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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710572655.X (22)申请日 2017.07.14 (71)申请人 长沙沁才生物科技有限公司 地址 410000 湖南省长沙市高新开发区麓 龙路209号 (72)发明人 不公告发明人 (51)Int.Cl. C07K 14/435(2006.01) (54)发明名称 SPNP-I在制备Nav1.2通道工具试剂中的应 用 (57)摘要 本发明公开了一种生物活性多肽在制备电 压门控钠通道工具试剂-Nav1.2型钠通道失活抑 制剂中的应用方法， 所述的生物活性多肽为蜘蛛。
2、 抑钠肽-I （SPNP-I） ， 试验验证该活性多肽对 Nav1.2型电压门控钠通道失活具有明显的抑制 作用。 在制备电压门控钠通道亚型工具分子时， 配制细胞外给药的浓度为1mol/L。 SPNP-I对 Nav1.2型钠通道的抑制呈现浓度依从性， 是一种 较好的Nav1.2型钠通道工具试剂。 权利要求书1页 说明书3页 序列表1页 附图1页 CN 107163125 A 2017.09.15 CN 107163125 A 1.一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I在制备钠通道工具试剂-Nav1.2钠通道 抑制剂中的应用， 所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I （简写为SPNP-I） 。
3、， 其氨基酸 序列为： NH2-Ala Cys Gly Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Glu Gly Lys Pro Pro Cys Cys Ala Asn Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile Trp Ser Pro-OH, 其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I作为单一有效活性组份用于制备 Nav1.2型钠通道抑制剂。 2.根据权利要求1所述的应用方法， 其特征在于， 蜘蛛抑钠肽-I作为单一有效活性组分 用于制备Nav1.2型钠通道失活抑制剂。 3.根据权利要求1所述的应用方法， 其特征在于， 蜘蛛抑钠肽-。
4、I制备成细胞外给药的 Nav1.2型钠通道工具试剂。 4.根据权利要求1所述的应用方法， 其特征在于， 蜘蛛抑钠肽-I在制备Nav1.2型钠通道 工具试剂或失活抑制剂时， 配制细胞外给药的剂量为1 mol/L。 5.根据权利要求1所述的应用方法， 其特征在于， 蜘蛛抑钠肽-I的对Nav1.2型钠通道的 抑制失活作用呈现浓度依赖性和时间依从性。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107163125 A 2 SPNP-I在制备Nav1.2通道工具试剂中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种活性多肽在制备离子通道工具试剂中的用途， 尤其是用化学法制 备的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I （简。
5、写为SPNP-I） 在制备电压门控钠通道工具试 剂-Nav1.2型钠通道抑制剂中的用途。 0002 背景技术 0003 电压门控钠通道广泛分布于神经元、 心肌、 血管平滑肌、 胰腺、 骨骼肌等可兴奋性 组织中， 是一种重要的跨膜结构蛋白， 其参与调节神经递质的分泌、 血管收缩、 胰腺分泌和 骨骼肌兴奋性等多种生理过程,同时也是治疗药物作用的重要靶标之一。 钠通道在动作电 位的产生和传播过程中的关键性作用， 电压门控钠通道成为很多动植物毒素的作用靶标。 钠离子通道的结构与功能关系研究已经成为国际上的研究热点。 电压门控钠通道很可能成 为神经性和心血管等疾病的重要治疗靶点。 自然界的动物毒素是一类。
6、具有很高实用价值和 应用前景的工具试剂或药物导向物质， 不仅是有毒动物抵御天敌的有力武器， 也是从事神 经生物学和生理学研究、 天然创新药物开发以及蛋白质基础研究的宝贵材料,同时也是研 究离子通道的独特 “分子探针和解密器” 。 迄今为止， 从多种动物 （如蝎、 蜘蛛、 蛇以及海洋动 物等） 的毒液中鉴定到了很多作用于钠通道的活性成分。 它们通过与钠通道的不同位置相 结合从而引起通道的动力学特征发生相应的变化， 如通道去失活、 阻塞通道口、 易化激活、 失活延缓等。 通过阐述这些特异性调制剂作用于钠通道的分子机制， 除了在理论上可深入 推测钠通道亚型之间的功能活动区别和门控活动机制外， 还可以。
7、为将它们开发成治疗人类 相关疾病的新药提供充分的理论基础和广阔的应用前景。 0004 发明内容 0005 本发明旨在于提供一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I在制备电压门控钠 通道工具试剂-Nav1.2型钠通道抑制剂中的应用， 所述的广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠 肽-I （简写为SPNP-I） ， 其氨基酸序列为： NH2-Ala Cys Gly Gln Phe Trp Trp Lys Cys Gly Glu Gly Lys Pro Pro Cys Cys Ala Asn Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile Trp Ser Pro-OH。
8、, 其特征在于广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I作为单一有效活性组份用于制备 Nav1.2型钠通道抑制剂。 0006 所述的一种广西缨毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑钠肽-I在制备电压门控钠通道工具试 剂-Nav1.2型钠通道抑制剂中的应用， 其特征在于， 所述的蜘蛛抑钠肽-I的N端第2位半胱氨 酸和第16位半胱氨酸之间， N端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之间， N端第15位半胱氨酸 和第28位半胱氨酸之间分别形成二硫键。 0007 该蜘蛛抑钠肽-I作为单一有效活性组分用于制备Nav1.2型钠通道抑制剂， 以细胞 说明书 1/3 页 3 CN 107163125 A 3 外给药的方式制备成Nav1。
9、.2型钠通道工具试剂。 0008 蜘蛛抑钠肽-I在制备Nav1.2型钠通道工具试剂或抑制剂时， 配制细胞外给药的剂 量为1 mol/L。 0009 蜘蛛抑钠肽-I对Nav1.2型钠通道的抑制呈现浓度依赖性和时间依从性， 是一种较 好的Nav1.2型钠通道工具试剂。 附图说明 0010 图1是SPNP-I对Nav1.2型钠通道的影响。 0011 图2是SPNP-I抑制Nav1.2型钠通道的时间-效应关系曲线。 具体实施方式 0012 为了更好的理解和更充分公开本发明， 下面将通过细胞外给药途径， 采用转染 HEK293T细胞模型来说明蜘蛛抑钠肽-I的Nav1.2型钠通道抑制作用。 0013 1、。
10、 实验材料和方法 1.1人胚肾细胞 （HEK293T） 的培养及转染 HEK293T细胞适应酸性环境,pH 值在 6.97.1 时,可顺利贴壁生长,换液时动作要 轻。 一般用高糖的DMEM培养基。 0014 1.1.1细胞的传代培养 (1) HEK293 细胞传代时机为达80-90%汇合， 待细胞在60mm培养皿中长满后， 吸掉培养 液。 0015 (2) 加适量PBS漂洗两次， 吸掉。 0016 (3) 加0.5mL 0.25%胰酶， 摇匀。 37培养箱中胰酶处理2-3min。 于显微镜下观察 细胞是否全部脱壁。 加入适量10% 新生牛血清DMEM培养液终止胰酶反应。 0017 (4) 用移。
11、液管将细胞团轻轻吸打成单个细胞。 将细胞按1 3平均分入装有预热培 养液的培养皿中， 于37、 5% CO2、 15%相对湿度培养箱中培养。 0018 1.1.2阳离子性的脂质体法转染方法: （1） 在转染前一天， 对于35mm培养皿， 每皿用2mL不含抗生素的培养液培养。 0019 （2） 转染的当天， 细胞密度最好达到80-90%， 吸掉旧培养液， PBS漂洗一次， 换成2mL 无血清opti-MEM培养液。 0020 （3） 每皿DNA用量为4g， 用无血清无血清opti-MEM培养液分别稀释到250L， 轻轻 混匀,室温静置5min。 0021 （4） 同时将10L脂质体加入250L无。
12、血清opti-MEM培养液中， 轻轻混匀， 室温静置 5min。 0022 （5） 将稀释的脂质体加入等体积DNA混匀， 室温静置20min。 0023 （6） 将0.5mLDNA/脂质体复合物轻轻混匀， 滴加入细胞中， 轻轻混匀， 常规条件培 养。 0024 （7） 让DNA/脂质体复合物与细胞接触4-6h后， 换成10% 新生牛血清DMEM培养液培 养。 24-72h内可以进行膜片钳实验。 说明书 2/3 页 4 CN 107163125 A 4 0025 1.2 膜片钳电生理活性实验 膜片钳实验均在室温 （251） 进行， 采用全细胞膜片钳技术。 挑选质膜光滑可见、 胞 质均匀的有绿色荧。
13、光的HEK293T细胞作为实验细胞。 电流记录通过全细胞膜片钳技术利用 EPC9放大器 (HEKA公司, German)在电脑上进行。 计算机记录和分析系统采用Pulse+ Pulsefit 8.0软件。 玻璃电极管为硼硅酸盐玻璃毛细管 （南京泉水教学实验器材厂） 。 玻璃 电极两步拉制而成， 经抛光仪(Narishige,Japan)抛光后电极尖端直径约为3 m， 充灌电极 液后电极电阻为1-3M。 膜片钳实验要在室温条件下进行， 整个实验过程中温度的变动最 多上下不超过2。 采用SigmaPlot 9.0软件分析实验结果。 0026 2、 实验结果与分析 2.1 SPNP-I对Nav1.2。
14、型电压门控钠通道的影响 运用全细胞膜片钳技术， 我们进一步研究了SPNP-I对瞬时表达于HEK293T细胞的钠通 道亚型Nav1.2的抑制作用。 钠通道亚型电流以同一种去极化方式诱导： 将细胞膜电位钳制 在-100 mV， 以20 ms的时程给予一测试电压-10mV， 每隔5 s重复一次。 0027 如图1所示， 1 M SPNP-I对Nav1.2通道的失活有一定的抑制作用， 能明显延缓 Nav1.2钠通道的失活， 其抑制程度为43%。 SPNP-I对Nav1.2通道的抑制或延缓失活作用呈现 明显的浓度依从性， SPNP-I的半数有效作用剂量IC50为870 nmol/L。 SPNP-I对Na。
15、v1.2钠通道 的失活抑制具有时间依从性， 当浓度增加为1 M时， 可在约3 min的时间内达到最大抑制程 度 （见图2） 。 说明书 3/3 页 5 CN 107163125 A 5 SEQUENCE LISTING 长沙沁才生物科技有限公司 蜘蛛抑钠肽-I 1 PatentIn version 3.3 1 33 PRT 广西缨毛蛛 1 Asp Cys Leu Gly Leu Phe Trp Ile Cys Gln Tyr Met Asp Asp Lys 1 5 10 15 Cys Cys Ala Asn Phe Ala Cys Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Cys Ile 16 20 25 30 Trp Ser Pro 31 序列表 1/1 页 6 CN 107163125 A 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 107163125 A 7 。