一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒.pdf

本发明提供一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，试剂盒共包含11个组分：反应液1#~8#，酶混合液，阳性对照，阴性对照，包含乙型肝炎病毒P区的11种耐药基因突变检测（rt80、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250），通过8个反应缓冲液进行扩增，每个反应缓冲液包含两个或者三个荧光通道，通过耐药基因扩增Ct值与外控Ct值之间的差异（ΔCt值）来判断是否发生耐药突变。

1.一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下：反应液1#包含rt80特异性引物及探针、rt180特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；反应液2#包含rt169特异性引物及探针、rt204特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；反应液3#包含rt181特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；反应液4#包含rt194特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；反应液5#包含rt202特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；反应液6#包含rt184特异性引物及探针、rt250特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；反应液7#包含rt173特异性引物及探针、rt236特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；反应液8#包含外控特异性引物及探针、内控特异性引物及探针。 2.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下：酶混合液包含热启动Taq酶及UNG酶；阳性对照包含特异性质粒及TE水；阴性对照包含TE水。 3.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：反应液；1#中rt80特异性引物为：F：ttgcccgtttgtcctctaa、R：atagaggttccttgagca，探针为FAM-tcatcgacaaccagcaccgg-BHQ1；rt180特异性引物为：F：gcctcagtccgtttccca、R：cccccaataccacatcatc，探针为HEX-agtgccatttgttcagtggttcg-BHQ1。 4.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：反应液2#中rt169特异性引物为：F：cttgggctttcgcaacac、R：tacgaaccactgaacaaatgg，探针为FAM-cctatgggagtgggcctcag-BHQ1；rt204特异性引物为：F：cccaataccacatcatcaac、R：tccgtttctcttggctcagt，探针为HEX-ccaaacagtgggggaaagccc-BHQ1。 5.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：反应液3#中rt181特异性引物为：F：acaaatggcactagtaaactgact、R：tgtattcccatcccatcatc，探针为FAM-aaacggactgaggcccactccc-BHQ1。 6.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：反应液4#中rt194特异性引物为：F：tttgttcagtggttcgtagca、R：aaagggactcaagatgttgtac，探针为FAM-tatggatgatgtggtattgggggc-BHQ1。 7.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：反应液5#中rt202特异性引物为：F：cccactgtttggctttgat、R：aaagggactcaagatgttgtac，探针为FAM-tggatgatgtggtattgggggc-BHQ1。 8.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：反应液6#中rt184特异性引物为：F：tctcctggctcagttcgg、R：ccccaataccacatcatc，探针为FAM-tttgttcagtggttcgtagggctt-BHQ1；rt250特异性引物为：F：aacttccaattacatatccctc、R：ggccaagtctgtacaacatc，探针为HEX-cccaaagacaaaagaaaattggt-BHQ1。 9.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：反应液7#中rt173特异性引物为：F：cgcaagattcctatgggac、R：caaacagtgggggaaagc，探针为FAM-ctcagtccgtttctcctggctca-BHQ1；rt236特异性引物为：F：caacgtttggttttattagtgg、R：ctgtacaacatcttgagtccct，探针为HEX-acccaaagacaaaagaaaattgg-BHQ1。 10.根据权利要求1所述的一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，其特征在于：内控特异性引物为：F：acagtcagccgcatcttctt、R：acgaccaaatccgttgactc，探针为ROX-cagccgagccacatcgctca-BHQ2；外控特异性引物为：F：gttgcccgtttgtcctctaa、R：agcaggagttgtgcaggttt，探针为FAM-ttccaggatcatcgacaacc-BHQ1。

技术领域

本发明属于荧光定量PCR领域，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒。

背景技术

WHO数据显示，病毒性肝炎一直位列全球排名前七的死亡原因，每年多达145万人因此丧生。全球乙肝病毒慢性感染者高达近2.4亿人，我国是乙型肝炎病毒（HBV）高度易感人群，约有1.2亿HBsAg携带者，该病毒严重地危害着我国人民健康。2015年全国法定报告传染病发病死亡统计表显示，乙型肝炎的发病数达934215例，死亡数达352人，均占病毒性肝炎首位。

长期服用核苷（酸）类药物易产生耐药，主要核苷（酸）类药物的服用时间及其耐药发生率见表1。在用药过程中，患者体内HBV DNA及谷丙转氨酶（ALT）逐渐下降，继而达到一个平稳期，患者病情减轻。此时，HBV很难被完全清除，而是处于一个低复制非活动时期。随着用药时间的延长，对药物敏感的野生株数量下降，具有耐药突变的变异株因对药物不敏感，而得以不断复制、增加，从而导致HBV DNA及ALT重新上升，使得肝炎复发。

现阶段，临床上检测乙肝耐药基因突变主要采取测序法和基因芯片法进行检测。测序法仅能测出突变比例≥20%的样本，且整个检测周期需要7天，操作复杂不适合临床推广；基因芯片法灵敏度仅能达到104copies/mL，且操作过程容易造成交叉污染导致假阳性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒，主要采取多重实时荧光PCR法对乙肝耐药基因突变进行检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明在一个试剂盒内包含乙型肝炎病毒P区的11种耐药基因突变检测（rt80、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250），通过8个反应缓冲液进行扩增，每个反应缓冲液包含两个或者三个荧光通道，通过耐药基因扩增Ct值与外控Ct值之间的差异（ΔCt值）来判断是否发生耐药突变。

所述试剂盒包括如下：

反应液1#包含rt80特异性引物及探针、rt180特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液2#包含rt169特异性引物及探针、rt204特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液3#包含rt181特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液4#包含rt194特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液5#包含rt202特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液6#包含rt184特异性引物及探针、rt250特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液7#包含rt173特异性引物及探针、rt236特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

反应液8#包含外控特异性引物及探针、内控特异性引物及探针；

酶混合液包含热启动Taq酶及UNG酶；

阳性对照包含特异性质粒及TE水；

阴性对照包含TE水。

引物探针序列：

试剂组分配方：

反应液1#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl2 2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，rt80上游引物417nmol/L，rt80下游引物417nmol/L，rt80探针62.5nmol/L，rt180上游引物417nmol/L，rt180下游引物417nmol/L，rt180探针62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。

反应液2#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl2 2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，rt169上游引物417nmol/L，rt169下游引物417nmol/L，rt169探针62.5nmol/L，rt204上游引物417nmol/L，rt204下游引物417nmol/L，rt204探针62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。

反应液3#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl2 2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，rt181上游引物417nmol/L，rt181下游引物417nmol/L，rt181探针62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。

反应液4#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl2 2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，rt194上游引物417nmol/L，rt194下游引物417nmol/L，rt194探针62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。

反应液5#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl2 2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，rt202上游引物417nmol/L，rt202下游引物417nmol/L，rt202探针62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。

反应液6#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl2 2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，rt184上游引物417nmol/L，rt184下游引物417nmol/L，rt184探针62.5nmol/L，rt250上游引物417nmol/L，rt250下游引物417nmol/L，rt250探针62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。

反应液7#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl2 2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，rt173上游引物417nmol/L，rt173下游引物417nmol/L，rt173探针62.5nmol/L，rt236上游引物417nmol/L，rt236下游引物417nmol/L，rt236探针62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。

反应液8#配方：Tris（PH8.8）20mmol/L，KCl 60mmol/L，MgCl2 2.0mmol/L，EDTA·2Na 0.5mmol/L，2%DMSO，dATP 200μmol/L，dGTP 200μmol/L，dCTP 200μmol/L，dTTP 200μmol/L，外控上游引物417nmol/L，外控下游引物417nmol/L，外控探针62.5nmol/L，内控上游引物417nmol/L，内控下游引物417nmol/L，内控探针62.5nmol/L。

酶混合液配方：Taq酶4U/µL，UNG酶0.04U/µL。

本发明的优点在于：

发明的优点：本发明的优势为1、灵敏度达到500copies/mL；2、扩增完后直接得到结果，无需后续操作，获得样本后2.5小时就能得到结果；3、能够检测出1%的突变比例。

发明的有益效果：1、为临床治疗提供准确的参考，提高治疗有效率，减少药物副作用；2、一次检测覆盖临床常用药物，降低检测成本；3、降低患者经济负担。

附图说明

图1 1#样本结果图。

图2 2#样本结果图。

图3 3#样本结果图。

图4 4#样本结果图。

图5 5#样本结果图。

图6 6#样本结果图。

图7 7#样本结果图。

图8 8#样本结果图。

图9 9#样本结果图。

图10 10#样本结果图。

图11 11#样本结果图。

具体实施方式

实施例1

1、反应液的配制

（1）反应液1#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma® Base 336μL，1 mol/L MgCl2 20μL，1mol/L KCl 600μL，0.5mol/L EDTA·2Na 10μL，DMSO 200μL，dNTPs 90μL，50μmol/L的rt80上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt80探针12.5μL，50μmol/L的rt180上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt180探针12.5μL，50μmol/L的内控上下游引物各83.4µL，50μmol/L 内控探针12.5μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按1mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（2）反应液2#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma® Base 336μL，1 mol/L MgCl2 20μL，1mol/L KCl 600μL，0.5mol/L EDTA·2Na 10μL，DMSO 200μL，dNTPs 90μL，50μmol/L的rt169上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt169探针12.5μL，50μmol/L的rt204上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt204探针12.5μL，50μmol/L的内控上下游引物各83.4µL，50μmol/L 内控探针12.5μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按1mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（3）反应液3#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma® Base 336μL，1 mol/L MgCl2 20μL，1mol/L KCl 600μL，0.5mol/L EDTA·2Na 10μL，DMSO 200μL，dNTPs 90μL，50μmol/L的rt181上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt181探针12.5μL，50μmol/L的内控上下游引物各83.4µL，50μmol/L 内控探针12.5μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按1mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（4）反应液4#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma® Base 336μL，1 mol/L MgCl2 20μL，1mol/L KCl 600μL，0.5mol/L EDTA·2Na 10μL，DMSO 200μL，dNTPs 90μL，50μmol/L的rt194上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt194探针12.5μL，50μmol/L的内控上下游引物各83.4µL，50μmol/L 内控探针12.5μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按1mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（5）反应液5#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma® Base 336μL，1 mol/L MgCl2 20μL，1mol/L KCl 600μL，0.5mol/L EDTA·2Na 10μL，DMSO 200μL，dNTPs 90μL，50μmol/L的rt202上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt202探针12.5μL，50μmol/L的内控上下游引物各83.4µL，50μmol/L 内控探针12.5μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按1mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（6）反应液6#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma® Base 336μL，1 mol/L MgCl2 20μL，1mol/L KCl 600μL，0.5mol/L EDTA·2Na 10μL，DMSO 200μL，dNTPs 90μL，50μmol/L的rt184上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt184探针12.5μL，50μmol/L的rt250上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt250探针12.5μL，50μmol/L的内控上下游引物各83.4µL，50μmol/L 内控探针12.5μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按1mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（7）反应液7#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma® Base 336μL，1 mol/L MgCl2 20μL，1mol/L KCl 600μL，0.5mol/L EDTA·2Na 10μL，DMSO 200μL，dNTPs 90μL，50μmol/L的rt173上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt173探针12.5μL，50μmol/L的rt236上下游引物各83.4µL，50μmol/L rt236探针12.5μL，50μmol/L的内控上下游引物各83.4µL，50μmol/L 内控探针12.5μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按1mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（8）反应液8#的配制

取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L Trizma®HCl 64μL，0.5mol/L Trizma® Base 336μL，1 mol/L MgCl2 20μL，1mol/L KCl 600μL，0.5mol/L EDTA·2Na 10μL，DMSO 200μL，dNTPs 90μL，50μmol/L的外控上下游引物各83.4µL，50μmol/L 外控探针12.5μL，50μmol/L的内控上下游引物各83.4µL，50μmol/L 内控探针12.5μL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按1mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（9）酶混合液的配制 取10mL容量瓶，分别加入10000U/mL的Taq酶4mL，1000U/mL的UNG酶0.4mL。用双重蒸馏水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到10mL烧杯中，按100µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（10）阴性对照的配制 取100mL容量瓶，加入生理盐水定容至100mL，将液体转移到10mL烧杯中，按500µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

（11）阳性对照的配制（浓度为5.0×103copies/mL）

取100mL容量瓶，分别加入5.0×107copies/mL rt80、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250、外控和内控质粒（各质粒委托通用生物系统（安徽）有限公司合成）各10µL。用生理盐水定容至100mL，将液体转移到100mL烧杯中，按500µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

2、核酸提取 采用已备案的核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度计测核酸纯度，其OD260/OD280应在1.6~2.0之间。

3、加样上机

（1）反应混合物配制 取出反应液1#~8#、酶混合液室温放置，使其充分溶解，配制反应混合物（每测试配置体系：29.5µL反应液+0.5µL 酶混合液），按照需要计算好试剂用量，充分混合均匀后，3000-5000g离心5秒。

（2）加样 取出八联管，依次加入30µL配制好的反应混合物，然后将提取好的样本取2µL加入扩增管或八联管，盖好盖子，稍微离心后置入荧光PCR扩增仪内。加样顺序，建议参照一下表格进行：

（3）上机检测

1）循环条件设置 38℃ 5分钟，95℃ 10分钟；进入以下循环：95℃ 15秒，58℃ 40秒（检测信号），40循环； 25℃30秒。

2）仪器检测通道选择 荧光素设定为FAM、HEX和ROX。

4、结果判断

（1）阴性对照应无Ct值或者为0；阳性对照Ct值应≤36；反应液4#中ROX通道Ct值应≤36；

（2）突变结果的判断：确定待测样本的各突变反应孔FAM通道或HEX通道的检测Ct值和HBV外控孔的FAM通道的外控Ct值，计算ΔCt（ΔCt＝突变Ct值－外控Ct值），通过比较ΔCt与cut-offΔCt之间的关系来判读结果。若突变Ct值=0，则判断为阴性或者低于本试剂盒的检测下限；若突变Ct值<40则判断ΔCt值：若ΔCt小于cut-offΔCt时，则判断为突变阳性；若ΔCt大于或等于cut-offΔCt时，则判断为阴性或者低于本试剂盒的检测下限（如下表所示）。

样本测试结果应以下表判断：

实施例2

1、试剂特异性验证

（1）实验样本 采取10份特异性样本对试剂的特异性进行验证，其中2份为生理盐水样本、2份为大肠杆菌、2份为小牛血清样本、2份为人阴性血清样本、2份为丙型肝炎病毒阳性样本。

（2）实验过程 用反应液1#~8#分别检测以上10份特异性样本，分析检测结果，验证试剂的特异性。

（3）实验结果10份特异性样本检测结果皆为阴性，表明试剂特异性好，无交叉反应情况。具体结果见下表：

2、试剂精密性验证

（1）实验样本 采取1份精密性样本（浓度为5.0×103copies/mL）对试剂的精密性进行验证，样本配制方法为取100mL容量瓶，分别加入5.0×107copies/mL rt80、rt169、rt173、rt180、rt181、rt184、rt194、rt202、rt204、rt236、rt250、外控和内控质粒各10µL，用生理盐水定容至100mL。

（2）实验过程 用反应液1#~8#分别重复检测以上精密性样本10次，分析检测结果，验证试剂的精密性。

（3）实验结果 三种反应液检测精密性样本批内变异系数（CV值）均＜5%，表明试剂重复性好。具体结果见下表：试剂精密性检测结果

3、试剂最低检测限验证

（1）实验样本 采取1份最低检测限样本（浓度为5.0×102copies/mL）对试剂的最低检测限进行验证，样本配制方法为取100mL容量瓶，分别加入5.0×103copies/mL的精密性样本10mL，用生理盐水定容至100mL。

（2）实验过程 用反应液1#~8#分别重复检测以上最低检测限样本10次，分析检测结果，验证试剂的最低检测限。

（3）实验结果 八种反应液检测最低检测限样本均为阳性，试剂的最低检测限为5.0×102copies/mL。具体结果见下表：

4、试剂突变检测敏感性验证

（1）实验样本 采取11份突变敏感性样本对试剂突变检测敏感性进行验证。1号为5.0×107copies/mL的rt80、外控质粒1：100混合；2号为5.0×107copies/mL的rt169、外控质粒1：100混合；3号为5.0×107copies/mL的rt173、外控质粒1：100混合；4号为5.0×107copies/mL的rt180、外控质粒1：100混合；5号为5.0×107copies/mL的rt181、外控质粒1：100混合；6号为5.0×107copies/mL的rt184、外控质粒1：100混合；7号为5.0×107copies/mL的rt194、外控质粒1：100混合；8号为5.0×107copies/mL的rt202、外控质粒1：100混合；9号为5.0×107copies/mL的rt204、外控质粒1：100混合；10号为5.0×107copies/mL的rt236、外控质粒1：100混合；11号为5.0×107copies/mL的rt250、外控质粒1：100混合。

（2）实验过程 分别检测以上样本，分析检测结果，验证试剂的基因突变检测敏感性。

（3）实验结果11份突变敏感性样本均为阳性，证明本试剂在突变比例为1%时能够准确检出。具体结果见图1-11。

实施例3：60例临床样本的检测结果

1、按照实施例1所示的配制方法，配制试剂盒相关组分，于-20℃保存备用。

2、福建医科大学孟超肝胆医院收集了60例临床乙型肝炎病毒感染且抗病毒药物治疗效果不佳的患者血清，采用德必碁生物科技（厦门）有限公司生产的核酸提取试剂（病毒型）进行核酸提取，用紫外分光光度计检测DNA样本的纯度，60例样本OD260/OD280皆在1.6~2.0之间。

3、按照实施例1所示的步骤，进行DNA加样并上荧光定量PCR仪进行检测，本次使用的仪器为ABI750。

4、按照实施例1所示判断标准，对结果进行判读并统计，结果如下表：

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 德必碁生物科技(厦门)有限公司

<120> 一种检测乙型肝炎病毒耐药多基因突变试剂盒

<130> 39

<160> 39

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgcccgttt gtcctctaa 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atagaggttc cttgagca 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcatcgacaa ccagcaccgg 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cttgggcttt cgcaacac 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tacgaaccac tgaacaaatg g 21

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctatgggag tgggcctcag 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgcaagattc ctatgggac 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caaacagtgg gggaaagc 18

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctcagtccgt ttctcctggc tca 23

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcctcagtcc gtttccca 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccccaatac cacatcatc 19

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agtgccattt gttcagtggt tcg 23

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

acaaatggca ctagtaaact gact 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgtattccca tcccatcatc 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aaacggactg aggcccactc cc 22

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tctcctggct cagttcgg 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ccccaatacc acatcatc 18

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttgttcagt ggttcgtagg gctt 24

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

tttgttcagt ggttcgtagc a 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aaagggactc aagatgttgt ac 22

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

tatggatgat gtggtattgg gggc 24

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cccactgttt ggctttgat 19

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aaagggactc aagatgttgt ac 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tggatgatgt ggtattgggg gc 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cccaatacca catcatcaac 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

tccgtttctc ttggctcagt 20

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ccaaacagtg ggggaaagcc c 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

caacgtttgg ttttattagt gg 22

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ctgtacaaca tcttgagtcc ct 22

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

acccaaagac aaaagaaaat tgg 23

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

aacttccaat tacatatccc tc 22

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ggccaagtct gtacaacatc 20

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cccaaagaca aaagaaaatt ggt 23

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gttgcccgtt tgtcctctaa 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

agcaggagtt gtgcaggttt 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

ttccaggatc atcgacaacc 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

acagtcagcc gcatcttctt 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

acgaccaaat ccgttgactc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

cagccgagcc acatcgctca 20