《一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量分析方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量分析方法.pdf（9页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710084324.1 (22)申请日 2017.02.16 (71)申请人 中国农业科学院生物技术研究所 地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12号中国农业科学院生物技术研究所 (72)发明人 李亮董美金芜军宛煜嵩 刘卫晓李凯王迪 (74)专利代理机构 北京华仲龙腾专利代理事务 所(普通合伙) 11548 代理人 黄玉珏 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于转基因玉米核酸。
2、含量分析的质粒 参考物及核酸含量分析方法 (57)摘要 一种用于核酸含量分析的质粒参考物的构 建方法， 是将核酸样品的内标基因和待检测基 因， 又称外源基因共同构建到质粒载体中， 替代 基因组DNA， 实现对待测样品的含量确定。 连入到 质粒的两个片段中间含有酶切位点， 质粒DNA提 取纯化后， 用限制性内切酶通过上述酶切位点将 环状的质粒参考物切割为线性片段， 以此降低两 个片段的相互干扰， 提高扩增效率和核酸含量分 析结果的精准度， 尤其是应用于基于实时荧光定 量PCR方法的核酸含量分析过程。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 106916890 A 2017.07.04 CN 。
3、106916890 A 1.一种质粒， 所述质粒包括内标准基因和外源基因， 其特征在于， 所述内标准基因和外 源基因之间存在单一酶切位点。 2.一种参考物质粒的制备方法， 所述方法包括在含有内标准基因和外源基因的质粒中 插入单一酶切位点， 具体的， 所述插入单一酶切位点为在内标准基因和外源基因之间插入 单一酶切位点； 或， 所述方法包括将含有内标准基因、 单一酶切位点和外源基因的核苷酸片 段连入克隆载体中。 3.一种核酸含量分析和/或基因检测试剂盒， 所述试剂盒包括权利要求1所述的质粒。 4.权利要求1所述质粒、 权利要求2所述方法制备的参考物质粒和/或权利要求3所述试 剂盒在核酸含量分析和/。
4、或基因检测中的应用。 5.权利要求1所述质粒和/或权利要求2所述方法制备的参考物质粒在制备核酸含量分 析和/或基因检测试剂和/或试剂盒中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106916890 A 2 一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参考物及核酸含量 分析方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参 考物及核酸含量分析方法。 背景技术 0002 随着转基因作物及相关产品在全世界范围内的迅速发展， 其环境安全和食用安全 问题一直受到各国政府和广大消费者及相关检测机构人员的重视。 目前， 根据ISAAA机构统 计， 全球获批生产的转基。
5、因玉米已有149种， 对转基因玉米的核酸进行分析测试， 并保证结 果的准确、 可靠和有效性， 需要阳性参考物的支撑。 在保证转基因检测结果的可比性、 溯源 性， 推进转基因产品检测方法标准化等方面， 转基因生物参考物发挥着十分重要的作用。 0003 参考物或阳性对照是转基因生物检测监管中进行质量控制的关键， 目前转基因检 测用阳性对照主要依赖研发者提供， 出于自身经济利益考虑， 研发者向检测机构提供的阳 性样品量一般不大， 难以满足转基因生物安全监管工作的需要,因此， 构建质粒分子作为阳 性样品用于转基因玉米核酸含量分析不失为一种有效的手段。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是提供。
6、一种用于转基因玉米核酸含量分析的质粒参 考物及核酸含量分析方法。 0005 本发明所采用的技术方案在于： 0006 一种质粒， 所述质粒包括内标准基因和外源基因， 所述内标准基因和外源基因之 间存在单一酶切位点。 0007 一种参考物质粒的制备方法， 所述方法包括在含有内标准基因和外源基因的质粒 中插入单一酶切位点， 具体的， 所述插入单一酶切位点为在内标准基因和外源基因之间插 入单一酶切位点； 或， 所述方法包括将含有内标准基因、 单一酶切位点和外源基因的核苷酸 片段连入克隆载体中。 0008 一种核酸含量分析和/或基因检测试剂盒， 所述试剂盒包括权利要求1所述的质 粒。 0009 所述质粒。
7、、 所述方法制备的参考物质粒和/或所述试剂盒在核酸含量分析和/或基 因检测中的应用。 0010 所述质粒和/或所述方法制备的参考物质粒在制备核酸含量分析和/或基因检测 试剂和/或试剂盒中的应用。 附图说明 0011 图1为本发明的一种实施方式中， 构建的质粒DNA的内标准基因和外源基因中间有 一个酶切位点， 经限制性内切酶切割后， 形成线性DNA， 内标准基因和外源基因分布在了线 说明书 1/6 页 3 CN 106916890 A 3 性片段的两段， 从而形成了质粒参考物， 进行实时荧光定量PCR反应。 0012 图2为转基因玉米检测用质粒pBJGMM005的酶切后凝胶电泳检测结果， 其中泳。
8、道1 和6代表100bp Ladder的检测结果， 泳道2代表环状质粒DNA的检测结果， 泳道3-5代表酶切 后线性质粒DNA的检测结果(平行做了3次酶切)。 具体实施方式 0013 以下结合附图对本发明作进一步的描述。 0014 (实施例中所用的原料应能够从商业途径获得， 如不可从商业途径获得， 请提供该 原料的制备方法， 如该原料的制备方法中所用的材料不可从商业途径得到， 该材料的制备 方法也得提供； 或者将该原料替换为具有相同作用的可从商业途径得到的其它产品) 0015 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0016 实施例1： 0017 下述实施例中所用的材料、 。
9、试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0018 实验材料及试剂： 0019 下述实施例中所用的转基因样品均来自以下两个标准物质研制中心： 欧盟IRMM及 美国AOCS。 0020 下述实施例中所用的克隆载体pEASY购于北京全式金生物技术有限公司。 0021 实施例1、 质粒参考物pBJGMM005的构建及验证 0022 (一)质粒参考物pBJGMM005的构建 0023 (1)内标准基因序列的确定 0024 内标准基因选择的原则是， 具备物种特异性， 且为单拷贝基因。 在玉米中， 选择 alcohol dehydrogenase1(alc1)基因为内标准基因， 核苷酸序列为见序列表。
10、中的SEQ ID .1， 对应的引物对与探针见表1。 0025 表1 玉米内标准基因的引物及探针信息 0026 0027 玉米内标准基因的引物及探针信息反应体系见表2。 0028 表2 玉米内标准基因的反应体系 说明书 2/6 页 4 CN 106916890 A 4 0029 0030 扩增条件见表3。 0031 表3 玉米内标准基因的扩增条件 0032 0033 (2)外源基因的序列的确定 0034 外源基因即指的是通过基因功能手段插入玉米基因组的基因。 本实施例中， 选用 转基因玉米GA21为实验对象， 该玉米的外源基因检测方法参考了欧盟的JRC QT-EVE-ZM- 014， 核苷酸序。
11、列见序列表中的SEQ ID .2。 引物和探针见表4 0035 表4 转基因玉米GA21玉米引物及探针信息 0036 0037 反应体系见表5。 0038 表5 转基因玉米GA21的反应体系 0039 说明书 3/6 页 5 CN 106916890 A 5 0040 0041 (3)质粒参考物中单一酶切位点的确定 0042 酶切位点必须是质粒参考物中单一的位点， 也就是内标准基因、 外源基因、 质粒载 体上均不存在此位点。 0043 将上述步骤(1)确定的内标准基因、 步骤(2)确定的外源基因和质粒载体(具体本 实施例1选用克隆载体pEASY作为质粒载体)的核苷酸序列在NEBcutter V。
12、2.0的网页中进行 酶切位点预测， 然后根据NEB酶的目录， 找到一个常用的酶， 且该常用酶的酶切位点在上述 NEBcutter V2.0的酶切位点预测结果中不存在。 具体本实施例1选用BglII位点。 0044 (4)质粒参考物pBJGMM005的制备 0045 将内标准基因、 外源基因、 酶切位点通过基因合成的方式， 一次性合如pEASY的TA 克隆位点， 从而得到质粒参考物， 命名为pBJGMM005。 0046 (二)质粒参考物pBJGMM005的验证 0047 利用相应的内标准基因和外源基因引物对质粒pBJGMM005的两个基因进行验证， 检验构建质粒是否扩增预期的所有片段。 004。
13、8 内标准基因扩增引物、 外源基因扩增引物的序列、 反应体系和扩增条件参加表1- 5。 0049 结果如图2， 外源插入基因和内标准基因均可被检测到。 0050 实施例2、 线性和环状质粒参考物的比较 0051 (1)环状质粒参考物的酶切 0052 通过碱裂解法(可以选用商品化的试剂盒， 也可以按照分子克隆书籍配置)提取上 述实施例1制备得到的pBJGMM005质粒DNA， 将提取后的DNA进行限制性酶切， 酶切体系见表 6： 0053 表6 BglII酶切体系 0054 0055 反应条件： 温度依据酶说明书要求， 反应3h。 反应产物可以在-20下保存。 0056 质粒参考物pBJGMM0。
14、05经上述酶切反应后， 制备得到一线性载体， 内标准基因和外 源基因分别分布在该线性载体的两端。 说明书 4/6 页 6 CN 106916890 A 6 0057 (二)线性和环状质粒参考物的比较 0058 实时荧光定量PCR扩增验证， PCR反应体系见表3。 PCR仪器： BioRad CFX96。 反应程 序见表7。 0059 表7 PCR反应体系 0060 0061 表7中： 正向反向引物序列与探针参见表4。 体系参见表5， 反应程序参见表3。 0062 模板DNA1为质粒参考物pBJGMM005； 模板DNA2为本实施例步骤(一)制备的线性载 体。 0063 对反应完成后的PCR反应。
15、体系进行稀释， 共选取5个稀释梯度用作标准曲线， 前三 个点为10倍稀释， 后两个点为5倍稀释， 稀释后的拷贝数分别为： 5104， 5103， 5102， 100， 20copies/ l。 由所做的标准曲线可得出， 所构建的标准质粒分子的环状和线性的定量 PCR扩增效率， 结果见表8。 0064 表8 线性和环状扩增质粒参考物扩增效率比较 0065 0066 说明书 5/6 页 7 CN 106916890 A 7 0067 由表8实验结果可见， 线性质粒参考物扩增效率在90-110之间， 且接近100， 标准差仅为2， 符合国家标准 转基因植物及其产品成分检测实时荧光定量PCR方法 制定。
16、指南 (农业部2259号公告-5-2015)的要求； 而环状质粒参考物的扩增效率均值在 83.91， 低于国家标准的要求， 标准差为8.7， 表示结果不稳定。 故此， 证明了本研究所采 用的构建方法所获得的质粒及核酸含量分析方法具有较理想的效果。 0068 实施例3、 转基因玉米GA21中的核酸含量分析 0069 分别以pBJGMM005质粒DNA的线性及环状质粒参考物为阳性标准物质， 对欧盟发售 的转基因玉米GA21标准物质BF414d(标识含量为0.99) ,BF414e(标识含量为1.72) , BF414f(标识含量为4.29)进行定量分析， 以比较两种不同状态质粒分子的含量分析准确 。
17、性。 0070 内标准基因、 外源基因的引物探针、 反应体系和扩增程序见表1-5。 定量方法见公 式： 分别将外源基因与内标准基因Ct值带入公式(1)中， 计算得到相应的拷贝数a和b。 测试 样品中的转基因成分含量按公式(1)计算： 0071 0072 式中： 0073 C测试样品中的转基因成分含量； 0074 a测试样品中外源基因的拷贝数； 0075 b测试样品中内标基因的拷贝数。 0076 针对以上三个欧盟的样品， 分别测试了3次， 每次设置3个平行， 共得到了9组数据， 见表9。 通过表9可知， 线性质粒标准分子与欧盟标准物质的表示值的偏差(Bias)在3以 内， 而环状质粒DNA偏差达到了20以上， 从而证明了本发明描述的质粒DNA标准分子的构 建方法比传统方法在应用中具有更好的效果。 0077 表9 线性和环状pBJGMM005质粒DNA的定量测试能力比较 0078 0079 说明书 6/6 页 8 CN 106916890 A 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 106916890 A 9 。