 置换 ( 包括保守的和非保守的置换 ) 或插 入， 并且其中所述改变可发生在参照多肽序列的氨基端或羧基端位置， 或这些末端位置之 间的任何位置， 其各自散布在参照序列的氨基酸之中， 或在参照序列内的一个或多个邻接 基团中。通过用 SEQ ID NO: 14 编码的多肽序列中的氨基酸总数乘以各自同一性百分比的 数字百分比 ( 除以 100)， 然后从 SEQ ID NO: 14 编码的多肽序列中的氨基酸总数减去该乘 积， 求出对应于既定 % 同一性的氨基酸改变的数目， 或： na ≤ xa - (xa · y), 其中 na 为氨基酸改变数目， xa 为 SEQ ID NO: 14 所编码的多肽序列中氨基酸的总数， y 为例如 ： 对于 70% 为 0.70、 对于 80% 为 0.80、 对于 85% 为 0.85 等， 其中在从 xa 减去 xa 与 y 的任何非整数乘积之前将其四舍五入成最接近的整数。 实施例 实施例 1 1.1 双靶向抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb (DMS4000) 的制备 通过将 dAb 融合至 mAb ( 阿达木单抗 ) 重链的 C- 端， 生产抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb ( 命名为 DMS4000)。为了构建重链表达盒， 采用编码替代性的 mAbdAb 的重链的载体 DNA 作为起点。使用限制性酶 SalI 和 HindIII， 切离 dAb 部分。通过 PCR ( 使用编码 SalI 和 HindIII 末端的引物 )， 扩增 DOM15-26-593（抗 -VEGF dAb） ， 并使用相同限制位点连接进已 经切离 dAb 的载体主链中， 产生在 mAb 和 dAb 之间的 ‘STG’( 丝氨酸、 苏氨酸、 甘氨酸 ) 连 接物。
选择序列验证过的克隆 ( 对于轻链和重链， 分别是 SEQ ID NO:11 和 13)， 并进行大 规模 DNA 制备， 并使用瞬时转染技术， 通过轻链和重链 (SEQ ID NO:12 和 14) 的共转染， 在 哺乳动物 HEK293-6E 细胞 ( 加拿大国家研究委员会 ) 中表达抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb。
进一步修饰抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb 重链的序列， 以具有针对抗 -VEGF dAb 进
行密码子优化的序列， 并掺入 L235A 和 G237A 突变 (Kabat 编号 )， 以灭活 FC 效应物功能 (DMS4000 mAbdAb 重链 Fc 有缺陷的 SEQ ID NO 46 和 47)。
1.2 双靶向抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb (DMS4000) 的纯化和 SEC 分析 根据确定的方法， 使用蛋白 -A 亲和色谱法， 从澄清的表达上清液中纯化抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb ( 命名为 DMS4000)。通过分光光度法， 通过测量在 280nm 的吸光度， 测定 纯化的样品的浓度。纯化的样品的 SDS-PAGE 分析 ( 图 1) 显示， 未还原的样品在 ~170kDa 泳动， 而还原的样品显示出在 ~25 和 ~60kDa 泳动的 2 个带， 分别对应着轻链和 dAb- 融合的 重链。
对于尺寸排阻色谱法 (SEC) 分析， 将抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb 应用于预平衡的 Superdex-200 10/30 HR 柱 ( 连接至 Akta Express FPLC 系统 ) 上， 并在 0.5ml/min 在 PBS 中运行。尺寸排阻色谱曲线显示作为对称峰运行的单一物质 ( 图 2)。
1.3 双靶向抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb (DMS4000) 的结合亲和力 VEGF 受体结合试验 本试验测量 VEGF165 与 VEGF R2 (VEGF 受体 ) 的结合， 及实验分子封阻该相互作用的能 力。用 VEGF 受体 (R&D Systems, 目录号 : 357-KD-050) (0.5µg/ml 终浓度， 在 0.2M 碳酸 钠 / 碳酸氢钠 pH9.4 中 ) 过夜包被 ELISA 板， 洗涤并用 2% BSA/PBS 封闭。在将 VEGF (R&D Systems, 目录号 : 293-VE-050) 和实验分子 ( 在含 0.1%BSA 的 0.05% 吐温 20TMPBS 中稀 释 ) 预温育 1 小时， 随后加入到板 (3ng/ml VEGF 终浓度 ) 中。用生物素化的抗 -VEGF 抗体 (0.5µg/ml 终浓度 ) (R&D Systems, 目录号 : BAF293) 和过氧化物酶缀合的抗 - 生物素第 二抗体 (1:5000 稀释 ) (Stratech, 目录号 : 200-032-096) 检测 VEGF 与 VEGF 受体的结 合， 并在用等体积 1M HCl 终止反应后， 用比色底物 (Sure Blue TMB 过氧化物酶底物 , KPL) 在 OD450 处显示。
MRC-5/TNFα 试验 用人肺成纤维细胞 MRC-5 细胞， 测定实验分子防止人 TNFα 结合人 TNFR1 及中和 IL-8 分泌的能力。 用 TNFα (500pg/ml) (Peprotech) 温育系列稀释的实验样品 1 小时。 然后用 3 MRC-5 细胞 (ATCC, 目录号 CCL-171) 的悬浮液 (5x10 细胞 / 孔 ) 对其进行 1:2 稀释。过 夜温育后， 将样品稀释 10 倍， 用 IL-8 ABI 8200 细胞检测试验 (FMAT)， 测定 IL-8 释放， 其 中用抗 -IL-8 (R&D Systems, 目录号 208-IL) 包被的聚苯乙烯珠粒、 生物素化的抗 -IL-8 (R&D Systems, 目录号 BAF208) 和抗生蛋白链菌素 Alexafluor 647 (Molecular Probes, 目录号 S32357)， 测定 IL-8 浓度。 以 647nm 荧光发射来定位试验读数， 用包括在该试验中的 IL-8 标准曲线内推 (interpolate) 未知的 IL-8 浓度。
如上所述， 测定对 VEGF 和 TNFα 的结合亲和力。用 GraphPad Prism， 分析试验数 据。用 S 形剂量响应曲线确定效价值， 用最佳拟合模型拟合数据。该 mAbdAb 的抗 -VEGF 效 价 ( 图 3) 计算为 57pM， 而对照抗 -VEGF mAb 给出的 EC50 值为 366pM。在抗 -TNFα 生物试 验 ( 图 4) 中， 效价为 10pM， 而抗 -TNFα 对照 mAb 产生的 EC50 为 22pM。综上所述， 试验数 据表明， 该双靶向 mAbdAb 对两种抗原 (TNFα 和 VEGF) 都有效。
1.4 双靶向抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb (DMS4000) 的大鼠 PK 在大鼠中检测该分子的体内药代动力学性质。内给 3 只大鼠静脉地施用抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb， 在 10 天 (240 小时 ) 时段内采集血清样品。通过针对 TNFα 和 VEGF 二者的 ELISA， 评估给药后不同时间点时残留的药物浓度。结果如图 5 所示。
PK 参数证实， 该分子具有可与抗 -TNFα mAb 相比的体内药代动力学性质。 不认为 所观察到的 VEGF 组分的更短 t1/2β 具有意义， 其可能是试验假象。进一步的细节如表 3 所 示。
表3。1.5 替代性的抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb (DMS4031) 的制备 以与在实施例 1.1 中所述类似的方式， 使用由 STG 连接物连接至 VEGF dAb 的重链 C- 端 上的相同的抗 -TNFα mAb ( 阿达木单抗 )， 构建替代性的抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb ( 命 名为 DMS4031)。在该情况下使用的抗 -VEGF dAb 是 DOM15-10-11。使用瞬时转染技术， 通 过轻链和重链 (SEQ ID NO:12 和 16) 的共转染， 在哺乳动物 HEK293-6E 细胞 ( 加拿大国家 研究委员会 ) 中表达该分子。表达该分子， 得到与在实施例 1.2 中所述类似的 mAbdAb 表达 水平， 但是， 当在实施例 1.3 所述的相同 VEGF 试验中测试效价时， 在该试验中发现具有不 可检测水平的 VEGF 与 VEGF 受体的结合的抑制。
实施例 2 双靶向抗 -TNFα/ 抗 -VEGF mAbdAb 的 Biacore 分析 对实验 mAbdAb 进行 BIAcore 分析， 以测定它们结合其相应抗原的动力学结合常数及解 TM 离常数。 在 BIAcore 3000 设备上进行分析。 设备温度设定为 25℃。 将 HBS-EP 缓冲液用作 运行缓冲液。以设备最高可能比率， 采集实验数据。根据生产商的说明书， 用标准胺偶联化 学， 用蛋白 A 包被研究级的 CM5 芯片上的一个流动池， 同样处理第二个流动池， 但用缓冲液 代替蛋白 A 以产生参照表面。 然后将用蛋白 A 包被的流动池用于捕获 mAbdAb。 如表 2 中所 详述， 作为 2x 系列稀释液注入抗原。一式二份地运行几种稀释液。代替配体的单独的缓冲 液注入， 用于本底扣除。 用设备软件自带的动力学 Wizard， 以随机顺序注入样品。 在每个循 环结束时， 通过注入 10mM 甘氨酸、 pH 1.5， 使表面再生。用 BIAevaluation 软件 4.1， 进行 数据处理和动力学拟合。显示重复结果 ( 来自同一次运行 ) 平均值的数据如表 4 所示。显 示的 DMS4031 的多个值代表在单独场合的两次实验运行。由于所分析的配体的浓度， 787nM 的值可能高估了亲和力。
表4
实施例 3 抗原结合蛋白的化学计量评估 ( 使用 Biacore ™ ) 该实施例是预测性的。 它提供了进行其它试验的指导， 在所述其它试验中， 可以测试本 发明的抗原结合蛋白。
通过伯胺偶联， 将抗 - 人 IgG 固定化在 CM5 生物传感器芯片上。将抗原结合蛋白 捕获在该表面上， 然后， 使单个浓度的 TNFα 或 VEGF 穿过， 该浓度足以使结合表面饱和， 且 观察到的结合信号达到完全的 R-max。然后使用给出的公式， 计算化学计量 ： 化学计量 =Rmax* 分子量 ( 配体 )/ 分子量 ( 分析物 )*R ( 固定化的或捕获的配体 ) 在同时计算超过一种分析物结合的化学计量的情况下， 使不同的抗原在饱和抗原浓度 顺序地穿过， 并如上计算化学计量。该工作可以在 Biacore 3000 上、 在 25℃、 使用 HBS-EP 运行缓冲液来进行。
实施例 4 经由 GS 连接物与抗 -VEGFR2 adnectin 融合的 CTLA4-Ig 的设计和构建 (BPC1821) 构建编码 CTLA4-Ig 的密码子 - 优化的 DNA 序列 ( 包含在 N- 端处的 HindIII 位点和 在 C- 端处的 BamHI 位点， 以便利克隆 )， 并克隆进含有 CT01 adnectin 的哺乳动物表达载 体 ( 来自加拿大国家研究委员会的 pTT 表达载体， 具有修饰的多克隆位点 (MCS)) 中。 这允 许将 adnectin 经由 GS 连接物融合在 CTLA4-Ig 的 C- 端。得到的抗原结合蛋白被命名为 BPC1821。BPC1821 的 DNA 和蛋白序列分别给出在 SEQ ID. No. 26 和 27 中。
使用 293fectin (Invitrogen, 12347019)， 将编码 BPC1821 的表达质粒瞬时转染 进 HEK 293-6E 细胞 ( 加拿大国家研究委员会 ) 中。24 小时后， 将胰蛋白胨饲料加入细胞 培养物中， 并在 96 小时后收获上清液。使用蛋白 A 柱， 纯化 BPC1821， 然后在结合试验中测 试。
实施例 5 VEGFR2 和 B7-1 结合 ELISA (BPC1821) 用在 PBS 中的 0.4µg/ml 重组人 VEGFR2 Fc 嵌合体 (R&D Systems, 357-KD-050) 包被 96- 孔高结合板， 并在 4℃储存过夜。用含有 0.05% 吐温 -20 的 Tris- 缓冲的盐水， 洗涤平 板 2 次。将 200 µL 封闭溶液 ( 在 DPBS 缓冲液中的 5% BSA) 加入每个孔中， 将平板在室温 温育至少 1 小时。然后进行另一个洗涤步骤。在封闭溶液中在平板上连续稀释 BPC1821 和 2 种阴性对照抗体 (Sigma I5154 和双特异性的 IGF1R–VEGFR2 抗原结合构建体 BPC1801 – 重链 SEQ ID NO:163 和轻链 SEQ ID NO:164)。温育 1 小时以后， 洗涤平板。使用来自 GE Healthcare 的 ECL 生物素化模块， 生物素化重组人 B7-1 Fc 嵌合体 (RnD Systems, 140-B1-100)。在试剂盒推荐水平的四分之一， 进行标记。在封闭溶液中稀释生物素化的 B7-1 至 1µg/mL， 将 50µL 加入每个孔中。温育平板 1 小时， 然后洗涤。在封闭溶液中稀释 ExtrAvidin 过氧化物酶 (Sigma, E2886) 1000 倍， 将 50µL 加入每个孔中。另一个洗涤步 骤以后， 将 50µl OPD SigmaFast 底物溶液加入每个孔中， 并在 15 分钟以后， 通过加入 25µL 3M 硫酸， 终止反应。 使用基础终点方法， 使用 VersaMax 可调微量培养板读数器 (Molecular Devices)， 在 490nm 读出吸光度。
图 6 显示了 ELISA 结果， 并证实， 双特异性的 BPC1821 显示出对 VEGFR2 和 B7-1 的 结合。阴性对照抗体没有显示出对 VEGFR2 和 B7-1 的结合。从 2 µg/ml 的起始浓度， 稀释对照浓度。
实施例 6 经由 GS 连接物与抗 -VEGF dAb 融合的 CTLA4-Ig 的设计和构建 (BPC1825) 将编码与抗 -VEGFR2 adnectin 融合的 CTLA4-Ig 的 DNA 质粒用作基础质粒， 以构建双 特异性的 CTLA4-Ig- 抗 -VEGF dAb。如下制备载体 ： 通过用 BamHI 和 EcoRI 消化基础质粒， 以去除 adnectin 序列。用 BamHI 和 EcoRI 限制酶切编码抗 -VEGF dAb 的 DNA 序列， 并连接 进载体中。得到的双特异性的 CTLA4-Ig- 抗 -VEGF dAb 命名为 BPC1825， 其中 dAb 经由 GS 连接物融合至 CTLA4-Ig 的 C- 端。BPC1825 的 DNA 和蛋白序列分别给出在 SEQ ID NO:28 和 29 中。
使用 293fectin (Invitrogen, 12347019)， 将编码 BPC1825 的表达质粒瞬时转染 进 HEK 293-6E 细胞 ( 加拿大国家研究委员会 ) 中。24 小时后， 将胰蛋白胨饲料加入细胞 培养物中， 并在 96 小时后收获上清液。将上清液用作结合试验中的实验物。
实施例 7 VEGF 和 B7-1 结合 ELISA (BPC1825) 用在 PBS 中的 0.4µg/ml 人 VEGF165 ( 自制材料 ) 包被 96- 孔高结合板， 并在 4℃储 存过夜。用含有 0.05% 吐温 -20 的 Tris- 缓冲的盐水， 洗涤平板 2 次。将 200 µL 封闭溶 液 ( 在 DPBS 缓冲液中的 5% BSA) 加入每个孔中， 将平板在室温温育至少 1 小时。然后进行 另一个洗涤步骤。在封闭溶液中在平板上连续稀释 BPC1825 和 2 种阴性对照抗体 (Sigma I5154 和 BPC1824 – CTLA4-Ig- 抗 -IL-13 dAb 融合体 – SEQ ID NO:165)。温育 1 小时 以后， 洗涤平板。使用来自 GE Healthcare 的 ECL 生物素化模块， 生物素化重组人 B7-1 Fc 嵌合体 (RnD Systems, 140-B1-100)。 在试剂盒推荐水平的四分之一， 进行标记。 在封闭溶 液中稀释生物素化的 B7-1 至 1µg/mL， 将 50µL 加入每个孔中。温育平板 1 小时， 然后洗涤。 在封闭溶液中稀释 ExtrAvidin 过氧化物酶 (Sigma, E2886) 1000 倍， 将 50µL 加入每个孔 中。另一个洗涤步骤以后， 将 50µl OPD SigmaFast 底物溶液加入每个孔中， 并在 15 分钟以 后， 通过加入 25µL 3M 硫酸， 终止反应。使用基础终点方法， 使用 VersaMax 可调微量培养板 读数器 (Molecular Devices)， 在 490nm 读出吸光度。
图 7 显示了 ELISA 结果， 并证实， 双特异性的 BPC1825 显示出对 VEGF 和 B7-1 的结 合。阴性对照抗体没有显示出对 VEGF 和 B7-1 的结合。从 2 µg/ml 的起始浓度， 稀释 Sigma I5154 IgG 的浓度。
实施例 8 经由 STG 或 TVAAPPSTG 连接物与 VEGF dAb 融合的 TNFα 受体 Fc 融合体的设计和构建 构建了编码人 TNFα 受体 Fc 融合体 ( 依那西普 ) 的密码子 - 优化的 DNA 序列， 并与来 自 DMS4000 构建体的 DOM15-26-593 抗 -VEGF dAb 一起克隆进哺乳动物表达载体 (pTT5) 中。
给受体 Fc 侧接额外的序列， 以提供 N- 端 Campath1 信号肽， 并在 C- 端处提供 STG 连接物或 TVAAPSTVAAPSTVAAPSTVAAPSTG 连接物， 用于融合至 dAb 上。侧接序列包括 AgeI 限制位点和 SalI 限制位点， 以便利克隆进含有 dAb 的载体中。得到的抗原结合蛋白分别 被命名为 EtanSTG593 和 EtanTV4593。EtanSTG593 的 DNA 和蛋白序列分别给出在 SEQ ID No:48 和 49 中， EtanTV4593 的 DNA 和蛋白序列分别给出在 SEQ ID No: 50 和 51 中。实施例 9 EtanSTG593 和 EtanTV4593 纯化和 VEGF 和 TNFα 结合分析 使 用 293Fectin (Invitrogen) 进 行 转 染， 在 HEK 293-6E 细 胞 ( 加 拿 大 国 家 研 究 委员会 ) 中， 独立地表达 EtanSTG593 和 EtanTV4593 质粒。5 天后， 收获 EtanSTG593 和 EtanTV4593， 并通过 MAb Select Sure (GE Healthcare) 亲和色谱法进行纯化， 分别得到 分批样品 M4004 和 M4005。在 F1 缓冲液 (0.1M 柠檬酸盐 pH6, 10% PEG300, 5% 蔗糖 ) 或 ET 缓冲液 (10mM Tris pH7.4, 4% D- 甘露醇 , 1% 蔗糖 ) 中配制蛋白。通过在 HiLoad Superdex S200 10/300 GL 柱 (GE Healthcare) 上的尺寸排阻色谱法， 进一步纯化蛋白， 以 降低聚集体的水平。
在 ProteOn XPR36 机器 (BioRad TM) 上进行结合分析。通过伯胺偶联， 将蛋白 A 固定化在 GLM 芯片上。将要测试的构建体捕获在蛋白 A 表面上。在 256 nM、 64 nM、 16 nM、 4 nM 和 1nM， 使用分析物 TNFα 和 VEGF。将 0 nM ( 即单独的缓冲液 )TNFα 和 VEGF 用于重 复参照结合曲线。
ProteOn 的新颖的 6x6 流动池布置 （set up） 允许同时捕获最多 6 种构建体， 且也 允许 6 种分析物浓度流过捕获的抗体， 每个循环共产生 36 种相互作用。
为了再生蛋白 A 表面， 使用 50 mM NaOH， 这会去除捕获的构建体， 并允许另一个捕 获和结合循环开始。将得到的数据拟合至 ProteOn 分析软件自带的 1:1 模型。使用 HBS-EP 作为运行缓冲液， 并在 25℃的温度， 进行运行。
表 5: VEGF 结合结果。
表 6: TNFα 结合结果实施例 10– 预测实施例 10.1 制备双靶向抗原结合蛋白 通过在 2 个以前鉴别出的抗原结合蛋白 （例如抗体片段或整个单克隆抗体） 之间导入物 理连接， 可以工程化双靶向抗原结合构建体。通过在 2 个部分之间编码遗传连接序列， 可以 导入所述物理连接。连接物在长度和氨基酸组成方面的性质， 可能影响双特异性试剂的一 个或两个部分的性质。在使用多个抗体或抗体片段来制备双特异性物的情况下， 可以采用 实验方案来鉴别先导物的最佳组合。
使用多种确定地记载的体内 ( 例如 : Harlow, E 和 Lane, D (1998) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 和体外 ( 例如 : Barbas III, CF 等人 (2001) Phage Display, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press) 技术， 可以可以在分离中鉴别和开发针对确定的靶物的单个结合部分 （诸如 mAb、 FAb、 ScFv、 dAb 等） ， 以递送具有已知的效价、 效能和生物物理学性能性质的药 剂。 从这些单个的药剂中， 会产生许多不同的双特异性的机会， 它们仅受到建立它们所需的 分子工程的复杂性程度的限制。希望的分子结构通常由要治疗的病症的性质决定。例如， 对于长期给药， 偏向于递送固有地长体内半衰期的分子形式。 这可以如下最容易地实现 ： 通 过包含 IgG 抗体的 Fc 区， 其递送长终末半衰期 （由于补救再利用途径） 。因而， 基于 mAb 或 其它 Fc 的双特异性物是常用的形式。
为了开发基于 mAb 的双靶向分子， 一个潜在的方案是， 将抗体片段连接至完整 IgG 上。 在分子水平， 这可以如下实现 ： 将限制位点导入 mAb 链的末端之一处， 并插入抗体片段， 使得 mAb 链延长额外的功能单位。可能需要改变在功能单位之间的连接物的性质， 以优化 双特异性物的总性质。 如果可得到多种接近相同靶物的不同抗体片段， 使用该方案， 可以将 它们彼此进行直接对比。通常在哺乳动物细胞 （通常瞬时转染的 HEK293 细胞， 但是对于稳 定的细胞系和大规模生产而言， 则用 CHO 细胞） 中表达该性质的双特异性物。 对于 TNF/VEGF 双特异性物， 可以以此方式将抗 -TNFα mAb 连接至 VEGF 结合蛋白 （诸如抗体片段） 上， 或 者， 可以将抗 -VEGF mAb 连接至抗 -TNFα 结合蛋白上。例如， 可以以此方式利用的 TNFα 和 VEGF 拮抗剂分别列出在表 1 和 2 中。在这样的实践中， 如果所有可能的试剂都可得到， 将测试所有可能的组合。
可以如下制备非基于 mAb 的双特异性物 ： 以与遗传融合体总体上类似的方式， 将2 个抗体片段或结合抗原的其它蛋白连接到一起。2 个单元的接头通常用可以以经验为主地 确定其长度和序列组成的连接物来表示。这样的分子允许分子工程的自由 （因为它们的模 块的、 单链性质） ， 并提供在哺乳动物细胞以外的系统中表达的可能性。
图 8 显示了根据本发明可以使用的可能的双靶向构建体的矩阵。在 SEQ ID NO:73-140 中， 给出了在图 8 中所示的许多可能的双靶向构建体的序列。在这些特异性的 双靶向分子中， ‘TVAAPS’连接物 (SED ID NO:4) 被用于连接组分部分， 例外是， DVD-Ig、 与 N- 端 ScFv 的 DVD-Fab 融合体 (SEQ ID NO:116-118) 和与 N- 端 VH dAb 的融合体 (SEQ ID NO:133、 134) 中的重链， 其中所述连接物是 ‘ASTKGPS’(SEQ ID NO:6)。SEQ ID NO:73-140 仅仅是示例性的， 技术人员会明白， 其它连接物和构建体是可能的。
表 7: 在图 8 中使用的缩写。10.2 测试双靶向抗原结合蛋白的需要的特征 效价 / 亲和力 : 适合进一步开发的双特异性分子的基础性质是对抗原的动力学结合亲 和力 ( 通常通过表面等离子体共振 (SPR) 形式 （例如 BIAcore） 来测定 )， 其又可以用于预 测在施用治疗量以后的最小药理学有效浓度 （基于先前的抗原浓度和可用性的知识） 。还可 以预测亲和力与中和效价有关， 后者是通常通过体外试验来评估的一种性质， 其决定了介 导特定药理学作用的化合物浓度。这可以是受体 / 配体结合事件的抑制， 或下游应答途径 的刺激 / 抑制。例如， 通过它阻止受 TNF 调节的其它细胞因子的生产的程度， 可以评估 TNF 拮抗剂的效价。其常见形式是， MRC-5 细胞响应于 TNF 而分泌的 IL8 的减少。对于 VEGF 拮 抗剂， 受体磷酸化降低的程度是抗 -VEGF 剂的抑制作用的直接后果， 而 HUVEC 细胞的增殖的 减少与该作用具有生物学关联。与动力学亲和力一样， 需要双特异性物表现出对两种抗原 的靶物效价。
生物物理学 ： 因为已知常规的 mAb 具有良好的表达特性、 生物物理学特性和药代 动力学特性， 需要任意可开发的双特异性分子表现出类似的特征。在瞬时的和稳定的细胞 培养过程中测定表达水平， 且需要是在与常规治疗抗体相同的正常范围内。需要使双特异 性物顺从与 mAb 类似的纯化过程 ( 例如蛋白 -A 捕获 ) 和生产临床级物质所需的其它下游加 工 (DSP) 步骤。需要纯化的蛋白表现出清洁的、 对称的尺寸排阻色谱法 (SEC) 特性、 在生物 相容的缓冲液中在高 (>25mg/ml) 蛋白浓度的稳定性、 和对许多应激条件 ( 温度、 pH、 冻融、 脱酰胺条件等 ) 的耐受性。
药代动力学 (PK)/ 药效动力学 (PD) ： 需要双特异性的抗原结合蛋白的药代动力学 特性与靶物的性质和疾病性质 （setting） 相一致。 在大多数情况下， 通过它们的长血清半衰 期， 确定地鉴别出抗体， 且这是通常希望的特性。通常， 在啮齿动物和灵长类动物物种中评 估 PK， 并将双特异性物的终末半衰期 (t1/2β) 与针对相同靶物的抗体药剂相对比 ( 在以完 全不同速率代谢两种活性的情况下， 假定双特异性物会反映更迅速地清除的物质 )。 双特异 性分子的 PK 试验会理想地在单个试验 ( 桥连试验 ) 中测量 2 种活性， 从而确信， 在循环中
的残余药物是完整的且完全双功能的 ( 例如， 将 TNF 固定化在平板上， 将含有药物的样品加 入平板中， 并通过加入例如生物素化的 VEGF（其本身通过抗 - 生物素药剂来检测） ， 测定存 在的双特异性物的量 )。对双特异性化合物的其它体内分析包括， 在疾病模型中测试， 条件 是， 存在这样的模型， 且确定地理解了双特异性物与宿主物种的交叉反应性。 对于 TNF/VEGF 双特异性物， 这可以包括炎症 （其中炎症被增加的血管渗漏加重） 或血管增生性病症 （其中 局部环境中巨噬细胞的活化会加重疾病状态） 。在灵长类动物中， 这样的模型也可以允许衍 生出某些药效动力学的标志物， 其活性可能在药剂的循环等中起作用。
安全性 ： 双特异性形式的相对新颖性 ( 即使组分部分和靶物存在先例 ) 会产生安 全性和耐受性的问题。 象任何生物药一样， 需要全范围的毒理学试验， 更加关注与双特异性 分子形式有关的任何假定的问题。这可能包括 ： 额外的预料之外的药理学或增加的免疫原 性的可能性。可以如下解决该后一种可能性 ： 使用在计算机环境 （in silico ） 中的工具， 寻 找可以用于构建分子的该方面的风险特性 （risk profile） 的 T- 细胞表位。
基于许多相同的亲和力、 效价和生物物理学性能标准， 可以判断非基于 mAb 的双 特异性形式 ( 例如 2 个抗体或抗体 - 样片段的直接融合 )， 尽管有些性能 （具体地 PK） 可以 随不同的分子形式而变化。 这样的分子也可以在不同的表达系统中 ( 例如， 在原核细胞中 ) 生产， 它们自身可以建立不同的需求， 特别是在纯化、 DSP 和安全性研究方面。
实施例 11 TNF/VEGF dAb-dAb 线内融合体 (ILF) 下面详述了用于构建 dAb-dAb 线内融合体的方法， 以便制备 TNF-VEGF 双特异性物。 但是， 如上在实施例 10 中所述， 相同的方案可以用于制备任何其它双特异性物 （基于具有 类似的靶物特异性的抗体或抗体片段） 。
通过将 2 个单个结构域抗体 (dAb) 遗传融合进 dAb-dAb 线内融合体 (ILF) 中， 构 建具有抑制 TNFα 和 VEGF 的潜力的双特异性分子。为了构建这些分子， 通过噬菌体展示， 分离出针对两种靶物独立地选择的 dAb， 并使用多种合适的技术， 通过几轮亲和力成熟， 实 现针对靶物的高亲和力和效价。 为 ILF 选择的最终分子是 DOM15-26-593 ( 抗 -VEGF) (SEQ ID NO:1) 和 PEP1-5-19 ( 抗 -TNFα) (SEQ ID NO:35)。
DOM15-26-593 是对人 VEGF-A 具有大约 1nM 的单体亲和力的 VH dAb。PEP1-5-19 是对人 TNFα 具有大约 8nM 的单体亲和力的 Vκ dAb。制备 2 种不同的 ILF 构建体， 一种 含有在氨基端处的 DOM15-26-593 dAb ( 下面缩写为 “DOM-PEP” )， 一种含有在该位置处的 PEP1-5-19 dAb (“PEP-DOM” )。在 ILF 中的 2 个 dAb 被短连接物隔开， 所述短连接物源自 与 VH 或 Vκ dAb 的 C 端天然结合的序列。因此， 具有在 N- 端处的 VH dAb 的 ILF 包括连接 物 “ASTKGPS” (SEQ ID NO:6 – 从 VH 自然延伸成 CH1)， 具有在 N- 端处的 PEP1-5-19 的 ILF 包括连接序列“TVAAPS”(SEQ ID NO:4 - 从 Vκ 自然延伸成 Ck)。
为了制备 ILF， 修饰哺乳动物短暂表达载体 pTT5 (NRC, Canada)， 以包括分泌信号 和适当的克隆位点。这些在下面的表 8 中详述。为了制备 DOM-PEP 构建体， 使用下述的各 个基因特异性的引物， 扩增与 DOM15-26-593 dAb 和 PEP1-5-19 结构域 dAb 相对应的单个片 段。将连接序列和限制位点掺入引物序列中。
表8 注： DNA 序列中的限制位点标有下划线。使用 AVG18 和 AVG19， 扩增用于 DOM-PEP 构建体的 DOM15-26-593， 并使用 AVG26 和 AVG21， 扩增用于 DOM-PEP 构建体的 PEP1-5-19。在纯化以后， 分别用 BamHI 和 NheI、 以及 NheI 和 HindIII， 消化 PCR 片段， 并纯化片段。然后将它们加入使用载体 pTT5 的改进形式 的 3- 片段连接中， 所述改进形式含有允许缉拿该 BamHI-HindIII 片段插入在真核启动子下 游的多克隆位点。使用标准技术， 对得到的菌落进行连接、 转化和分析， 核苷酸序列分析证 实， 得到的载体含有插入物， 该插入物具有 SEQ ID NO:61 所示的序列， 这预测 SEQ ID NO:62 所示的翻译产物。
对于 PEP-DOM 构建体， 用 AVG22 和 AVG36 扩增 PEP1-5-19 dAb， 并使用 AVG37 和 AVG25 扩增 DOM15-26-593 dAb。 分别用 BamHI 和 BsiWI (PEP) 以及 BsiWI 和 HindIII (DOM) 消化这些片段。发现 DOM 片段被较差地消化， 这归因于在引物的 5’ 末端上的短突出端。因 此， 用 AVG25 和 AVG24 重新扩增 PCR 产物， 以延长该突出端， 并重复消化， 将片段与消化的 PEP 插入物和如上所述的 pTT5 载体一起加入 3- 片段连接中。使用标准技术， 对得到的菌
落进行连接、 转化和分析， 核苷酸序列分析证实， 得到的载体含有插入物， 该插入物具有 SEQ ID NO:63 所示的序列， 这预测 SEQ ID NO:64 所示的翻译产物。
通过 DNA maxiprep， 制备用于转染的测序的克隆， 并使用标准的方法， 将 DNA 转染 进 HEK293-6E 细胞 ( 加拿大国家研究委员会 ) 中。在澄清培养基以后， 通过蛋白 -A 亲和 色谱法， 从转染的细胞上清液中收获重组蛋白， 并将纯化的物质缓冲液更换进 PBS 中， 并定 量。 然后通过下述的表面等离子体共振 (SPR)， 评估这些蛋白的结合 TNFα 和 VEGF 的能力。
使用许多被认为会结合远离 dAb CDR 区的 VH 或 Vκ dAb 的单克隆抗体 ( 或者， 可 以使用蛋白 A 或蛋白 L)， 经由 mAb， 将 DOM-PEP 和 PEP-DOM 蛋白捕获在传感器表面上， 使 TNF 和 VEGF 配体流过捕获的双特异性物， 并分析结合特征。分析表明， 当所述化合物被 2 种不 同的抗 -Vκ dAb 之一捕获时， 测试的 TNF 配体的结合会受损， 表明该捕获抗体会在空间上 干扰配体结合。因此， 将进一步的分析限制在被抗 -VH dAb 单克隆抗体捕获的双特异性物 上。
大约 1600 个应答单位 (RU) 的抗 -VH 单克隆被捕获在蛋白 -A 表面上， 并使实验化 合物经过复合物。设计实验方案， 以提供结合活性的定性测量 （而不是定量测量） ， 因此不可 能估测动力学等。用 PEP-DOM 蛋白得到了最清楚的数据， 其中 2 个 dAb 都明显地能够独立 地和同时地结合配体， 如累加结合曲线所证实的 ( 图 9 和 10)。
图 9 中曲线的结合事件的更靠近分析证实了两种配体与 PEP-DOM 蛋白的结合。
也观察了 DOM-PEP 与 TNFα 和 VEGF 结合的可能性 ( 数据未显示 )。
实施例 12 体内研究 ： 大鼠激光 - 诱导的脉络膜新血管生成 (CNV) ： 分别测试 DMS1571 (VEGF-dab) TM 和 Enbrel原理在以前的实验中得到的结果表明， 抗 -VEGF 拮抗剂 DMS1571 (DOM 15-26-593 抗 -VEGF dAb 的一种 Fc 格式化形式， 其作为 SEQ ID NO:65 的二聚体存在 ) 在大鼠激光 - 诱导的脉络 膜新生血管形成 (CNV) 模型中是有效的。该实验的目的是， 进一步评价该分子在大鼠 CNV 模型中的剂量范围， 并另外在相同模型中进行 TNFα 拮抗剂 (EnbrelTM) 的剂量范围研究。 也在该研究中测试了 DMS4000。
方法学动物 在这些研究中使用 12- 周龄 Dark Agouti (DA) 大鼠 (Harlon Olac)。在操作之前， 通 过以 0.175 ml/100g 腹膜内注射氯胺酮 (37.5%, Dodge Animal Health Ltd.)、 Dormitor (25%, Pfizer Animal Health, Kent) 和无菌水 (Pfizer Animal Health, Exton, PA) 的 混合物， 手术地麻醉动物， 并用局部的 1% 托吡卡胺 (Alcon Laboratories, Fort Worth, TX) 和 2.5% 去氧肾上腺素 (Akorn, Inc., Decatur, IL) 的组合， 扩大瞳孔。 所有动物实验 都符合在眼和视力研究中使用动物的 ARVO 声明 （ARVO Statement on the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research） 。
实验 CNV 通过使用激光光凝固 (PC) 破裂玻璃膜， 在 2-4 月龄雌性 DA 大鼠组中单向地诱导实验 CNV。 使用连接至裂隙灯眼底镜上的二极管 - 泵入的 532 nm 氩激光 (Novus Omni CoherentInc., Santa Clara, CA)， 进行染料激光器 PC， 并手持式平凹接触镜 (Moorfields Eye Hospital, London, UK) 应用于角膜上， 以中和眼力 （ocular power） 。使 8 个损伤 (532 nm， 150 mW， 0.15 秒， 100 µm 直径 ) 以标准化的方式以视神经为中心以 500µm 半径分布在 视乳头周围 ( 离视神经盘 1-1.5 mm)， 并避开每只眼中的主要血管。 将激光损伤的形态学终 点鉴别为空化气泡的暂时出现， 即与玻璃膜的破裂有关的征兆 ( 对于背景参照， 一般的方 法公开在 ： Campos, Amaral, Becerra, & Fariss, 2006 A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Invest Ophthalmol Vis Sci, 47(12), 5163-5170， 它通过引用整体并入本文 )。从该研究中排除没有导致空化气泡形成的激光斑 点。
体内成像 在损伤产生后 7 天， 使用共焦高分辨率扫描激光检眼镜 (SLO) 荧光素血管造影术 (FA) (0.3ml 5% 腹内注射的荧光素钠， 从英国伦敦 Moorfields 眼科医院 （Moorfields Eye Hospital, London, UK） 得到的 FS)， 制备 CNV 和有关渗漏的体内图像数据， 随后在手 术后 14 天， 进行第二个成像时段。基于以前在未治疗的大鼠的激光 PC 以后拍摄的血管 造影照片中荧光素染色强度和面积的变化时程的历史对照研究， 选择时间点。这些历史 研究表明， 在 PC 后 4 天首次观察到荧光素染色， 且以后染色强度迅速增加， 在光凝固后大 约 14 天达到它的峰值 ( 关于方法的一般背景， 参见 ： Kamizuru 等人 , 2001; Monoclonal antibody-mediated drug targeting to choroidal neovascularization in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42(11), 2664-2672; Takehana 等人 , 1999 Suppression of laser-induced choroidal neovascularization by oral tranilast in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(2), 459-466， 它们通过引用整体并入本文 )。在这些研 究的实验 CNV 的时程中没有进行其它评估， 表明荧光素渗漏在光凝固后大约 5 周开始减少。 在注射 FS 之前， 拍摄基线反射 ( 在 488nm 和 790nm) 和自发荧光 ( 激发 488nm， 发射 >498nm) 图像， 以帮助确定 FA 图像中的损伤。在 FS 注射以后， 立即记录动脉 - 静脉阶段。此后， 在 注射后 1 分钟记录荧光素血管造影照片， 并在注射后 4 分钟再次记录， 后一个 4 min 数据集 用于统计分析。
图像数据的评价和统计分析 通过晚期 (FS 注射后 4 ±1 分钟 ) 荧光素血管造影术的定量评估， 评价药物治疗的 作用。将渗漏定义为与反射图像中的损伤相对应的超荧光区的存在。在定量之前， 将在分 析中使用的所有图像的增益和亮度标准化。通过将渗漏直径 (µm) 乘以该区域中的平均像 素亮度值 (0 至 1)， 定量晚期荧光素血管造影术中的渗漏强度和面积。使用未成对的 T- 检 验， 对比实验组之间的结果。认为 < 0.05 的 P 值是统计上显著的。将数据显示为平均值 ± SEM， 除非另外指出。在进行图像分析之前， 将标识弄乱， 并以掩蔽的方式进行定量。
大鼠 CNV 损伤中巨噬细胞的免疫组织化学检测 立即摘出以前在 CNV 研究中已经进行荧光血管造影术的眼， 并在 4% 对甲醛中固定。然 后从每只动物的治疗过的眼制备洗眼杯， 并在 4 个蝴蝶式切口以后进行平坦固定。使用 ED1 mAb， 通过免疫组织化学染色， 测定血管损伤的巨噬细胞含量， 随后通过计数 ED1 阳性细 胞—— ED1 (CD68) mAb ( 目录号 MCA341 Serotech, Kidlington, Oxford, UK)， 进行定量。
治疗下表 ( 表 9) 显示了给每个实验组施用的治疗。
在每种情况下 , 在即将开始激光 PC 之前， 通过玻璃体内注射， 施用化合物。激光 - 诱导的 CNV 研究的结果在 PC 以后 7 天和 14 天， 在 2 个时间点， 对治疗过的眼进行高放大率荧光素血管造影术。针对与实验 CNV 有关的脉络膜渗漏和与指出的治疗有关的其它血管异常， 对图像分级。以 近 - 红外反射 (IR) 和自发荧光模式 (AF)， 记录图像。在注射荧光素造影剂之前， 使用 IR 图像定位视网膜中的损伤。在 RPE ( 视网膜色素上皮 ) 水平记录所有图像。
DMS1571 (VEGF-Dab) 和 EnbrelTM 在大鼠 CNV 中的作用 表 10: DMS1571。
在 7 天和 14 天时评估的 DMS1571 的 CNV 渗漏的平均值 ±SEM注 射 1.0- 媒 介 物、 2.0-2µg DMS1571、 3.0-1µg DMS1571、 4.0-0.5µg DMS1571、 5.0-0.2µg DMS1571、 6.0-0.1µg DMS1571 药剂， 然后立即诱导激光损伤。在所有情况下， 每 组 N=5 只动物。以 2µl 的体积， 通过玻璃体内注射， 施用所有化合物。
图 11 是表 10 所示数据的图解表示。以 2µl 的体积， 通过玻璃体内注射， 施用所有 化合物。黑色条表示第 7 天的结果。白色条表示第 14 天的结果。
表 11: EnbrelTM。
在 7 天和 14 天时评估的实验 Enbrel TM 的 CNV 渗漏的平均值 ±SEM注 射 7.0- 媒 介 物、 8.0-30µg EnbrelTM、 9.0-10ug EnbrelTMl、 10.0-3µg Enbrel、 TM TM 11.0-1µg Enbrel 、 12.0-0.3µg Enbrel 药剂， 然后立即诱导激光损伤。在所有情况下， 每 组 N=5 只动物。以 2µl 的体积， 通过玻璃体内注射， 施用所有化合物。
图 12 是表 11 所示数据的图解表示。以 2µl 的体积， 通过玻璃体内注射， 施用所有 化合物。黑色条表示第 7 天的结果。白色条表示第 14 天的结果。
图 13 显示了在激光 PC 以后 7 天 ( 第 1 次 FS) 和 14 天 ( 第 2 次 FS) 时的红外 (IR， 左上图 )、 自发荧光 (AF， 左下图 ) 和荧光素血管造影术 (FS， 大图 )——显示了实施例 图像。1. 媒介物治疗的眼， 2. 用 2µg DMS1571 治疗的眼， 8. 用 30µg EnbrelTM 治疗的眼。 值得注意的是，CNV 损伤显得比与 DMS1571 治疗相对应的损伤更突出和弥散性更低。箭头 指示在对照和 EnbrelTM 治疗的动物中的新生血管形成， 但是在 DMS1571 动物中没有。
表 12: DMS4000。
在 7 天和 14 天时评估的 DMS4000 的 CNV 渗漏的平均值 ±SEM注射 13.0-2µg DMS4000、 14.0- 媒介物药剂， 然后立即诱导激光损伤。在所有情况下， 每组 N=5 只动物。以 2µl 的体积， 通过玻璃体内注射， 施用所有化合物。
图 14 是表 12 所示数据的图解表示。以 2µl 的体积， 通过玻璃体内注射， 施用所有 化合物。
DMS1571 (VEGF-dab) 和 EnbrelTM 对大鼠 CNV 损伤的巨噬细胞含量的影响 表 13 –CNV 损伤中的 ED1 阳性细胞 ( 巨噬细胞 ) 的定量* p<0.0016 相对于对照， 在每种情况下， n=5 只眼。
图 15 显示了用 ED1 mab 染色的平坦固定的视网膜的实施例显微照片。 图 1A-1B 和 图 Enbrel 8.4 显示了来自用抗 -VEGF (DMS1571) (1A)、 仅媒介物 (1B) 或 Enbrel (Enbrel 8.4) 处理过的眼的视网膜的平坦固定。用 ED1 (CD 68， 黑色 ) X20 显影与激光烧伤部位有 关的巨噬细胞。图 1D 显示了视网膜的恒冷箱切片 (20µm)， 它显示了已经渗入视网膜的内 核层 (INL) 中的与激光烧伤部位有关的巨噬细胞 (ED1+， 黑色 )。RGC， 视网膜神经节细胞 层； BV， 血管。x20。
结论结果表明， DMS1571 可以有效地显著减弱 CNV 疾病。在大于 1µg 的剂量， 观察到强烈的 且稳健的作用， 0.5µg 剂量表现出次于最大的作用， 在小于 0.5µg 的剂量， 该治疗剂是无效 TM 的。实验表明， 30µg 剂量的 Enbrel 在该模型中也是有效的， 且更低的剂量是无效的。发 TM 现 VEGF 抑制剂 （由 DMS1571 例证） 和 TNFα 抑制剂 （由 Enbrel 例证） 能够在啮齿动物模型 中独立地减弱脉络膜新生血管疾病， 这表明， 包含 VEGF 和 TNFα 能力的单一治疗实体 （由 DMS4000 例证） 在脉络膜新生血管 AMD 的治疗中是有用的。观察到， DMS4000 ( 其中 TNFα 结合功能不可与结合大鼠 TNFα 相比 ) 在大鼠 CNV 模型中表现得与在等效剂量的 DMS1571 一样好。
从荧光血管造影术照片可以看出， 当对比 DMS1571 处理过的眼和 EnbrelTM 处理过 的眼时， EnbrelTM 处理过的眼具有特有的图式形成， 其中与 DMS1571 处理过的眼相比， 损伤 显得更突出和弥散性更低。损伤图式形成中的这些差异高度地指示 DMS1571 (VEGF 拮抗 剂 ) 和 EnbrelTM(TNFα 拮抗剂 ) 治疗剂的独立作用机理。该论断得到下述发现的进一步支 持： 即在 EnbrelTM 治疗组中， 明显更少的巨噬细胞被募集至 CNV 血管损伤。
实施例 13 体内研究 ： 大鼠激光 - 诱导的脉络膜新血管生成 (CNV) ： 测试 DMS1571(VEGF-dab) 和 EnbrelTM 的组合 在该实施例中使用的方法与在实施例 12 中给出的那些基本上相同。
下面的表 14 显示了为每个实验组给出的治疗。* 媒介物 - 50mM 醋酸钠 10mM TrisHCL pH7.4, 104mM NaCl, 0.025% 吐温 80, 4% 甘 露醇 , 1% 蔗糖 # 在一起施用 DMS1571 和 EnbrelTM 的情况下， 各自使用 1µl。
表 15: DMS1571 (VEGF-dab) 和 EnbrelTM 在大鼠 CNV 中的作用。实施例 14–DME 模型 – 预测实施例 预见到， 本文公开的抗原结合蛋白可有效地治疗和 / 或预防糖尿病黄斑水肿 (DME)。 这 可以在糖尿病黄斑水肿模型中验证， 其中在引发高血糖症以后， 观察到 DME 和视网膜血管 泄漏， 参见 Ishida, T. Usui 和 K. Yamashiro等人 (VEGF164 is proinflammatory in the diabetic retina, Invest Ophthalmol Vis Sci 44 (2003), 第 2155–2162 页 )。
序列。100CN 102458471 A序列序列表表1/199 页<110> GLAXO GROUP LIMITED Peter ADAMSON Gerald Wayne GOUGH Peter Franz ERTL Volker GERMASCHEWSKI Michael STEWARD <120> 抗原结合蛋白<130> PB63684 WO <150> 61/181887 <151> 2009-05-28 <160> 165 <170> 用于 Windows4.0 版的 FastSEQ <210> <211> <212> <213> 1 116 PRT 人工序列<220> <223> 抗 -VEGF dAb DOM15-26-593<400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Val Ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20 Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala 35 40Gly Gly Leu Val Gln 10 Ser Gly Phe Thr Phe 25 Pro Gly Lys Gly Leu 45101Pro Gly Gly 15 Lys Ala Tyr 30 Glu Trp ValCN 102458471 A序列表Tyr Tyr Ala Asp Ser 60 Ser Lys Asn Thr Leu 75 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Gly Gln Gly Thr Leu 110 Val Tyr 80 Cys Val2/199 页Ser Glu Ile Ser Pro 50 Lys Gly Arg Phe Thr 65 Leu Gln Met Asn Ser 85 Ala Lys Asp Pro Arg 100 Thr Val Ser Ser 115Ser Gly Ser Tyr Thr 55 Ile Ser Arg Asp Asn 70 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Lys Leu Asp Tyr Trp 105<210> <211> <212> <213>2 94 PRT 人工序列<220> <223> 抗 -TNF-α adnectin <400> 2 Val Ser Asp Val 1 Ser Leu Leu Ile 20 Arg Ile Thr Tyr 35 Thr Val Pro His 50 Gly Val Asp Asp 65 Pro Leu Arg IlePro Arg Asp Leu Glu 5 Ser Trp Asp Thr His 25 Gly Glu Thr Gly Gly 40 Pro Glu Val Thr Ala 55 Thr Ile Thr Val Tyr 70 Phe Gly Pro Ile Ser 85Val Val Ala Ala Thr 10 Asn Ala Tyr Asn Gly 30 Asn Ser Pro Val Arg 45 Thr Ile Ser Gly Leu 60 Ala Val Thr Asn His 75 Ile Asn His Arg Thr 90Pro Thr 15 Tyr Tyr Glu Phe Lys Pro His Met 80<210> <211> <212> <213>3 5 PRT 人工序列102CN 102458471 A序列表3/199 页<220> <223> G4S 连接物 <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5<210> <211> <212> <213>4 6 PRT 人工序列<220> <223> 连接物 <400> 4 Thr Val Ala Ala Pro Ser 1 5<210> <211> <212> <213>5 7 PRT 人工序列<220> <223> 连接物 <400> 5 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Thr 1 5<210> <211> <212> <213>6 7 PRT 人工序列103CN 102458471 A序列表4/199 页<220> <223> 连接物 <400> 6 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 1 5<210> <211> <212> <213>7 2 PRT 人工序列<220> <223> 连接物 <400> 7 Gly Ser 1<210> <211> <212> <213>8 8 PRT 人工序列<220> <223> 连接物 <400> 8 Thr Val Ala Ala Pro Ser Gly Ser 1 5<210> <211> <212> <213>9 19 PRT 人工序列104CN 102458471 A序列表5/199 页<220> <223> 信号肽序列 <400> 9 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser<210> <211> <212> <213>10 445 PRT 智人<220> <223> 抗 -TNF-α mAb ( 阿达木单抗 ) 重链 <400> 10 Glu Val Gln Leu Val 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser 20 Ala Met His Trp Val 35 Ser Ala Ile Thr Trp 50 Glu Gly Arg Phe Thr 65 Leu Gln Met Asn Ser 85 Ala Lys Val Ser Tyr 100 Gln Gly Thr Leu Val 115 Val Phe Pro Leu Ala 130 Ala Leu Gly Cys LeuGlu Ser Gly Gly Gly 10 Cys Ala Ala Ser Gly 25 Arg Gln Ala Pro Gly 40 Asn Ser Gly His Ile 55 Ile Ser Arg Asp Asn 70 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Leu Ser Thr Ala Ser 105 Thr Val Ser Ser Ala 120 Pro Ser Ser Lys Ser 135 Val Lys Asp Tyr Phe105Leu Val Gln Pro Gly 15 Phe Thr Phe Asp Asp 30 Lys Gly Leu Glu Trp 45 Asp Tyr Ala Asp Ser 60 Ala Lys Asn Ser Leu 75 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Ser Leu Asp Tyr Trp 110 Ser Thr Lys Gly Pro 125 Thr Ser Gly Gly Thr 140 Pro Glu Pro Val ThrArg Tyr Val Val Tyr 80 Cys Gly Ser Ala ValCN 102458471 A序列表155 Val His Thr Phe Pro 175 Val Val 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Lys Val Glu 215 Pro Cys Pro Ala Pro 230 Pro Pro Lys Pro Lys 250 Thr Cys Val Val Val 265 Asn Trp Tyr Val Asp 280 Arg Glu Glu Gln Tyr 295 His Gln Asp Trp Leu 310 Lys Ala Leu Pro Ala 330 Gln Pro Arg Glu Pro 345 Leu Thr Lys Asn Gln 360 Pro Ser Asp Ile Ala 375 Asn Tyr Lys Thr Thr 390 Lys Lys Leu Thr Val 410 Ser Cys Ser Val Met 425 Ser Leu Ser Leu Ser 440106CN 102458471 A序列表7/199 页<210> <211> <212> <213>11 642 DNA 智人<220> <223> 抗 -TNF-α mAb ( 阿达木单抗 ) 轻链 <400> 11 gatatccaga atcacctgcc ggcaaggccc agattcagcg gaggacgtgg ggcaccaagg agcgatgagc ccccgggagg gagagcgtga ctgagcaagg ctgtccagcc <210> <211> <212> <213> 12 214 PRT 智人tgacccagag gggccagcca ctaagctgct gcagcggctc ccacctacta tggagatcaa agctcaagag ccaaagtgca ccgagcagga ccgactacga ccgtgaccaaccccagcagc gggcatcaga gatctacgcc cggcaccgac ctgccagcgg gcgtacggtg cggcaccgcc gtggaaagtg cagcaaggac gaagcacaaa gagcttcaacctgagcgcct aactacctgg gccagcaccc ttcaccctga tacaacagag gccgccccca agcgtggtgt gacaacgccc tccacctaca gtgtacgcct cggggcgagtctgtgggcga cctggtatca tgcagagcgg ccatcagcag ccccttacac gcgtgttcat gtctgctgaa tgcagagcgg gcctgagcag gcgaagtgac gctagagtgacc gcagaagcct cgtgcccagc cctgcagccc cttcggccag cttccccccc caacttctac caacagccag caccctgacc ccaccagggc60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 642<220> <223> 抗 -TNF-α mAb ( 阿达木单抗 ) 轻链 <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr 1 5 Asp Arg Val Thr Ile 20 Leu Ala Trp Tyr Gln 35 Tyr Ala Ala Ser Thr 50 Ser Gly Ser Gly ThrGln Ser Pro Ser Ser 10 Thr Cys Arg Ala Ser 25 Gln Lys Pro Gly Lys 40 Leu Gln Ser Gly Val 55 Asp Phe Thr Leu Thr107Leu Ser Ala Ser Val 15 Gln Gly Ile Arg Asn 30 Ala Pro Lys Leu Leu 45 Pro Ser Arg Phe Ser 60 Ile Ser Ser Leu GlnGly Tyr Ile Gly ProCN 102458471 A序列表75 Tyr Asn Arg Ala Pro 95 Lys Arg Thr Val Ala 110 Glu Gln Leu Lys Ser 125 Phe Tyr Pro Arg Glu 140 Gln Ser Gly Asn Ser 155 Ser Thr Tyr Ser Leu 175 Glu Lys His Lys Val 190 Ser Pro Val Thr Lys 205 80 Tyr Ala Gly Ala Gln 160 Ser Tyr Ser8/199 页65 Glu Asp Val Ala Thr 85 Thr Phe Gly Gln Gly 100 Pro Ser Val Phe Ile 115 Thr Ala Ser Val Val 130 Lys Val Gln Trp Lys 145 Glu Ser Val Thr Glu 165 Ser Thr Leu Thr Leu 180 Ala Cys Glu Val Thr 195 Phe Asn Arg Gly Glu 21070 Tyr Tyr Cys Gln Arg 90 Thr Lys Val Glu Ile 105 Phe Pro Pro Ser Asp 120 Cys Leu Leu Asn Asn 135 Val Asp Asn Ala Leu 150 Gln Asp Ser Lys Asp 170 Ser Lys Ala Asp Tyr 185 His Gln Gly Leu Ser 200 Cys<210> <211> <212> <213>13 1710 DNA 人工序列<220> <223> 抗 -TNF-α mAb ( 阿达木单抗 )-DOM15-26-593 重链 (DMS4000 mAbdAb 重链 )<400> 13 gaggtgcagc agctgtgccg cctggcaagg gccgacagcg ctgcagatga tacctgagca agcgctagcatggtggagtc ccagcggctt gcctggagtg tggagggcag acagcctgag ccgccagcag ccaagggccctggcggcgga caccttcgac ggtgtccgcc attcaccatc agccgaggac cctggactac cagcgtgttcctggtgcagc gactacgcca atcacctgga agccgggaca accgccgtgt tggggccagg cccctggccc108ccggcagaag tgcactgggt atagcggcca acgccaagaa actactgtgc gcaccctggt ccagcagcaacctgagactg gaggcaggcc catcgactac cagcctgtac caaggtgtcc gacagtctcg gagcaccagc60 120 180 240 300 360 420CN 102458471 A序ccgccctggg gcggagccct actccctgag gcaacgtgaa gcgataagac tgttcctgtt cctgcgtggt acggcgtgga accgcgtggt agtgcaaagt agggccagcc agaaccaggt agtgggagag gcgatggcag gcaacgtgtt gtctgagcct gcttggtaca aggcttatcc agatttcgcc tctcccgcga acaccgcggt ccctggtcac ctgcctggtg gacctccggc cagcgtggtg ccacaagccc ccacacctgc cccccccaag ggtggatgtg agtgcacaac gtctgtgctg gagcaacaag tagagagccc gtccctgacc caacggccag cttcttcctg cagctgcagc gtcccctggc gcctgggggg gatgatgtgg ttcgggttct caattccaag atattactgt cgtctcgagc列表tccccgagcc tccccgccgt gcagcagcct aagtggacaa ctgcccccga ccctgatgat accctgaagt agcccagaga accaggattg cccctatcga ccctgcctcc agggcttcta actacaagac tgaccgtgga aggccctgca gtgaggtgca tctcctgtgc ctccagggaa acgcagactc atctgcaaat ctcggaagtt tgtgaccgtg gctgcagagc gggcacccag gaaagtggag gctgctgggc cagcaggacc gaagttcaac ggagcagtac gctgaacggc gaaaaccatc ctccagagat ccccagcgac caccccccct caagagcaga caatcactac gctgttggtg agcctccgga gggtctagag cgtgaagggc gaacagcctg agactactgg9/199 页ggcggcacag tcctggaata agcggcctgt acctacatct cccaagagct ggacctagcg cccgaagtga tggtacgtgg aacagcacct aaggagtaca agcaaggcca gagctgacca atcgccgtgg gtgctggaca tggcagcagg acccagaaga tctgggggag ttcaccttta tgggtttcag cggttcacca cgtgccgagg ggtcagggaa <210> <211> <212> <213>aaggactact gtgcacacct accgtgccca agcaacacca cccccctgcc cctaaggaca agccacgagg gccaagacca accgtgctgc gccctgcctg caggtctaca tgtctggtga cccgagaaca tactccaagc gtgatgcacg aagtcgaccg tccctgcgtc gtccgccagg tatacatact aacacgctgt gcgaaagatc480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 171014 564 PRT 人工序列<220> <223> 抗 -TNF-α mAb ( 阿达木单抗 )-DOM15-26-593 重链 (DMS4000 mAbdAb 重链 )<400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20 Ala Met His Trp Val Arg Gln AlaGly Gly Leu Val Gln 10 Ser Gly Phe Thr Phe 25 Pro Gly Lys Gly Leu109Pro Gly Arg 15 Asp Asp Tyr 30 Glu Trp ValCN 102458471 A序列表45 Tyr Ala Asp Ser Val 60 Lys Asn Ser Leu Tyr 80 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Leu Asp Tyr Trp Gly 110 Thr Lys Gly Pro Ser 125 Ser Gly Gly Thr Ala 140 Glu Pro Val Thr Val 160 His Thr Phe Pro Ala 175 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Val 170 Ser Leu Ser Ser Val 185 Thr Tyr Ile Cys Asn 200 Lys Lys Val Glu Pro 215 Cys Pro Ala Pro Glu 235 Pro Lys Pro Lys Asp 250 Cys Val Val Val Asp 265 Trp Tyr Val Asp Gly 280 Glu Glu Gln Tyr Asn 295 Gln Asp Trp Leu Asn 315 Ala Leu Pro Ala Pro 330 Pro Arg Glu Pro Gln 345110CN 102458471 A序Asp Glu Leu Thr Lys 360 Phe Tyr Pro Ser Asp 375 Glu Asn Asn Tyr Lys 390 Phe Phe Lys Lys Leu 405 Val Phe Ser Cys Ser 420 Gln Lys Ser Leu Ser 440 Leu Leu Val Ser Gly 455 Leu Ser Cys Ala Ala 470 Trp Val Arg Gln Ala 485 Ser Pro Ser Gly Ser 500 Phe Thr Ile Ser Arg 520 Asn Ser Leu Arg Ala 535 Pro Arg Lys Leu Asp 550 Ser列表Thr Cys Leu Glu Ser Asn Leu Asp Ser 400 Arg Trp Gln 415 Leu His Asn 430 Ser Thr Gly Pro Gly Gly Lys Ala Tyr 480 Glu Trp Val 495 Asp Ser Val 510 Thr Leu Tyr Tyr Tyr Cys Thr Leu Val 56011/199 页Pro Ser Arg 355 Val Lys Gly 370 Gly Gln Pro 385 Asp Gly Ser Gln Gly Asn His Tyr Thr 435 Glu Val Gln 450 Ser Leu Arg 465 Pro Met Met Ser Glu Ile Lys Gly Arg 515 Leu Gln Met 530 Ala Lys Asp 545 Thr Val SerAsn Gln Val Ser Leu 365 Ile Ala Val Glu Trp 380 Thr Thr Pro Pro Val 395 Thr Val Asp Lys Ser 410 Val Met His Glu Ala 425 Leu Ser Pro Gly Lys 445 Gly Gly Leu Val Gln 460 Ser Gly Phe Thr Phe 475 Pro Gly Lys Gly Leu 490 Tyr Thr Tyr Tyr Ala 505 Asp Asn Ser Lys Asn 525 Glu Asp Thr Ala Val 540 Tyr Trp Gly Gln Gly 555<210> <211> <212> <213>15 568 PRT 人工序列<220> <223> DOM 15-26- 抗 -TNF-α mAb ( 阿达木单抗 ) 重链 <400> 15111CN 102458471 A序列表Leu Val Gln Pro Gly 15 Phe Thr Phe Gly Ala 30 Lys Gly Leu Glu Trp 45 Tyr Tyr Ala Asp Ser 60 Ser Lys Asn Thr Leu 75 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Gly Gln Gly Thr Leu 110 Ser Glu Val Gln Leu 125 Arg Ser Leu Arg Leu 140 Tyr Ala Met His Trp 155 Val Ser Ala Ile Thr 175 Val Glu Gly Arg Phe 190 Tyr Leu Gln Met Asn 205 Cys Ala Lys Val Ser 220 Gly Gln Gly Thr Leu 235 Ser Val Phe Pro Leu 255 Ala Ala Leu Gly Cys 270 Val Ser Trp Asn Ser 285 Ala Val Leu Gln Ser 300 Ser Ser Ser Leu Gly Gly Tyr Val Val Tyr 80 Cys Val Val Ser Val 160 Trp Thr Ser Tyr Val 240 Ala Leu Gly Ser Thr12/199 页Glu 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A序列表16/199 页<210> <211> <212> <213>17 119 PRT 人工序列<220> <223> 抗 -TNFR1 dAb (DOM1h-131-206) <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser 20 Thr Met Val Trp Val 35 Ser His Ile Pro Pro 50 Lys Gly Arg Phe Thr 65 Leu Gln Met Asn Ser 85 Ala Leu Leu Pro Lys 100 Thr Leu Val Thr Val 115Glu Ser Gly Gly Gly 10 Cys Ala Ala Ser Gly 25 Arg Gln Ala Pro Gly 40 Asp Gly Gln Asp Pro 55 Ile Ser Arg Asp Asn 70 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Arg Gly Pro Trp Phe 105 Ser SerLeu Val Gln Pro Gly 15 Phe Thr Phe Ala His 30 Lys Gly Leu Glu Trp 45 Phe Tyr Ala Asp Ser 60 Ser Lys Asn Thr Leu 75 Thr Ala Val Tyr His 95 Asp Tyr Trp Gly Gln 110Gly Glu Val Val Tyr 80 Cys Gly<210> <211> <212> <213>18 86 PRT 人工序列<220> <223> 抗 -VEGFR2 adnectin <400> 18 Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu Leu Ile Ser Trp Arg His 1 5 10 15116CN 102458471 A序列表Ile Thr Tyr Gly Glu 30 Val Pro Leu Gln Pro 45 Val Asp Tyr Thr Ile 60 Arg Leu Leu Ser Ile 75 Thr Gly Pro Thr Thr Val Pro Ile 8017/199 页Pro His Phe Pro 20 Gly Asn Ser Pro 35 Ala Thr Ile Ser 50 Tyr Ala Val Thr 65 Ser Ile Asn TyrThr Arg Tyr Tyr Arg 25 Val Gln Glu Phe Thr 40 Gly Leu Lys Pro Gly 55 Asp Gly Arg Asn Gly 70 Arg Thr 85<210> <211> <212> <213>19 150 PRT 人工序列<220> <223> 抗 -VEGF anticalin <400> 19 Asp Gly Gly Gly Ile 1 5 Ala Met Thr Val Asp 20 Thr Pro Met Thr Leu 35 Val Thr Met Leu Ile 50 Gly Arg Thr Lys Glu 65 Val Ala Tyr Ile Ile 85 Ser Glu Gly Gln Leu 100 Gly Arg Asp Pro Lys 115 Ala Ala Gly Arg Leu 130Arg Arg Ser Met Ser 10 Arg Glu Phe Pro Glu 25 Thr Leu Leu Lys Gly 40 Ser Gly Arg Cys Gln 55 Arg Lys Lys Tyr Thr 70 Pro Ser Ala Val Arg 90 His Gly Lys Pro Val 105 Asn Asn Leu Glu Ala 120 Ser Thr Glu Ser Ile 135117Gly Thr Trp Tyr Leu 15 Met Asn Leu Glu Ser 30 His Asn Leu Glu Ala 45 Glu Val Lys Ala Val 60 Ala Asp Gly Gly Lys 75 Asp His Val Ile Phe 95 Arg Gly Val Lys Leu 110 Leu Glu Asp Phe Glu 125 Leu Ile Pro Arg Gln 140Lys Val Lys Leu His 80 Tyr Val Lys SerCN 102458471 A序列表18/199 页Glu Thr Cys Ser Pro Gly 145 150<210> <211> <212> <213>20 447 PRT 人工序列<220> <223> 替代性的抗 -VEGF 抗体重链 <400> 20 Glu Val Gln Leu Val 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser 20 Gly Met Asn Trp Val 35 Gly Trp Ile Asn Thr 50 Lys Arg Arg Phe Thr 65 Leu Gln Met Asn Ser 85 Ala Lys Tyr Pro His 100 Trp Gly Gln Gly Thr 115 Pro Ser Val Phe Pro 130 Thr Ala Ala Leu Gly 145 Thr Val Ser Trp Asn 165 Pro Ala Val Leu Gln 180 Pro Ser Ser Ser Leu 195Glu Ser Gly Gly Gly 10 Cys Ala Ala Ser Gly 25 Arg Gln Ala Pro Gly 40 Tyr Thr Gly Glu Pro 55 Phe Ser Leu Asp Thr 70 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Tyr Tyr Gly Ser Ser 105 Leu Val Thr Val Ser 120 Leu Ala Pro Ser Ser 135 Cys Leu Val Lys Asp 150 Ser Gly Ala Leu Thr 170 Ser Ser Gly Ser Leu 185 Gly Thr Gln Thr Tyr 200118Leu Val Gln Pro Gly 15 Tyr Thr Phe Thr Asn 30 Lys Gly Leu Glu Trp 45 Thr Tyr Ala Ala Asp 60 Ser Lys Ser Thr Ala 75 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 His Trp Tyr Phe Asp 110 Ser Ala Ser Thr Lys 125 Lys Ser Thr Ser Gly 140 Tyr Phe Pro Glu Pro 155 Ser Gly Val His Thr 175 Ser Ser Val Val Thr 190 Ile Cys Asn Val Asn 205Gly Tyr Val Phe Tyr 80 Cys Tyr Gly Gly Val 160 Phe Val HisCN 102458471 A序列表Val Glu Pro Lys Ser 220 Ala Pro Glu Leu Leu 235 Pro Lys Asp Thr Leu 255 Val Val Asp Val Ser 270 Val Asp Gly Val Glu 285 Gln Tyr Asn Ser Tyr 300 Trp Leu Asn Gly Lys 315 Pro Ala Pro Ile Glu 335 Glu Pro Gln Val Tyr 350 Asn Gln Val Ser Leu 365 Ile Ala Val Glu Trp 380 Thr Thr Pro Pro Val 395 Thr Val Asp Lys Ser 415 Val Met His Glu Ala 430 Leu Ser Pro Gly Lys 445 Cys Gly 240 Met His Val Val Glu 320 Lys Thr Thr Glu Leu 400 Arg Leu19/199 页Lys Pro Ser Asn Thr 210 Asp Lys Thr His Thr 225 Gly Pro Ser Val Phe 245 Ile Ser Arg Thr Pro 260 Glu Asp Pro Glu Val 275 His Asn Ala Lys Thr 290 Val Ser Val Leu Thr 305 Tyr Lys Cys Lys Val 325 Thr Ile Ser Lys Ala 340 Leu Pro Pro Ser Arg 355 Cys Leu Val Lys Gly 370 Ser Asn Gly Gln Pro 385 Asp Ser Asp Gly Ser 405 Trp Gln Gln Gly Asn 420 His Asn His Tyr Thr 435Lys Val Asp Lys Lys 215 Cys Pro Pro Cys Pro 230 Leu Phe Pro Pro Lys 250 Glu Val Thr Cys Val 265 Lys Phe Asn Trp Tyr 280 Lys Pro Arg Glu Glu 295 Val Leu His Gln Asp 310 Ser Asn Lys Ala Leu 330 Lys Gly Gln Pro Arg 345 Asp Glu Leu Thr Lys 360 Phe Tyr Pro Ser Asp 375 Glu Asn Asn Tyr Lys 390 Phe Phe Lys Lys Leu 410 Val Phe Ser Cys Ser 425 Gln Lys Ser Leu Ser 440<210> <211> <212> <213>21 214 PRT 人工序列<220> <223> 抗 -VEGF 抗体 ( 贝伐单抗 ) 轻链119CN 102458471 A序列表20/199 页<400> 21 Asp Ile Gln Met Thr 1 5 Asp Arg Val Thr Ile 20 Leu Asn Trp Tyr Gln 35 Tyr Phe Thr Ser Ser 50 Ser Gly Ser Gly Thr 65 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Thr Phe Gly Gln Gly 100 Pro Ser Val Phe Ile 115 Thr Ala Ser Val Val 130 Lys Val Gln Trp Lys 145 Glu Ser Val Thr Glu 165 Ser Thr Leu Thr Leu 180 Ala Cys Glu Val Thr 195 Phe Asn Arg Gly Glu 210Gln Ser Pro Ser Ser 10 Thr Cys Ser Ala Ser 25 Gln Lys Pro Gly Lys 40 Leu His Ser Gly Val 55 Asp Phe Thr Leu Thr 70 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Thr Lys Val Glu Ile 105 Phe Pro Pro Ser Asp 120 Cys Leu Leu Asn Asn 135 Val Asp Asn Ala Leu 150 Gln Asp Ser Lys Asp 170 Ser Lys Ala Asp Tyr 185 His Gln Gly Leu Ser 200 CysLeu Ser Ala Ser Val 15 Gln Asp Ile Ser Asn 30 Ala Pro Lys Val Leu 45 Pro Ser Arg Phe Ser 60 Ile Ser Ser Leu Gln 75 Tyr Ser Thr Val Pro 95 Lys Arg Thr Val Ala 110 Glu Gln Leu Lys Ser 125 Phe Tyr Pro Arg Glu 140 Gln Ser Gly Asn Ser 155 Ser Thr Tyr Ser Leu 175 Glu Lys His Lys Val 190 Ser Pro Val Thr Lys 205Gly Tyr Ile Gly Pro 80 Trp Ala Gly Ala Gln 160 Ser Tyr Ser<210> <211> <212> <213>22 447 PRT 人工序列<220> <223> 替代性的抗 -VEGF 抗体 ( 贝伐单抗 ) 重链120CN 102458471 A序列表21/199 页<400> 22 Glu Val Gln Leu Val 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser 20 Gly Met Asn Trp Val 35 Gly Trp Ile Asn Thr 50 Lys Arg Arg Phe Thr 65 Leu Gln Met Asn Ser 85 Ala Lys Tyr Pro His 100 Trp Gly Gln Gly Thr 115 Pro Ser Val Phe Pro 130 Thr Ala Ala Leu Gly 145 Thr Val Ser Trp Asn 165 Pro Ala Val Leu Gln 180 Pro Ser Ser Ser Leu 195 Lys Pro Ser Asn Thr 210 Asp Lys Thr His Thr 225 Gly Pro Ser Val Phe 245 Ile Ser Arg Thr Pro 260 Glu Asp Pro Glu Val 275 His Asn Ala Lys ThrGlu Ser Gly Gly Gly 10 Cys Ala Ala Ser Gly 25 Arg Gln Ala Pro Gly 40 Tyr Thr Gly Glu Pro 55 Phe Ser Leu Asp Thr 70 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Tyr Tyr Gly Ser Ser 105 Leu Val Thr Val Ser 120 Leu Ala Pro Ser Ser 135 Cys Leu Val Lys Asp 150 Ser Gly Ala Leu Thr 170 Ser Ser Gly Ser Leu 185 Gly Thr Gln Thr Tyr 200 Lys Val Asp Lys Lys 215 Cys Pro Pro Cys Pro 230 Leu Phe Pro Pro Lys 250 Glu Val Thr Cys Val 265 Lys Phe Asn Trp Tyr 280 Lys Pro Arg Glu Glu121Leu Val Gln Pro Gly 15 Tyr Thr Phe Thr Asn 30 Lys Gly Leu Glu Trp 45 Thr Tyr Ala Ala Asp 60 Ser Lys Ser Thr Ala 75 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 His Trp Tyr Phe Asp 110 Ser Ala Ser Thr Lys 125 Lys Ser Thr Ser Gly 140 Tyr Phe Pro Glu Pro 155 Ser Gly Val His Thr 175 Ser Ser Val Val Thr 190 Ile Cys Asn Val Asn 205 Val Glu Pro Lys Ser 220 Ala Pro Glu Leu Leu 235 Pro Lys Asp Thr Leu 255 Val Val Asp Val Ser 270 Val Asp Gly Val Glu 285 Gln Tyr Asn Ser TyrGly Tyr Val Phe Tyr 80 Cys Val Gly Gly Val 160 Phe Val His Cys Gly 240 Met His Val ValCN 102458471 A序列表300 Trp Leu Asn Gly Lys 315 Pro Ala Pro Ile Glu 335 Glu Pro Gln Val Tyr 350 Asn Gln Val Ser Leu 365 Ile Ala Val Glu Trp 380 Thr Thr Pro Pro Val 395 Thr Val Asp Lys Ser 415 Val Met His Glu Ala 430 Leu Ser Pro Gly Lys 445 Glu 320 Lys Thr Thr Glu Leu 400 Arg Leu22/199 页290 Val Ser Val Leu Thr 305 Tyr Lys Cys Lys Val 325 Thr Ile Ser Lys Ala 340 Leu Pro Pro Ser Arg 355 Cys Leu Val Lys Gly 370 Ser Asn Gly Gln Pro 385 Asp Ser Asp Gly Ser 405 Trp Gln Gln Gly Asn 420 His Asn His Tyr Thr 435295 Val Leu His Gln Asp 310 Ser Asn Lys Ala Leu 330 Lys Gly Gln Pro Arg 345 Asp Glu Leu Thr Lys 360 Phe Tyr Pro Ser Asp 375 Glu Asn Asn Tyr Lys 390 Phe Phe Lys Lys Leu 410 Val Phe Ser Cys Ser 425 Gln Lys Ser Leu Ser 440<210> <211> <212> <213>23 116 PRT 人工序列<220> <223> 抗 -VEGF dAb DOM15-26 <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser 20 Pro Met Met Trp Val 35 Ser Glu Ile Ser Pro 50 Lys Gly Arg Phe ThrGlu Ser Gly Gly Gly 10 Cys Ala Ala Ser Gly 25 Arg Gln Ala Pro Gly 40 Ser Gly Ser Tyr Thr 55 Ile Ser Arg Asp Asn122Leu Val Gln Pro Gly 15 Phe Thr Phe Gly Ala 30 Lys Gly Leu Glu Trp 45 Tyr Tyr Ala Asp Ser 60 Ser Lys Asn Thr LeuGly Tyr Val Val TyrCN 102458471 A序列表23/199 页65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115<210> <211> <212> <213>24 568 PRT 人工序列<220> <223> DOM15-26-593- 抗 -TNF-α mAb ( 阿达木单抗 ) 重链 <400> 24 Glu Val Gln Leu Leu 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser 20 Pro Met Met Trp Val 35 Ser Glu Ile Ser Pro 50 Lys Gly Arg Phe Thr 65 Leu Gln Met Asn Ser 85 Ala Lys Asp Pro Arg 100 Thr Val Ser Ser Ala 115 Glu Ser Gly Gly Gly 130 Cys Ala Ala Ser Gly 145 Arg Gln Ala Pro GlyVal Ser Gly Gly Gly 10 Cys Ala Ala Ser Gly 25 Arg Gln Ala Pro Gly 40 Ser Gly Ser Tyr Thr 55 Ile Ser Arg Asp Asn 70 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Lys Leu Asp Tyr Trp 105 Ser Thr Lys Gly Pro 120 Leu Val Gln Pro Gly 135 Phe Thr Phe Asp Asp 150 Lys Gly Leu Glu Trp123Leu Val Gln Pro Gly 15 Phe Thr Phe Lys Ala 30 Lys Gly Leu Glu Trp 45 Tyr Tyr Ala Asp Ser 60 Ser Lys Asn Thr Leu 75 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Gly Gln Gly Thr Leu 110 Ser Glu Val Gln Leu 125 Arg Ser Leu Arg Leu 140 Tyr Ala Met His Trp 155 Val Ser Ala Ile ThrGly Tyr Val Val Tyr 80 Cys Val Val Ser Val 160 TrpCN 102458471 A序列表175 Arg Phe Thr 190 Met Asn Ser Val Ser Tyr Thr Leu Val 240 Pro Leu Ala 255 Gly Cys Leu 270 Asn Ser Gly Gln Ser Ser Leu Gly Thr 320 Thr Lys Val 335 Thr Cys Pro 350 Phe Leu Phe Pro Glu Val Val Lys Phe 400 Thr Lys Pro 415 Thr Val Leu 430 Val Ser Asn Ala Lys Gly Arg Asp Glu 48024/199 页Asn Ile Leu Leu 225 Thr Pro Val Ala Gly 305 Gln Asp Pro Pro Thr 385 Asn Arg His Lys Gln 465165 Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala 180 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 195 200 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp 230 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 245 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 260 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 275 280 Leu Thr Ser Gly Val His Thr 290 295 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 310 Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 325 Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 340 Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 355 360 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 370 375 Cys Val Val Val Asp Val Ser 390 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 405 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Tyr 420 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 435 440 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 450 455 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 470170 Asp Ser Val Glu Gly 185 Ser Leu Tyr Leu Gln 205 Tyr Tyr Cys Ala Lys 220 Tyr Trp Gly Gln Gly 235 Gly Pro Ser Val Phe 250 Gly Thr Ala Ala Leu 265 Val Thr Val Ser Trp 285 Phe Pro Ala Val Leu 300 Val Pro Ser Ser Ser 315 His Lys Pro Ser Asn 330 Cys Asp Lys Thr His 345 Gly Gly Pro Ser Val 365 Met Ile Ser Arg Thr 380 His Glu Asp Pro Glu 395 Val His Asn Ala Lys 410 Val Val Ser Val Leu 425 Glu Tyr Lys Cys Lys 445 Lys Thr Ile Ser Lys 460 Thr Leu Pro Pro Ser 475124CN 102458471 A序列表Leu Val Lys Gly Phe 495 Asn Gly Gln Pro Glu 510 Ser Asp Gly Ser Phe 525 Gln Gln Gly Asn Val 540 Asn His Tyr Thr Gln 555 Tyr Asn Phe Phe Lys 56025/199 页Leu Thr Lys Asn Gln 485 Pro Ser Asp Ile Ala 500 Asn Tyr Lys Thr Thr 515 Lys Lys Leu Thr Val 530 Ser Cys Ser Val Met 545 Ser Leu Ser Leu Ser 565Val Ser Leu Thr Cys 490 Val Glu Trp Glu Ser 505 Pro Pro Val Leu Asp 520 Asp Lys Ser Arg Trp 535 His Glu Ala Leu His 550 Pro Gly Lys<210> <211> <212> <213>25 3 PRT 人工序列<220> <223> 连接物 <400> 25 Ser Thr Gly 1<210> <211> <212> <213>26 1335 DNA 人工序列<220> <223> BPC1821 ( 经由 GS 连接物与抗 -VEGFR2 adnectin 融合的 CTLA4-Ig) <400> 26 atgcatgtcg cccagccagc ggtggtgctg gccagctccc gcggcattgc ctccttcgtg 60 tgcgagtacg ccagccccgg caaggccacc gaggtgcgcg tcacggtgct ccgccaggcc 120 gatagccagg tgaccgaagt gtgtgccgct acgtacatga tggggaacga gctgaccttc 180125CN 102458471 A序ctatctgcac cgatggacac tggggatcgg accaggagcc tgctgggggg ccagaacccc agttcaactg agcagtacaa tgaacggcaa aaacaatctc gccgtgacga ctagcgacat ccccgcccgt agtccaggtg accattacac ccacccccac ggatcaccta agcctcccac acgccgtcac ggacc cgggacctcg gggcctgtac caacggcacg caagtctagt ctccagcgtg cgaggtgacc gtacgtggac cagtacctac ggagtataag caaggccaaa gctgaccaag cgctgtggag gctggactct gcagcaggga acagaagagc cagcctgctg cggcgagacc tgccaccatc cgacggaagg列表aggtgaacct tggagttgat tcatcgaccc atacctctcc cccccaagcc tggatgtgag tgcataacgc ccgtgctcac ctaacaaggc gggaacctca ctctgacctg acgggcagcc tcttcctgta gctgcagcgt gccccggcaa ggcaccccca gccccgtgca agcccggcgt tgctgagcat gaccatccag gtaccccccc cgaaccttgc ccccagcccc taaggacacc tcacgaggac caagaccaag tgtgctgcat cttgcccgcc ggtgtacacc cttggtgaag cgagaacaac cagcaaactg catgcatgag gggatccgag cttccccaca ggagttcacc ggactacacc ccccatcagc26/199 页ctggacgact ggcctgcgcg ccgtactacc cctgacagcg gctccagagc ctgatgatct cctgaggtga cctcgcgagg caggactggc cccatcgaga ctccctccaa ggcttctacc tacaaaacca accgtggaca gccctgcata gtggtggccg cgctactaca gtgcccctgc atcaccgtgt atcaactaca <210> <211> <212> <213>agcgggaacc atctgcaagg cagatctacg gacaagaccc ttcctgtttc tgcgtggtcg ggggtggagg cgcgtggtgt tgcaaggtgt gggcagccca aaccaggtct tgggagtcca gacggctcct aacgtgttca ctgtccctga atttcctgga ggcggcaaca agcggcctca aacggcaggc240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 133527 437 PRT 人工序列<220> <223> BPC1821 ( 经由 GS 连接物与抗 -VEGFR2 adnectin 融合的 CTLA4-Ig) <400> 27 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Thr Val Leu Arg Gln 35 Thr Tyr Met 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Val Lys Phe 180 Ala Lys Thr Lys Pro 195 Val Leu Thr Val Leu 210 Cys Lys Val Ser Asn 225 Ser Lys Ala Lys Gly 245 Pro Ser Arg Asp Glu 260 Val Lys Gly Phe Tyr 275 Gly Gln Pro Glu Asn 290 Asp Gly Ser Phe Phe 305 Gln Gly Asn Val Phe 325 His Tyr Thr Gln Lys 340 Val Val Ala Ala Thr 355 His Phe Pro Thr Arg 37070 Gly Ile Cys Lys Val 90 Ile Gly Asn Gly Thr 105 Asp Ser Asp Gln Glu 120 Pro Ser Pro Ala Pro 135 Pro Pro Lys Pro Lys 150 Thr Cys Val Val Val 170 Asn Trp Tyr Val Asp 185 Arg Glu Glu Gln Tyr 200 His Gln Asp Trp Leu 215 Lys Ala Leu Pro Ala 230 Gln Pro Arg Glu Pro 250 Leu Thr Lys Asn Gln 265 Pro Ser Asp Ile Ala 280 Asn Tyr Lys Thr Thr 295 Lys Lys Leu Thr Val 310 Ser Cys Ser Val Met 330 Ser Leu Ser Leu Ser 345 Pro Thr Ser Leu Leu 360 Tyr Tyr Arg Ile Thr 375127CN 102458471 A序列表Leu Gln Pro Pro Thr 395 Tyr Thr Ile Thr Val 415 Leu Ser Ile Pro Ile 430 Ala 400 Tyr Ser28/199 页Asn Ser Pro Val Gln 385 Thr Ile Ser Gly Leu 405 Ala Val Thr Asp Gly 420 Ile Asn Tyr Arg Thr 435Glu Phe Thr Val Pro 390 Lys Pro Gly Val Asp 410 Arg Asn Gly Arg Leu 425<210> <211> <212> <213>28 1425 DNA 人工序列<220> <223> BPC1825 ( 经由 GS 连接物与抗 -VEGF dAb 融合的 CTLA4-Ig) <400> 28 atgcatgtcg tgcgagtacg gatagccagg ctggacgact ggcctgcgcg ccgtactacc cctgacagcg gctccagagc ctgatgatct cctgaggtga cctcgcgagg caggactggc cccatcgaga ctccctccaa ggcttctacc tacaaaacca accgtggaca gccctgcata gtgcagctcc tgcgccgctacccagccagc ccagccccgg tgaccgaagt ctatctgcac cgatggacac tggggatcgg accaggagcc tgctgggggg ccagaacccc agttcaactg agcagtacaa tgaacggcaa aaacaatctc gccgtgacga ctagcgacat ccccgcccgt agtccaggtg accattacac tggtcagcgg gcggcttcacggtggtgctg caaggccacc gtgtgccgct cgggacctcg gggcctgtac caacggcacg caagtctagt ctccagcgtg cgaggtgacc gtacgtggac cagtacctac ggagtataag caaggccaaa gctgaccaag cgctgtggag gctggactct gcagcaggga acagaagagc cggcggcctg cttcaaggccgccagctccc gaggtgcgcg acgtacatga agcgggaacc atctgcaagg cagatctacg gacaagaccc ttcctgtttc tgcgtggtcg ggggtggagg cgcgtggtgt tgcaaggtgt gggcagccca aaccaggtct tgggagtcca gacggctcct aacgtgttca ctgtccctga gtccagcccg taccccatga128gcggcattgc tcacggtgct tggggaacga aggtgaacct tggagttgat tcatcgaccc atacctctcc cccccaagcc tggatgtgag tgcataacgc ccgtgctcac ctaacaaggc gggaacctca ctctgacctg acgggcagcc tcttcctgta gctgcagcgt gccccggcaa gaggctcact tgtgggtcagctccttcgtg ccgccaggcc gctgaccttc gaccatccag gtaccccccc cgaaccttgc ccccagcccc taaggacacc tcacgaggac caagaccaag tgtgctgcat cttgcccgcc ggtgtacacc cttggtgaag cgagaacaac cagcaaactg catgcatgag gggatccgag gaggctgagc gcaggccccc60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200CN 102458471 A序tggagtgggt agggcaggtt ctctgagggc attggggcca gtctgagatc caccatcagc cgaggacacc gggcactctg列表29/199 页ggcaaaggcc gacagcgtga cagatgaact aagctggact <210> <211> <212> <213>agccccagcg agggacaaca gccgtgtact gtgaccgtgagcagctacac ctactacgcc 1260 gcaagaacac cctgtacctg 1320 actgcgccaa ggaccccagg 1380 gcagc 142529 467 PRT 人工序列<220> <223> BPC1825 ( 经由 GS 连接物与抗 -VEGF dAb 融合的 CTLA4-Ig) <400> 29 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Thr 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页<223> 抗 -VEGF Vk dAb (DOM15-10-11) <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr 1 5 Asp Arg Val Thr Ile 20 Leu Arg Trp Tyr Gln 35 Tyr His Thr Ser Ile 50 Ser Gly Ser Gly Thr 65 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Thr Phe Gly Gln Gly 100Gln Ser Pro Ser Ser 10 Thr Cys Arg Ala Ser 25 Gln Lys Pro Gly Lys 40 Leu Gln Ser Gly Val 55 Asp Phe Thr Leu Thr 70 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Thr Lys Val Glu Ile 105Leu Ser Ala Ser Val 15 Gln Trp Ile Gly Pro 30 Ala Pro Lys Leu Leu 45 Pro Ser Arg Phe Ser 60 Ile Ser Ser Leu Gln 75 Tyr Met Phe Gln Pro 95 Arg GlyGly Glu Ile Gly Pro 80 Met<210> <211> <212> <213>45 86 PRT 人工序列<220> <223> CT01 <400> 45 Glu Val Val Ala Ala 1 5 Pro His Phe Pro Thr 20 Gly Asn Ser Pro Val 35 Ala Thr Ile Ser Gly 50 Tyr Ala Val Thr Asp 65 Ser Ile Asn Tyr ArgThr Pro Thr Ser Leu 10 Arg Tyr Tyr Arg Ile 25 Gln Glu Phe Thr Val 40 Leu Lys Pro Gly Val 55 Gly Arg Asn Gly Arg 70 Thr145Leu Ile Ser Trp Arg 15 Thr Tyr Gly Glu Thr 30 Pro Leu Gln Pro Pro 45 Asp Tyr Thr Ile Thr 60 Leu Leu Ser Ile Pro 75His Gly Thr Val Ile 80CN 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AVG22 引物 <400> 56 attatgggat ccaccggcga catccagatg acccagtctc c <210> <211> <212> <213> 57 37 DNA 人工序列41<220> <223> AVG36 引物 <400> 57 gcgccgccac cgtacgtttg atttccacct tggtccc <210> <211> <212> <213> 58 45 DNA 人工序列37<220> <223> AVG37 引物 <400> 58 caaacgtacg gtggcggcgc cgagcgaggt gcagctgttg gtgtc <210> <211> <212> <213> 59 34 DNA 人工序列45<220> <223> AVG25 引物157CN 102458471 A序列表58/199 页<400> 59 ttatgtcaag cttttagctc gagacggtga ccag <210> <211> <212> <213> 60 36 DNA 人工序列34<220> <223> AVG24 引物 <400> 60 ggtggaaatc aaacgtacgg tggcggcgcc gagcga <210> <211> <212> <213> 61 693 DNA 人工序列36<220> <223> DOM15-26-593 - PEP1-5-19 线内融合体 <400> 61 gaggtgcagc tcctgtgcag ccagggaagg gcagactccg ctgcaaatga cggaagttag ggccccagcg cgtgtcacca cagaaaccag gtcccatcac ctgcaacctg ttcggccaag <210> 62 <211> 231 <212> PRT158tgttggtgtc cctccggatt gtctagagtg tgaagggccg acagcctgcg actactgggg acatccagat tcacttgccg ggaaagcccc gtttcagtgg aagattttgc ggaccaaggttgggggaggc cacctttaag ggtttcagag gttcaccatc tgccgaggac tcagggaacc gacccagtct ggcaagtcag taagctcctg cagtggatct tacgtactac ggaaatcaaattggtacagc gcttatccga atttcgcctt tcccgcgaca accgcggtat ctggtcaccg ccatcctctc agcattgata atctatagtg gggacagatt tgtcaacagg cggctggggggtc tgatgtgggt cgggttctta attccaagaa attactgtgc tctcgagcgc tgtctgcatc gttatttaca catccgagtt tcactctcac ttgtgtggcgcctgcgtctc ccgccaggct tacatactac cacgctgtat gaaagatcct tagcaccaag tgtaggagac ttggtaccag gcaaagtggg catcagcagt tccttttacg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 693CN 102458471 A序列表59/199 页<213> 人工序列 <220> <223> DOM15-26-593 - PEP1-5-19 线内融合体 <400> 62 Glu Val Gln Leu Leu 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser 20 Pro Met Met Trp Val 35 Ser Glu Ile Ser Pro 50 Lys Gly Arg Phe Thr 65 Leu Gln Met Asn Ser 85 Ala Lys Asp Pro Arg 100 Thr Val Ser Ser Ala 115 Gln Ser Pro Ser Ser 130 Thr Cys Arg Ala Ser 145 Gln Lys Pro Gly Lys 165 Leu Gln Ser Gly Val 180 Asp Phe Thr Leu Thr 195 Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 Thr Lys Val Glu Ile 225Val Ser Gly Gly Gly 10 Cys Ala Ala Ser Gly 25 Arg Gln Ala Pro Gly 40 Ser Gly Ser 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aggcttatcc agatttcgcc tctcccgcga acaccgcggt ccctggtcactccatcctct gagcattgat gatctatagt tgggacagat ctgtcaacag acgtacggtg gcctgggggg gatgatgtgg ttcgggttct caattccaag atattactgt cgtctcgagcctgtctgcat agttatttac gcatccgagt ttcactctca gttgtgtggc gcggcgccga tccctgcgtc gtccgccagg tatacatact aacacgctgt gcgaaagatcctgtaggaga attggtacca tgcaaagtgg ccatcagcag gtccttttac gcgaggtgca tctcctgtgc ctccagggaa acgcagactc atctgcaaat ctcggaagttccgtgtcacc gcagaaacca ggtcccatca tctgcaacct gttcggccaa gctgttggtg agcctccgga gggtctagag cgtgaagggc gaacagcctg agactactgg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 69064 230 PRT 人工序列<220> <223> PEP1-5-19-DOM15-26-593 线内融合体 <400> 64 Asp Ile Gln Met Thr 1 5 Asp Arg Val Thr Ile 20 Leu His Trp Tyr Gln 35 Tyr Ser Ala Ser Glu 50 Ser Gly Ser Gly ThrGln Ser Pro Ser Ser 10 Thr Cys Arg Ala Ser 25 Gln Lys Pro Gly Lys 40 Leu Gln Ser Gly Val 55 Asp Phe Thr Leu Thr160Leu Ser Ala Ser Val 15 Gln Ser Ile Asp Ser 30 Ala Pro Lys Leu Leu 45 Pro Ser Arg Phe Ser 60 Ile Ser Ser Leu GlnGly Tyr 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Ala Leu His Asn 430 Gly Lys Gly Ser Thr 445 Pro Ser Gly Ser Thr 460 Leu Val Ser Gly Gly 480 Ser Cys Ala Ala Ser 495 Val Arg Gln Ala Pro 510 Pro Ser Gly Ser Tyr 525 Thr Ile Ser Arg Asp 540 Ser Leu Arg Ala Glu 560 Arg Lys Leu Asp Tyr 57570/199 页355 Val Lys Gly Phe Tyr Pro 370 Gly Gln Pro Glu Asn Asn 385 390 Asp Gly Ser Phe Phe Lys 405 Gln Gly Asn Val Phe Ser 420 His Tyr Thr Gln Lys Ser 435 Val Ala Ala Pro Ser Gly 450 Val Ala Ala Pro Ser Gly 465 470 Gly Leu Val Gln Pro Gly 485 Gly Phe Thr Phe Lys Ala 500 Gly Lys Gly Leu Glu Trp 515 Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 530 Asn Ser Lys Asn Thr Leu 545 550 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 565 Trp Gly Gln Gly Thr Leu 580360 Ser Asp Ile Ala Val 375 Tyr Lys Thr Thr Pro 395 Lys Leu Thr Val Asp 410 Cys Ser Val Met His 425 Leu Ser Leu Ser Pro 440 Ser Thr Val Ala Ala 455 Ser Glu Val Gln Leu 475 Gly Ser Leu Arg Leu 490 Tyr Pro Met Met Trp 505 Val Ser Glu Ile Ser 520 Val Lys Gly Arg Phe 535 Tyr Leu Gln Met Asn 555 Cys Ala Lys Asp Pro 570 Val Thr Val Ser Ser 585<210> <211> <212> <213>72 595 PRT 人工序列<220> <223> 具有 GS(TVAAPSGS) x4 连接物的抗 -TNF-α mAb ( 阿达木单抗 ) Fc 有缺陷的 -DOM15-26-593 重链170CN 102458471 A序列表71/199 页<400> 72 Glu Val Gln Leu Val 1 5 Ser Leu Arg Leu Ser 20 Ala Met His Trp Val 35 Ser Ala Ile Thr Trp 50 Glu Gly Arg Phe Thr 65 Leu Gln Met Asn Ser 85 Ala Lys Val Ser Tyr 100 Gln Gly Thr Leu Val 115 Val Phe Pro Leu Ala 130 Ala Leu Gly Cys Leu 145 Ser Trp Asn Ser Gly 165 Val Leu Gln Ser Ser 180 Ser Ser Leu Gly Thr 195 Ser Asn Thr Lys Val 210 Thr His Thr Cys Pro 225 Ser Val Phe Leu Phe 245 Arg Thr Pro Glu Val 260 Pro Glu Val Lys Phe 275 Ala Lys Thr Lys ProGlu Ser Gly Gly Gly 10 Cys Ala Ala Ser Gly 25 Arg Gln Ala Pro Gly 40 Asn Ser Gly His Ile 55 Ile Ser Arg Asp Asn 70 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Leu Ser Thr Ala Ser 105 Thr Val Ser Ser Ala 120 Pro Ser Ser Lys Ser 135 Val Lys Asp Tyr Phe 150 Ala Leu Thr Ser Gly 170 Gly Ser Leu Ser Ser 185 Gln Thr Tyr Ile Cys 200 Asp Lys Lys Val Glu 215 Pro Cys Pro Ala Pro 230 Pro Pro Lys Pro Lys 250 Thr Cys Val Val Val 265 Asn Trp 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依那西普 -DOM15-10-11 <400> 74 Leu Pro Ala Gln Val 1 5 Thr Cys Arg Leu Arg 20 Ser Lys Cys Ser Pro 35 Ser Asp Thr Val Cys 50 Trp Asn Trp Val Pro 65 Asp Gln Val Glu Thr 85 Thr Cys Arg Pro Gly 100 Arg Leu Cys Ala Pro 115 Arg Pro Gly Thr Glu 130 Gly Thr Phe Ser Asn 145 Gln Ile Cys Asn ValAla Phe Thr Pro Tyr 10 Glu Tyr Tyr Asp Gln 25 Gly Gln His Ala Lys 40 Asp Ser Cys Glu Asp 55 Glu Cys Leu Ser Cys 70 Gln Ala Cys Thr Arg 90 Trp Tyr Cys Ala Leu 105 Leu Arg Lys Cys Arg 120 Thr Ser Asp Val Val 135 Thr Thr Ser Ser Thr 150 Val Ala Ile Pro Gly175Ala Pro Glu Pro Gly 15 Thr Ala Gln Met Cys 30 Val Phe Cys Thr Lys 45 Ser Thr Tyr Thr Gln 60 Gly Ser Arg Cys Ser 75 Glu Gln Asn Arg Ile 95 Ser Lys Gln Glu Gly 110 Pro Gly Phe Gly Val 125 Cys Lys Pro Cys Ala 140 Asp Ile Cys Arg Pro 155 Asn Ala Ser Met AspSer Cys Thr Leu Ser 80 Cys Cys Ala Pro His 160 AlaCN 102458471 A序列表175 Gly Ala Val 190 Gln Pro Thr Pro Met Gly Lys Ser Cys 240 Leu Leu Gly 255 Thr Leu Met 270 Val Ser His Val Glu Val Ser Tyr Val 320 Gly Lys Glu 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