光信息基因材料及其在基因芯片技术上的应用 技术领域
本发明涉及新型光信息基因材料及其在基因芯片技术上的应用。
背景技术
目前用于基因标记检测的方法很多，如光生物素、地高辛、荧光类化合物等，其中荧光类化合物由于其成本低，检测方便、灵敏等优势，越来越得到广泛应用。市场上较常用的荧光染料，如荧光素等，荧光发射波长在450—600nm范围内，但由于细胞等许多生物物质本身在此范围内都有荧光背景，因此人们正在寻找发射波长大于600nm的近红外荧光染料，在这个范围内可以有效减少荧光背景干扰，从而提高准确性和灵敏度。目前市场上在这个范围内使用的荧光染料主要是花菁类，但由于其合成较复杂，成本较高，使用还不够普遍。专利97120273.3曾报导了一类光化学基因材料，但它是将光致变色基团通过一个荧光化合物连接到基因上，而关于光致变色化合物直接嫁接到基因上，得到光致变色基因材料还未见报导。同时，为了有效简化基因杂交检测过程，目前国际上开始发展分子灯标检测技术，即在基因两端分别连上光信息基团和光淬灭基团，通过杂交前后光信息变化来对基因进行检测，该项技术正在应用到分子杂交领域，它可以大大简化杂交过程，不用分离过量的标记分子，而且准确度和特异性高。但至今尚未见到此类光修饰基因芯片的报导。
发明内容
本发明是提供一种新型光信息基因材料及其在基因芯片技术上的应用，它是新型近红外荧光基因材料、光致变色基因材料和光修饰基因材料，这些材料可以有效提高基因检测的灵敏度、特异性和准确率，并将这些材料应用到基因芯片技术上。
本发明光信息基因材料，是组成为[B]-[L]-[G]、[P]-[L]-[G]或[F]-[L1]-[G]-[L2]-[Q]的化合物，其中[B]和[F]为荧光类光信息功能基团，[P]为光致变色类光信息功能基团，[G]为基因，[Q]为光淬灭基团，[L]、[L1]和[L2]为连接基因与光信息基团的连接臂。
[B]为新型近红外荧光染料苯并[a]吩噁嗪酮类化合物；[P]为光致变色类光功能基团，包括螺吡喃、螺噁嗪、俘精酸酐、二芳基乙烯、偶氮苯类化合物；[L]、[L1]、[L2]为直链多胺、寡聚酰胺或聚乙二醇；[F]为荧光类光功能基团，包括近红外区苯并[a]吩噁嗪酮类化合物、吲哚二羧菁类化合物、德克萨斯红、荧光黄类化合物、曙红、罗丹明类化合物、俄勒冈绿；[Q]为光淬灭基团，包括4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)-苯甲酸(DABCYL)、萘酰亚胺类化合物。[B]的结构为：[Q]的结构为：上述的R、R1、R2、R3可以是甲基、乙基等。本发明地光信息基因材料是通过以下方法制备的：[G]+[L]→[L]-[G]
以上合成路线反应温度为室温，反应时间12—24小时，[L]为直链多胺、寡聚酰胺或聚乙二醇，反应完毕后经色谱纯化。
先将[L1]端用保护基保护，让[Q]与[L1]-[G]-[L2]的[F2]端反应；再将[L1]端去保护，与[F]反应；最后经色谱纯化。
以上反应温度为室温，反应时间24小时，反应完毕后经色谱纯化。
本发明的光信息基因材料应用到基因芯片领域，具体的应用方法是这样的：
(1)将所合成的光信息基因材料[B]-[L]-[G]或[P]-[L]-[G]作为探针分子，与靶分子进行杂交，靶分子也可以用点样机点到尼龙膜或玻片上，作成基因芯片。杂交后除去过量的探针分子，在荧光仪上检测观察，有荧光点的为阳性结果，即靶基因与探针分子可以互补配对，无荧光点的为阴性结果，即靶基因与探针分子不能完全互补配对。
(2)将所合成的光信息基因材料[F]-[L1]-[G]-[L2]-[Q]作为探针分子用点样机点到尼龙膜或玻片上，作成基因芯片，将其与靶基因进行杂交，直接在荧光仪上观察，有荧光点的为阳性结果，即靶基因与探针分子可以互补配对，无荧光点的为阴性结果，即靶基因与探针分子不能完全互补配对。
本发明与现有的技术相比，具有的优点是：(1)由于荧光类化合物荧光发射波长在近红外区，可以大大降低荧光背景的干扰，提高了准确度和灵敏度；合成方法简单，条件温和，成本低。(2)光致变色基因材料检测不受荧光或其它条件的干扰，大大提高了检测准确度度和特异性，而且制备简单，检测方便快速。(3)光修饰基因芯片简化了目前基因芯片的杂交和检测过程，提高了检测的灵敏度和特异性，并大大提高了检测的准确率。
具体实施方式实施例1：合成荧光材料6-羰乙基-9-N-甲基-N-羧乙基-苯并[a]吩噁嗪酮R-P：
将10.4g(42.5mmol)4-亚硝基-N-甲基-N-羧乙基苯胺盐酸盐与8.0g(34.5mmol)1，3-二羟基-2-萘甲酸乙酯在干燥的己腈中加热回流6小时，冷却浓缩后得棕红色化合物6.5g，m.p.232℃。元素分析：Found：C 65.69，H 4.75，N 6.69.Calcd.For C23H20N2O6：C65.71，H4.79，N6.66。
合成R-P的羧基N-丁二酰亚胺酯R-P-NHS：
0.42g(1mmol)R-P溶于10ml干燥的DMF中，加入0.15g(1.25mmol)N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，0.26g(1.25mmol)DCC(二环己基碳二亚胺)，室温下搅拌24小时，滤去白色固体，减压蒸去DMF，残留物溶于乙酸乙酯中，用饱和NaHCO3水溶液和水洗，有机层用无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂，残留物经柱层析纯化，得棕红色晶体产物0.40g，m.p.167℃。元素分析：Found：C 62.61，H 4.51，N 8.18.Calcd.ForC27H23N3O8：C 62.67，H 4.45，N 8.12。样品于乙醇溶液中，在紫外灯下激发，可以看到红色荧光；测定荧光光谱，激发波长580nm，最大发射波长622nm。
合成荧光基因材料：
将5’端带有氨基基团的特定序列基因片段溶于含有1M的NaHCO3(PH＝9.0)的水溶液中，加入溶有过量荧光化合物R-P-NHS的DMF溶液，混合均匀，在室温下反应48小时，先用乙醇沉淀以除去过量的R-P-NHS，再经HPLC纯化，得到荧光基因材料。在紫外灯下激发，可以看到红色荧光；测定荧光光谱，激发波长580nm，最大发射波长611nm。
实施例2：
合成光致变色材料SPNHS：
将1-羧乙基-3，3’-二甲基-6-硝基螺吲哚啉-2，2’[2H-1]苯并吡喃(SPCOOH)0.38g(1mmol)溶于10ml DMF中，加入0.15g NHS(1.25mmol)和0.26g DCC(1.25mmol)，室温下搅拌24h.，滤去固体，蒸去溶剂，加入乙酸乙酯，用饱和NaHCO3水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，加石油醚重结晶，得到淡黄色晶体0.4g，m.p.140℃。元素分析：Found：C 62.82，H 4.85，N 8.73.Calcd.For C25H23N3O7：C 62.89，H 4.86，N 8.80。乙醇溶液为淡黄色，在光照后或紫外灯照射下变为蓝紫色；UV(λmax，固体反射)光照前：260nm，320nm；光照后：260nm，320nm，580nm。
合成光致变色基因材料：
将5’端带有氨基基团的特定序列基因片段溶于含有1M的NaHCO3(PH＝9.0)的水溶液中，加入溶有过量光致变色化合物SPNHS的DMF溶液，混合均匀，在室温下反应24小时，先用乙醇沉淀以除去过量的SPNHS，经HPLC纯化，得到光致变色基因材料。UV(λmax，固体反射)光照前：260nm，400nm；光照后：260nm，400nm，570nm。
实施例3：
合成光致变色材料SPNCS：
将0.44g(2mmol)1，3，3’-三甲基-2-甲叉基-5-异硫氰酸酯基吲哚啉与0.34g(2mmol)5-硝基水杨醛在15ml无水乙醇中加热回流3小时，滤去固体，滤液经柱色谱分离，丙酮-石油醚重结晶，得到淡黄色晶体产物0.60g，m.p.165℃。元素分析：Found：C 63.35，H 4.55，N 11.01.Calcd.For C20H17N3O3S：C 63.31，H 4.52，N 11.07。乙醇溶液为淡黄色，在光照后或紫外灯照射下变为紫红色；UV(λmax，固体反射)光照前：260nm，325nm；光照后：260mn，325nm，575nm。
合成光致变色基因材料：
将5’端带有氨基基团的特定序列基因片段溶于含有1M的NaHCO3(PH＝9.0)的水溶液中，加入溶有过量光致变色化合物SPNHS的DMF溶液，混合均匀，在室温下反应24小时，先用乙醇沉淀以除去过量的SPNCS，经HPLC纯化，得到光致变色基因材料。UV(λmax，固体反射)光照前：260nm，410nm，光照后：260nm，410nm，570nm。
实施例4：
合成光修饰基因材料：
在DNA合成仪上合成在5’和3’端分别连上1，6己二胺连接臂的基因片段，其中5’端氨基带有保护基，将其溶于0.1M的NaHCO3水溶液中，取500μl，加入500μl浓度为60mg/ml DABCYL活泼酯的DMF溶液，混合均匀，反应72小时，加入0.3ml 3MNaAc水溶液，1.7ml水，7.5ml无水乙醇沉淀，得到带有淬灭基团的基因。再将其脱去5’端保护基，溶于为淬灭基团，0.1M的NaHCO3水溶液中，再用同样的方法与R-P-NHS反应，最后经HPLC纯化，得到光修饰基因。
检测：
(a)将光修饰基因溶于含有5mM MgCl2的20mM Tris-HCl缓冲液(PH＝8.0)中，浓度为15μM，在离心管中加入10μl光修饰基因溶液，在紫外灯下用肉眼观察，无明显荧光；再加入1μl的250μM互补序列基因片段，混合10min.，在紫外灯下用肉眼观察，可以看到明显红色荧光；再用有一个碱基错配的片段用同样方法处理，观察不到明显荧光。
(b)将光修饰基因溶于同(a)中缓冲液中，浓度为0.2μM，取50μl与5μl的25μM互补序列杂交，记录荧光光谱，以缓冲液的相对荧光强度为0，光修饰基因几乎没有荧光，而杂交后相对，荧光强度在90％以上；再用有一碱基错配的片段同样处理，荧光强度无明显增加。
实施例5：
荧光杂交检测：
将靶基因用实施实例1的方法进行荧光标记，与互补的探针分子进行杂交2小时，加入显色剂使过量的荧光分子失活，在激光共聚焦显微镜下观察，并记录荧光光谱，可以看到红色荧光。再将有一碱基错配的探针分子用同样方法进行杂交，不能观察到荧光。
荧光检测基因芯片：
将探针分子用点样机点到经处理的尼龙膜或玻片上，制成基因芯片。将样品(肝炎病人血清)经煮沸、裂解、分离、提纯、PCR扩增后，得到靶分子，用实施实例l的方法进行荧光标记，在点到基因芯片上，杂交2小时，除去多余的标记分子，在激光共聚焦显微镜下观察，并记录荧光光谱，有红色荧光点的为杂交阳性结果，无红色荧光点的为阴性结果。
实施例6：
光致变色杂交检测：
将靶基因用实施实例2的方法进行光致变色标记，与互补的探针分子进行杂交2小时，除去过量的标记分子，在紫外光下激发，在激光聚焦显微镜下观察，有紫色斑点，再将有一碱基错配的探针分子用同样方法进行杂交，不能观察到紫色斑点。
光致变色基因芯片：
将探针分子用点样机点到经处理的尼龙膜或玻片上，制成基因芯片。将样品(肝炎病人血清)经煮沸、裂解、分离、提纯、PCR扩增后，得到靶分子，用实施实例1的方法进行光致变色标记，在点到基因芯片上，杂交2小时，除去多余的标记分子，用紫外灯激发，在激光共聚焦显微镜下观察，有紫色斑点的为杂交阳性结果，无紫色荧光点的为阴性结果。
实施例7：
光修饰基因芯片：
将探针分子序列按照实施实例4的方法作成光修饰基因，用点样机点到玻片上，再将样品(肝炎病人血清)经煮沸、裂解、分离、提纯、PCR扩增后，得到靶基因分子，点到玻片上，10min后，不需要除去过量的探针分子，直接在激光聚焦显微镜下观察，记录玻片上荧光情况，有荧光发射的为杂交阳性结果，无明显荧光发射的为杂交阴性结果。