技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及PRIMA1基因在制备椎间盘退行性疾病诊断试剂中的应用。
背景技术
椎间盘退行性疾病是指椎间盘组织在多种原因综合作用下发生细胞介导的生物化学变化，引起老化加速、椎间盘力学特性改变，使临近骨关节、韧带发生相应变化，造成脊柱不稳，压迫脊髓、神经根、动脉，引起相应临床症状和体征的综合征。它包括椎间盘源性腰痛、椎间盘突出症、退行性脊椎不稳症、退行性椎管狭窄症、退行性滑脱症等，是临床上常见疾病之一。其病因尚不清楚，目前普遍认为椎间盘退行性疾病的发生是遗传和环境因素共同作用的结果。随着基因检测技术的发展，近年来，人们逐渐意识到遗传易感性即遗传因素对于揭示椎间盘退行性疾病发病的重要作用。
目前椎间盘退行性疾病一般采取保守治疗，即从保守治疗依次到微创、常规手术治疗、非融合固定治疗、融合固定治疗的阶梯。越是高级阶梯的治疗，创伤越大，对机体自然解剖状态的干预越大，每一高级阶梯的治疗可作为对相对低级阶梯治疗的补救措施。对患者采取的治疗方案要根据患者病情所处的阶段，同时也要考虑到患者个体因素，如创伤、风险、费用以及患者的意愿。但是无论哪种手术方式，均不能在椎间盘退变的早期进行有效地干预，不能延缓或逆转疾病的发展。开放手术(椎间盘切除融合内固定术)虽能较为彻底的切除退变椎间盘，但手术创伤大，费用高，内固定限制了脊柱的活动度，加速邻近节段椎间盘的退变。微创手术不能彻底切除退变椎间盘组织，术后症状可能不能完全缓解，术后复发的可能性较大。
发明内容
本发明的目的之一在于提供PRIMA1基因或其表达产物在制备椎间盘退行性疾病诊断试剂中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种检测椎间盘退行性疾病的试剂盒。
本发明的目的之三在于提供一种治疗椎间盘退行性疾病的药物。
为实现上述目的，本发明首先提供PRIMA1基因或其表达产物在用于制备椎间盘退行性疾病诊断试剂中的应用。
优选地，所述PRIMA1基因或其表达产物在椎间盘退行性疾病组织中表达下调。
优选地，所述诊断试剂包括基因水平的诊断试剂和蛋白水平的诊断试剂，所述基因水平的诊断试剂包括通过实时荧光定量PCR方法或基因芯片方法检测基因表达水平；所述蛋白水平的诊断试剂包括通过免疫学方法检测PRIMA1基因表达产物的表达水平。
优选地，所述实时荧光定量PCR方法包括SYBRGreen法和TaqMan探针法。
优选地，所述基因芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性捕获PRIMA1基因的部分或全部核苷酸序列。
优选地，所述免疫学方法为ELISA检测方法。
优选地，所述ELISA法为使用ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括：包被PRIMA1基因单克隆抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，产物标准品，阴性对照品，稀释液，洗涤液，酶反应终止液等。所述抗体可采用市售的PRIMA1基因单克隆抗体，也可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。
进一步地，本发明提供一种椎间盘退行性疾病诊断试剂盒，所述试剂盒包括特异性扩增PRIMA1基因的引物组以及特异性捕获PRIMA1基因的荧光探针。
优选地，所述引物组包括如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的上游引物和如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的下游引物，所述荧光探针为如SEQ ID NO:4所示核苷酸序列。
优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液、dNTP、Taq酶。优选地，所述试剂盒含有阳性对照和阴性对照。优选地，所述阳性对照为正常的椎间盘髓核组织RNA或DNA，所述阴性对照为ddH2O。
进一步地，本发明还提供了一种椎间盘退行性疾病的治疗方法，所述方法包括促进PRIMA1基因的表达，或促进PRIMA1基因产物的表达，或增强PRIMA1基因产物的活性。
进一步地，本发明提供一种治疗椎间盘退行性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含PRIMA1基因或其表达产物的激活剂。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于，片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。
本发明的药物组合物还可与其他治疗椎间盘退行性病变的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
优选地，所述激活剂能促进PRIMA1基因的表达或增强其活性。优选地，所述激活剂通过构建过表达载体的方法促进PRIMA1基因或其产物的表达。优选地，所述激活剂为PcDNA3.1-PRIMA1。
本发明的激活剂一方面可以用于补充内源性的PRIMA1基因产物的缺失或不足，通过提高内源性产物的表达，从而治疗因内源性产物缺乏导致的椎间盘退行性疾病。另一方面可以用于增强内源性产物的活性，从而治疗椎间盘退行性疾病。
优选地，所述载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
进一步地，本发明提供的药物组合物在促进椎间盘退行性疾病细胞增殖中的应用。
本发明PRIMA1基因的编码序列如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明使用体外培养的髓核细胞研究PRIMA1基因对椎间盘退行性病变的治疗作用。本领域技术人员可知，椎间盘退行性病变发生的一个重要的生理特征在于髓核细胞的增殖减缓、衰老加快、凋亡加剧，因此本发明利用髓核细胞生长指标变化来研究PRIMA1基因与椎间盘退行性病变治疗的关系。
本发明的有益效果如下：
本发明发现了一种椎间盘退行性疾病诊断分子标记物PRIMA1基因，并进一步证实PRIMA1基因表达水平在椎间盘退行性疾病组织中表达下调。利用PRIMA1基因检测椎间盘退行性疾病不仅能够快速有效的做到疾病早期诊断，其精确度大大提高，而且为基因治疗、药物治疗等临床应用提供了治疗靶点和重要依据。
附图说明
图1实时荧光定量PCR检测PRIMA1基因在椎间盘退行性疾病髓核组织中的表达情况；
图2实时荧光定量PCR检测PRIMA1基因在椎间盘退行性疾病髓核细胞中的表达情况；
图3 PRIMA1基因的过表达对髓核细胞增殖能力的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
本发明的发明人对10例椎间盘退行性疾病患者的髓核组织样本及4例对照样本进行高通量测序，结果发现，椎间盘退行性疾病患者的髓核组织中PRIMA1基因的水平与对照相比显著下调。进一步地，发明人采用TaqMan实时荧光定量PCR方法验证了PRIMA1基因在椎间盘退行性疾病患者髓核组织中表达下调，其相关制剂可用于椎间盘退行性疾病。
PRIMA1(proline rich membrane anchor 1，脯氨酸丰富的膜锚1)位于14号染色体上，是蛋白编码基因，能将乙酰胆碱酯酶组装成四聚体，并将其锚定在神经细胞膜上。
实施例1筛选与椎间盘退行性疾病相关的基因标志物
1、样本收集
取2012年10月到2015年12月期间在北京协和医院骨科收集10例椎间盘退行性疾病患者作为实验组，对照组来源于同时期骨科住院的其他疾病患者，共收集4例。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。获取所有研究对象椎间盘髓核组织，编号后置-80℃低温冰箱保存。
2、对髓核组织进行总RNA提取
采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)进行样本RNA提取，实验操作按产品说明书进行，具体操作如下：
收集样本后冻存于液氮，取出后把髓核组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温保存5分钟；
②加氯仿0.2mL，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5分钟-10分钟；
③12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；
④12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。
3、RNA样品的质量分析
RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
4、高通量测序
测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Ontology和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们筛选了差异表达基因PRIMA1，该基因在髓核组织样本中表达下调。
实施例2TaqMan实时荧光定量PCR验证椎间盘退行性疾病患者PRIMA1基因的表达情况
1、材料
按照实施例1的样本收集方式收集15例椎间盘退行性疾病患者髓核组织及8例对照髓核组织，对其进行分组及编号。
2、方法
2.1对髓核组织进行总RNA提取，同实施例1的提取方法。
2.2逆转录
采用III Reverse Transcriptase(invitrogen，货号18080-044)进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。获得的cDNA保存放-20℃冰箱备用。
2.3 Real-Time PCR
利用ABI Primer Express 3.0软件设计管家基因(Actin)和目的基因(PRIMA1)的荧光定量扩增引物及探针，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物和探针序列如下：
PRIMA1基因：
上游引物：AAGGTGCTTCCCACACATCTG(SEQ ID NO.2)；
下游引物：GAGCCTAGGGTGTAGGGTGTCA(SEQ ID NO.3)；
探针：CATCGCCCCATCTGCAGTTGTTGTC(SEQ ID NO.4)。
Actin基因：
上游引物：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA(SEQ ID NO.5)；
下游引物：CTCGGCCAGGGTGTTGAA(SEQ ID NO.6)；
探针：GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCTT(SEQ ID NO.7)。
用Probe qPCR Mix(TOYOBO)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。荧光定量PCR反应体系如下：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix：12.5uL，引物(10μM)：正、反向引物各0.8uL，TaqMan Probe(10μM)：0.4uL，ROX Reference Dye(50×)：0.5uL，RNase-free dH2O：8uL，模板cDNA：2uL，总体系25uL。反应程序在ABI7500上进行，扩增程序为：95℃5min，(95℃15sec，59℃35sec)×40个循环。
3、统计学分析
实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，基线平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；采用2-ΔΔCt法分析结果，根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔΔCt×100％，比较PRIMA1基因在椎间盘退行性疾病患者髓核组织和对照组髓核组织中的表达水平。结果显示：qRT-PCR扩增结果稳定，其中PRIMA1基因在椎间盘退行性疾病组织表达水平明显低于对照组，约是对照组的35％，具体见图1，以上结果验证了高通量测序分析的结果。
实施例3 PRIMA1基因过表达
一、细胞培养
(1)将获取的髓核组织在无菌条件下用D-HANKS(华迈科，货号HMK03230)液冲洗3次。
(2)用剪刀将髓核组织剪碎(约1mm3大小)，置于无菌离心管中。
(3)使用0.25％胰蛋白酶于37℃消化20min，每5min摇动一次。
(4)800rpm离心5min，弃去上清液。
(5)0.2％Ⅱ型胶原酶37℃消化4h，用200目筛网过滤。
(6)滤液以800rpm离心5min，弃去上清液。
(7)DMEM/F12培养基冲洗，800rpm离心5min，重复3次。
(8)细胞计数后接种于培养瓶，含10％体积胎牛血清的DMEM/F12培养基作为养液，于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
二、实验方法
1、根据PRIMA1基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物的设计为本领域技术人员所熟知。
从髓核细胞抽提RNA，逆转成cDNA，以此为模板扩增基因，上游引物CGCGGATCCGCCACCATGCTCCTCCGGGACTTG(SEQ ID NO.8)，下游引物GCCGCTCGAGTCACACCACTGCGTTGTTCAG(SEQ ID NO.9)。PCR产物琼脂糖凝胶电泳，DNA回收纯化，将pcr产物及pcDNA3.1载体质粒用BamH I、Xhol I进行双酶切，回收产物，在T4DNA连接酶的作用下，将pcr产物与pcDNA3.1载体质粒连接，转化E.coli感受态细胞，挑取抗氨苄青霉素阳性克隆，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，使用PCR和双酶切鉴定分析，选取含目标片段的单克隆菌落递交上海生工生物工程有限公司进行测序鉴定。重组质粒定名为PcDNA3.1-PRIMA1基因。
2细胞转染
实验分为空白对照组(blank)、阴性对照组(pcDNA3.1空载体)和实验组(pcDNA3.1-PRIMA1)。按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent提供的步骤进行。
(1)将5×104细胞接种在6孔板上，这些用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70％；
(2)准备质粒DNA-LipofectamineTM 2000复合物:
a.以250μL Opti-MEM稀释5μL LipofectamineTM 2000，轻轻混匀，室温下孵育5分钟；
b.实验各组分别取4μg质粒DNA加入250μL Opti-MEM中进行稀释，并轻轻摇动将其混匀；
c.孵育5分钟后，将稀释的质粒DNA和LipofectamineTM 2000混合后在室温下孵育20分钟。
(3)在培养板中的每个孔中都加入细胞、培养基及DNA-LipofectamineTM2000复合物。然后轻轻摇动培养板，使他们充分混合；
(4)放置在37℃，CO2培养箱内孵育48小时，在荧光显微镜下观察细胞转染数量，检测转染效率；
(5)转染效率为荧光镜与光镜视野中的细胞数量的比值，细胞的转染效率均达到90％以上，方可以进行后续的实验。计算公式如下：
转染效率＝发荧光细胞的数量/相同视野下的细胞数量×100％
3、利用Real-Time PCR实验检测PRIMA1基因的过表达情况
具体步骤参照实施例2。
PRIMA1基因：
上游引物：CTGGTGATCATCATTGCCGTAT(SEQ ID NO.10)；
下游引物：GGCTTTGTAGCAAATGATGACAAG(SEQ ID NO.11)；
探针：CTGTGCCTCCCTGGTGTTTCTGACTGT(SEQ ID NO.12)。
Actin基因：
上游引物：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA(SEQ ID NO.5)；
下游引物：CTCGGCCAGGGTGTTGAA(SEQ ID NO.6)；
探针：GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCTT(SEQ ID NO.7)。
三、实验结果
pcDNA3.1-PRIMA1实验组与pcDNA3.1空载体组和空白对照组相比，实验组中PRIMA1基因的表达水平明显上调，表明质粒转染成功并稳定表达(P<0.05)，具体情况见图2。
实施例4 PRIMA1基因过表达对人椎间盘退行性疾病细胞增殖的影响
实验分组：空白对照组、pcDNA3.1空载体组和pcDNA3.1-PRIMA1组。
取对数增殖期细胞配置成1×104/mL单细胞悬液接种于96孔板，每孔100μL，每组设6个复孔。待细胞贴壁后，加入CCK-8试剂，2h后用酶标仪测定其450nm波长吸光度值作为零点。以后连续3d每过24h，每孔加入CCK-8试剂10μL温育2h后，酶标仪测定细胞吸光度值，并绘制细胞增殖曲线。
结果显示，pcDNA3.1-PRIMA1组细胞生长速度明显高于pcDNA3.1空载体组和空白对照组细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明PRIMA1基因过表达能促进椎间盘髓核细胞的生长，具体情况见图3。
实施例5试剂盒组装
组装本发明所述用于检测椎间盘退行性疾病的试剂盒，该试剂盒包括特异扩增PRIMA1的引物和探针序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；和特异扩增管家基因(Actin)的引物和探针序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；还包括PCR Mix反应体系，如PCR缓冲液、Taq酶和dNTPs。还包括正常椎间盘组织cDNA：作为对照与检测样本cDNA共同定量PCR检测，每个反应体系使用与检测样本cDNA相同量。
反应程序为：95℃5min，(95℃15sec，59℃35sec)×40个循环。
PCR反应体系如表1所示。
表1定量PCR反应体系
组分 加入量 PCRMix反应体系 12.5μL 上游引物(10μM) 0.5μL 下游引物(10μM) 0.5μL TaqManProbe(10μM) 0.4uL 模板cDNA 2.0μL 加入灭菌蒸馏水 至25μL
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京昊源生物医学科技有限公司
<120> PRIMA1基因在制备椎间盘退行性疾病诊断试剂中的应用
<130> p16zjp42
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 462
<212> DNA
<213> 基因序列
<400> 1
atgctcctcc gggacttggt gctgcgccgt ggctgctgct ggtcctcgct gctgctgcac 60
tgcgcgctcc acccgctctg gggcttcgtg caggtgacgc atggtgagcc ccagaagtcc 120
tgctccaaag tgactgacag ctgccgacac gtctgccagt gccggccccc tcccccgctg 180
cccccgccgc ccccaccccc gccacctccc agactcctct ccgccccagc tcccaactct 240
acctcttgcc ccactgagga aagctggtgg tcggggctgg tgatcatcat tgccgtatgc 300
tgtgcctccc tggtgtttct gactgtgctt gtcatcattt gctacaaagc cataaaaagg 360
aaaccactga gaaaagacga aaatggcacc agcgttgctg agtatcccat gagtgcttcg 420
cagagcaaca aaggagtaga cgtgaacaac gcagtggtgt ga 462
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaggtgcttc ccacacatct g 21
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagcctaggg tgtagggtgt ca 22
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catcgcccca tctgcagttg ttgtc 25
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatacgaagg gagggtgtac ca 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctcggccagg gtgttgaa 18
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcttctgatg gcaagctcta cgtctcctt 29
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgcggatccg ccaccatgct cctccgggac ttg 33
<210> 9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gccgctcgag tcacaccact gcgttgttca g 31
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctggtgatca tcattgccgt at 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggctttgtag caaatgatga caag 24
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctgtgcctcc ctggtgtttc tgactgt 27