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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710199070.8 (22)申请日 2017.03.29 (83)生物保藏信息 CGMCC NO. 7899 2013.07.08 (71)申请人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 董彩霞张乃文徐阳春 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛邢贤冬 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C05F 11/00(2006.01) C05F。
2、 17/00(2006.01) C12R 1/11(2006.01) (54)发明名称 一株梨树枝条降解细菌L2及其菌剂 (57)摘要 本发明公开了一株用于降解梨树枝条的细 菌L2， 分类命名为巨大芽孢杆菌( Bacillus megaterium)， 于2013年7月8日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌种保 藏号为CGMCCNO.7899。 本发明菌株L2可在以木 质素类似物愈创木酚为唯一碳源或以梨树枝条 粉末为唯一碳源的培养基上生长， 且可在LB-苯 胺蓝平板上产生退色圈。 试验表明， 在该培养基 上按1接种量接种细菌L2的菌种悬液后， 固态 发酵30d， 培养基失。
3、重率可到达10。 在21d的液 态发酵过程中， 产木质素过氧化物酶活力最高值 为21.76UmL-1， 产锰过氧化物酶活力最高值为 106.36UmL-1。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 106967637 A 2017.07.21 CN 106967637 A 1.一株 用于降 解梨树枝条的 细菌L2 ， 分类命 名为巨 大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)， 于2013年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌 种保藏号为CGMCC NO.7899。 2.权利要求1所述的细菌L2在梨树修剪枝条降解方面的应用。 3.一种含有权利要求1所述。
4、的细菌L2的细菌菌剂。 4.根据权利要求3所述的细菌菌剂， 其特征在于该细菌菌剂是由以下方法制备而成： (1)、 将细菌L2接种于LB液体培养基中， 2837振荡培养至含菌量达到109/mL； (2)、 将步骤(1)培养好的菌悬液5000-6000rpm离心， 用LB液体培养基重悬， 使细菌L2含 菌量达到11091010/mL。 5.根据权利要求4所述的细菌菌剂， 其特征在于所述的液体培养基由以下配制方法制 得： 烘干后粉碎的梨树枝条粉末20g， 葡萄糖5g， (NH4)2SO4 2g， K2HPO4 2g， MgSO47H2O 0.3g， CaCl2 0.4g， 胰蛋白胨1g， FeSO4。
5、7H2O 0.0075g， MnSO4H2O 0.0025g， ZnSO4 0.002g， CoCl2 0.003g， 水1000mL， pH自然。 6.权利要求3所述的细菌菌剂在梨树枝条降解方面的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106967637 A 2 一株梨树枝条降解细菌L2及其菌剂 技术领域 0001 本发明属于农业集约化生产技术， 涉及一株农业废弃物梨树修剪枝条降解细菌L2 及其菌剂， 该细菌L2专用于降解废弃梨树枝条生产有机肥料， 实现有机废弃物资源化利用。 背景技术 0002 修剪是一项梨树栽培和管理的重要技术措施， 适量的修剪对果树的生长和果实的 产量品质都有积极的影。
6、响处于盛果期的梨园， 修剪枝条量一般在1500-2250kghm-2。 农业 部市场与经济信息司统计的数据表明， 2011年我国梨树的栽培面积为110万多公顷， 据这个 数字推算， 我国梨园每年枝条的修剪数量可达161-242万吨。 枝条中含有丰富的纤维素、 木 质素、 蛋白质、 糖类和脂肪等有机物， 以及各种大中微量无机养分， 是宝贵的农业资源， 因 此， 梨树枝条资源的开发和利用有着非常广阔的前景。 然而， 梨树枝条中含有大量的木质素 和纤维素， 因此不易腐烂， 不能就地进行还田处理。 除了部分枝条应用于食用菌的栽培以 外， 绝大部分梨树枝条都被随意堆放在路边或就地焚烧， 焚烧会造成严重的。
7、大气污染， 堆放 会诱发田间的病虫害， 同时也造成了宝贵资源的浪费。 0003 研究表明， 修剪枝条等园林废弃物， 作为堆肥物料的调理剂， 对堆肥物料的含水 率、 孔隙度和碳氮比等有良好的调节作用。 随着果树修剪枝条资源规模的不断扩大和再利 用难度的困扰， 将果树修剪枝条作为主要堆肥材料进行堆肥技术化的研究逐步增加。 通过 联合堆肥化实验的结果显示， 枝条堆肥养分丰富全面， 病菌数量达到无害化， 是一种成熟稳 定和富含营养的优质有机肥和土壤改良剂。 可见将梨树枝条进行固体有机废弃物资源化 (堆肥)是解决梨树枝条再利用问题的简单有效途径。 0004 然而在堆肥过程中， 纤维素、 半纤维素和木质素。
8、等大分子的分解是限制堆肥腐熟 的主要因素， 通过接种木质素降解细菌菌剂， 可以加速堆体升温， 加快堆肥底物中木质素的 分解， 从而缩短堆肥腐熟的周期。 若能筛选到相应的高效降解功能菌株， 并将其用于梨树修 剪枝条堆肥生产， 具有良好的应用前景和实用价值。 发明内容 0005 本发明的目的在于筛选一种能够高效分解梨树枝条木质素的细菌， 通过其对木质 素的高效降解效果， 达到加速梨树枝条堆肥腐熟的目的。 从而使梨树修剪枝条能够通过堆 肥化得以大规模的资源化再利用， 确保可持续农业的顺利发展。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 0007 一株能降解梨树枝条的细菌菌株L2， 该菌株属于。
9、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)， 于2013年7月8日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(地 址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号)， 菌种保藏号为CGMCC NO.7899。 其生物学特征为： 在 LB平板上菌落近圆形， 表面凸起， 黄色， 不透明， 菌落2-4mm， 边缘整齐， 表面有光泽或较暗， 不分泌色素； 为革兰氏阳性细菌， 杆状， 1.21.52.04.0 m， 不运动， 芽孢椭圆形， 端生， 芽孢膨大不明显， 液化明胶慢、 胨化牛奶、 水解淀粉、 不还原硝酸。 说明书 1/4 页 3 CN 106967637 A 3 0008 细菌L2可在以。
10、木质素类似物愈创木酚为唯一碳源的培养基上生长； 细菌L2在LB- 愈创木酚平板上无显色反应， 但可以在LB-苯胺蓝平板上产生褪色圈。 0009 本发明的另一个目的是提供所述的细菌L2在梨树修剪枝条降解方面的应用。 0010 本发明的另一个目的是提供一种含有所述的细菌L2的细菌菌剂。 0011 所述的细菌菌剂是由以下方法制备而成： 0012 (1)、 将细菌L2接种于LB液体培养基中， 28-37振荡培养， 使含菌量达到109/mL， 芽孢形成率达90以上； 0013 (2)、 将步骤(1)培养好的菌悬液5000-6000rpm离心10min， 用少量的LB液体培养基 重悬， 使细菌L2达到11。
11、091010/mL， 4保存备用。 0014 所述的液体培养基由以下配制方法制得： 烘干后粉碎的梨树枝条粉末20g， 葡萄糖 5g， (NH4)2SO4 2g， K2HPO4 2g， MgSO47H2O 0.3g， CaCl2 0.4g， 胰蛋白胨1g， FeSO47H2O 0.0075g， MnSO4H2O 0.0025g， ZnSO4 0.002g， CoCl2 0.003g， 水1000mL， pH自然。 0015 所述的梨树枝条粉末的制备方法： 梨树枝条烘干至恒重， 粉碎过40-60目筛。 0016 本发明的另一个目的是提供所述的细菌菌剂在梨树枝条降解方面的应用。 0017 本发明的有。
12、益效果： 0018 本发明菌株L2可在以木质素类似物愈创木酚为唯一碳源或以梨树枝条粉末为唯 一碳源的培养基上生长， 且可在LB-苯胺蓝平板上产生退色圈。 试验表明， 在该培养基上按 1接种量接种细菌L2的菌种悬液(1010/mL)后， 固态发酵30d， 培养基失重率可到达10。 在 21d的液态发酵过程中， 木质素过氧化物酶活力最高值为21.76UmL-1， 锰过氧化物酶活力 最高值为106.36UmL-1。 0019 利用本发明细菌L2， 采用微生物发酵的方法降解农业废弃物梨树修剪枝条， 促进 梨树枝条堆肥的腐熟进程， 为梨树枝条堆肥化的推广利用提供技术支持， 达到变废为宝、 保 护环境， 。
13、促进农业可持续发展的目的， 具有广阔的应用前景。 附图说明 0020 图1为细菌L2的退色反应图(第6d退色反应)。 0021 图2为细菌L2基于16S rDNA序列相似性的系统发育树。 0022 图3为细菌L2的木质素过氧化物酶(Lip)的活性。 0023 图4为细菌L2的锰过氧化物酶(MnP)的活性。 0024 生物材料保藏信息 0025 L2， 分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)， 于2013年7月8日保藏于中 国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为CGMCC NO.7899。 具体实施方式 0026 实施例1 梨树枝条降解细菌L2的富集、。
14、 分离筛选及鉴定 0027 1)梨树枝条高效降解菌的富集： 降解菌样品采自兰州常年堆置的梨树腐烂枝条， 过20目筛制成样品。 取枝条样品0.2g混匀在20g以梨树枝条为唯一碳源的固态富集培养基 中固态富集30d， 挑取枝条表面碎屑有黑色降解斑的培养基0.2g， 混匀接种到新的固态富集 培养基中继续富集30d。 继续挑取枝条表面碎屑有黑色降解斑的培养基1g接种到100mL液态 说明书 2/4 页 4 CN 106967637 A 4 富集培养基， 160rpm摇床培养培养， 定期补加无菌水； 30d后接种1mL至新的液态富集培养基 中， 同样条件继续培养30d， 获得对梨树枝条有高效降解效果的菌。
15、株。 其中， 固态富集培养 基： 烘干粉碎过20目筛的梨树枝条粉末20g， 添加超纯水至湿润。 液态富集培养基： (NH4)2SO4 0.5g， KH2PO4 1g， MgSO47H2O 0.5g， 水1L。 0028 2)梨树枝条降解菌的分离筛选： 利用梯度稀释涂布法将逐级稀释的富集样品的悬 液涂布到愈创木酚选择培养基上， 挑选生长较快的几株菌株进行分离纯化， 然后接种到LB- 愈创木酚平板和LB-苯胺蓝平板上观察其显色圈和褪色圈产生的时间和大小。 最终获得对 梨树枝条有高效降解效果的菌株L2。 L2在LB-愈创木酚平板上无显色反应， 在LB-苯胺蓝平 板上接种2d开始产生褪色圈(见图1)，。
16、 第6d时菌落直径为5mm， 褪色圈直径为20mm， A值达到4 (AD/d)。 其中， 愈创木酚选择培养基： 愈创木酚1g， KNO3 2g， MgSO4 0.5g， KH2PO4 1g， NaCl 1g， Na2HPO4 1g， 琼脂20g， 水1L。 LB-愈创木酚培养基： LB培养基中加入1gL-1愈创木酚。 LB- 苯胺蓝培养基： LB培养基加入0.1gL-1苯胺蓝。 0029 3)细菌L2的鉴定： 0030 生物学特性为： 在LB培养基上， 37， 培养36h， 菌落近圆形， 表面凸起， 黄色， 不透 明， 菌落2-4mm， 边缘整齐， 表面有光泽或较暗， 不分泌色素； 为革兰氏阳。
17、性细菌， 杆状， 1.2 1.52.04.0 m， 不运动， 芽孢椭圆形， 端生， 芽孢膨大不明显， 液化明胶慢、 胨化牛奶、 水 解淀粉、 不还原硝酸。 0031 采用细菌通用引物27f和1492r进行PCR扩增， 在GenBank中以BLAST进行序列同源 性比较， 与Bacillus megaterium的同源性达99， 选取和它相近的一些菌株绘制系统发育 进 化 树 ( 见 图 2 ) ， 以 及 结 合 菌 落 特 征 ， 鉴 定 该 菌 株 L 2 为 巨 大 芽 孢 杆 菌 (Bacillusmegaterium)。 0032 实施例2 降解酶活力的测定 0033 按1接种量接种。
18、细菌L2的菌种悬液(107/mL)接入已装有100mL液态产酶培养基 的三角瓶(250mL)中， 置28下160r/min振荡培养21d。 每2d取样1次， 发酵液离心过滤除去 菌体和杂质， 得到粗酶液， 测定其中木质素过氧化物酶(Lip)和锰过氧化物酶(MnP)的活性。 结果如图3和图4所示， 菌株L2可以产木质素降解酶能力较强， 产酶较快， 产酶维持时间较 长， 菌株L2产以上两种酶的酶活均在第15天达到最高值， 维持Lip酶活在10UmL-1以上达3d 多， 具有良好的产Lip的效果。 木质素过氧化物酶活最高值为21.76UmL-1， 锰过氧化物酶活 最高值为106.36UmL-1。 0。
19、034 Lip的酶活定义为每分钟氧化1 mol的藜芦醇为一个酶活单位(U)。 0035 MnP的酶活定义为每分钟氧化1 moL的Mn2+为Mn3+为一个酶活单位(U)。 0036 液态产酶培养基(/L)： 葡萄糖20g， 酒石酸铵0.2g， 梨树枝条粉1g， 基础培养基 100mL， 0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液(pH4.5)100mL， 吐温80 1.0g， VB1 1.0mg， 加水定容至 1L。 0037 基础培养基(/L)： K2PO4 20g， MnSO4 5g， CaCl2 1g， 微量元素液100mL， 加水定容至 1L 0038 微量元素液(/L)： MgSO4 3。
20、.0g， MnSO4 0.5g， NaCl 1.0g， FeSO47H2SO4 0.1g， CoCl20.1g， CuSO4 0.1g， H3BO3 0.01g， ZnSO47H2O 0.1g， AlK(SO4)212H2O 0.01g， Na2MoO42H2O 0.01g， 加水定容至1L。 说明书 3/4 页 5 CN 106967637 A 5 0039 实施例3 固态降解能力测定 0040 制备L2细菌菌剂， 方法如下： (1)、 将细菌L2接种于LB液体培养基中， 30振荡36h， 使含菌量达到109/mL， 芽孢形成率达90以上； (2)、 将步骤(1)培养好的菌悬液6000rpm。
21、离 心10min， 用少量的LB液体培养基重悬， 使细菌L2达到1010/mL， 4保存备用。 0041 向分化罐中加入5g烘干梨树枝条粉(40-60目)和10mL固态培养营养液(固态培养 营养液： NH4Cl 2.0g， MgSO47H2O 0.5g， KH2PO4 1.0g， Na2HPO4 0.2g， MnSO4 0.035g， CuSO4 5H2O 0.007g， FeSO47H2O 0.007g， 水1L)， 至固液混匀并显平坦状， 121灭菌20min， 按1 接种量接种L2细菌菌剂(1010/mL)， 置于30恒温箱中培养30d。 培养期间， 每隔1d加5mL无菌 水保持培养基表面湿润。 实验设置重复三次。 以接种等量无菌水作为空白试验。 培养结束 后， 于105下烘干至恒重称重， 测定降解率。 0042 降解率(降解前总质量-降解后总质量)/5g100。 0043 结果表明， 细菌L2的降解率为100.03。 空白对照降解率为0.080.02。 说明书 4/4 页 6 CN 106967637 A 6 图1 图2 说明书附图 1/2 页 7 CN 106967637 A 7 图3 图4 说明书附图 2/2 页 8 CN 106967637 A 8 。