技术领域
本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种镉-血红蛋白螯合物及其制备 方法和应用。
背景技术
血红蛋白(hemoglobin；HB；HGB)是高等生物体内负责运载氧的一种蛋 白质。是使血液呈红色的蛋白。人类红细胞内有三种正常血红蛋白即Hb-A、A2及F。Hb-A是正常成人红细胞内血红蛋白之主要成分，Hb-A2是次要成分约占 2％,而Hb-F在正常成人或儿童之红细胞中占2-3％以下，Hb-F在胚胎十月开 始产生为胎儿红细胞之主要成分，足月新生儿的红细胞中Hb-F占70-80％,其余 为Hb-A，二个月后占50％，四个月后少于10％，六个月后大部消失。血红蛋白 除运输氧气二氧化碳，还可以导致血管痉挛和血管收缩。在体内存在的三种形式 的血红蛋白，氧合血红蛋白、还原型血红蛋白及高铁血红蛋白，其中氧合血红蛋 白缩血管能力最强，而高铁血红蛋白几乎没有收缩血管活性。
镉(Cd)是一种常见的有毒金属及环境污染物，广泛应用于工业生产环境 中，包括电镀、制造工业颜料、塑料稳定剂、镍铬电池等，与人们生活息息相关。 对于普通人群，主要是通过吸入镉污染的空气，及食用含镉污水灌溉农田生产的 农作物(如含镉大米)等方式摄入镉。当然，吸烟也是慢性镉吸入的另一重要来 源。随着经济的飞速发展，镉污染对于人类的影响越来越大。
镉与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的 活性。随着对镉毒性研究的深入，人们逐渐认识到镉与蛋白的相互作用在其致毒 过程中扮演着重要的角色，被认为是了解镉的毒性机理的关键所在，因此，对镉 和蛋白质相互作用的研究就显得愈发重要。而现在关于镉与蛋白质作用的机理仅 是冰山一角，还有很多蛋白质与镉之间的关系还不清楚，因而加强研究对于镉与 蛋白质之间的关系至关重要。
发明内容
针对镉污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种镉-血红蛋白螯合物及 其制备方法，并建立镉-血红蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测 镉-血红蛋白螯合物在评价一个地区镉污染程度的应用。通过定量检测一个地区 人群血清中镉-血红蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受镉污染的情况，从 而间接反映这个地区镉污染程度。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种镉-血红蛋白螯合物， 镉离子与血红蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。
本发明还提供一种上述的镉-血红蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
A)镉与血红蛋白的螯合反应：在提纯源于人体的血红蛋白或按照生物学方 法重组的血红蛋白中加入镉离子进行螯合反应，得到反应溶液；
B)纯化镉-血红蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中 未反应的血红蛋白以及多余的镉离子，即得镉-血红蛋白螯合物。
其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：
(1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使镉-血 红蛋白螯合物复溶；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能 与血红蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)中样品，然后上 柱，血红蛋白与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L 的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；
(5)收集：收集洗脱液Ⅰ；
(6)透析：将步骤(5)中的收集的洗脱液Ⅰ，装透析袋，用ddH2O透析 除盐，换水三次后，4℃透析过夜夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱 中装入能与镉特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上 柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L 的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；
(10)收集：收集洗脱液Ⅱ；
(11)透析：将步骤(10)中的收集的洗脱液Ⅱ，装透析袋，用ddH2O透 析除盐，换水三次后，4℃透析过夜夜，收集样本，即得镉-血红蛋白螯合物。
其中，上述镉-血红蛋白螯合物的制备方法，还包括步骤C)：对镉-血红蛋 白螯合物的鉴定；
其中，步骤C)中具体如下：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶 床；
(2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的镉-血红蛋白螯合物，加入稀释缓 冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
(4)检测：在胶床上找出含镉的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然 后再采用ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有镉以及检测镉的含量。
本发明还提供一种如上述的镉-血红蛋白螯合物在制备检测人体内镉-血红 蛋白螯合物的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种至少包括如上述的镉-血红蛋白螯合物作为标准品的试剂 盒。
优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获血红蛋白的物质或捕 获镉的物质。
本发明还提供一种定量检测镉-血红蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述 的镉-血红蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免 疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合 法、提纯镉-血红蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯镉-血红蛋白螯合物与原子 吸收光谱结合法、提纯镉-血红蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电 泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。
实施本发明的镉-血红蛋白螯合物及其制备方法和应用，具有以下有益效果：
1.本发明首次体外合成镉-血红蛋白螯合物；
2.本发明首次提出镉-血红蛋白螯合物可用于制备检测血样中镉-血红蛋白螯 合物的试剂或试剂盒中的应用。
3.本发明建立了镉-血红蛋白螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测镉- 血红蛋白螯合物在评价一个地区镉污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群 血清中镉-血红蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受镉污染的情况，从而间 接反映这个地区镉污染程度。本发明建立的镉-血红蛋白螯合物定量检测方法其 准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。
附图说明
图1为本发明所述的镉-血红蛋白螯合物的非变性电泳条带图；
图2为本发明所述的镉-血红蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分 析图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述：
本发明除特别说明外，涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用试 剂、材料如下述所列举，在本发明中没有列举出来的均为本领域常用的试剂或可 以通过市购方式获得：
磷酸盐溶液为0.05-0.1mol/L Na2HPO4溶液或0.5-1mol/L Na2HPO4溶液；
提取试剂为PEG溶液、硼酸盐缓冲液等(采用PEG法)；
胶床介质为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种；
捕获血红蛋白的物质为上海江莱生物科技有限公司生产的型号为KAY0043 的抗血红蛋白抗体；其中，本发明所述与血红蛋白特异性结合的物质、抗HB抗 体、抗血红蛋白抗体均为捕获血红蛋白的物质；
捕获镉的物质为巴傲得生物科技有限公司生产的型号为AP7015的抗镉抗 体；其中，本发明所述与镉特异性结合的物质、抗Cd抗体、抗镉抗体、镉抗均 为捕获镉的物质；
酶标抗体为含有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体中的一种；
底物为甲基联苯胺(TMB)溶液；
红细胞裂解液的配方如下：139.6mmol/L NH4Cl，16.96mmol/L Tris，用1 mol/L HCl调pH至7.2；
洗涤液为含有KH2PO4 0.2mg/ml、Na2HPO4·12H2O 2.90mg/ml、NaCl 8.0mg/ml、KCl 0.2mg/ml、0.5％Tween-20的pH为7.4的0.15M PBS溶液；
封闭液为1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉；
稀释缓冲液为含1.5mg/mL Na2CO3、2.93mg/ml NaHCO3的PH为9.6的0.05M 碳酸盐缓冲液；
酶标抗体为HRP酶标抗体；
终止液为：将21.7ml的2M H2SO4定容至200ml的ddH2O中；
洗脱液为含木瓜蛋白酶的PH为8.0的0.1mol/L Tris-HCL缓冲液；
酸化剂为硝酸；
上样缓冲液为含有1M Tris-HCl(pH 6.8)15.5mL、1％溴酚蓝2.5mL、 ddH2O7mL、甘氨酸25mL的Sample buffer(5X)；
电泳缓冲液为含Tris 3mg/ml、甘氨酸14.4mg/ml的PH为6.8的ddH2O溶 液。
本发明提供一种镉-血红蛋白螯合物，镉离子与血红蛋白通过巯基或/和半胱 氨酸残基螯合而成。
本发明还提供一种镉-血红蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
A)镉与血红蛋白的螯合反应：在人源的血红蛋白中加入镉离子进行螯合反 应，得到反应溶液；
B)纯化镉-血红蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中 未反应的血红蛋白以及多余的镉离子，即得镉-血红蛋白螯合物，具体步骤如下：
(1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使镉-血 红蛋白螯合物复溶；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能 与血红蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；所述 能与血红蛋白特异性结合的填料为含抗血红蛋白抗体的硅胶或树脂；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)中样品，然后上 柱，血红蛋白与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L 的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；
(5)收集：收集洗脱液Ⅰ(6)透析：将步骤(5)中的收集的洗脱液Ⅰ， 装透析袋，用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱 中装入能与镉特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；所述能与 镉特异性结合的填料为含抗镉抗体的硅胶或树脂；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上 柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L 的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；
(10)收集：收集洗脱液Ⅱ；
(11)透析：将步骤(10)中的收集的洗脱液Ⅱ，装透析袋，用2升ddH2O 透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得镉-血红蛋白螯合物；
C)对镉-血红蛋白螯合物的鉴定，具体步骤如下：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶 床；
(2)加样：取步骤B)中提取纯化得到的镉-血红蛋白螯合物，加入稀释缓 冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，进行电泳；
(4)检测：在胶床上找出含镉的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然 后再采用ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有镉以及检测镉的含量。
本发明还提供一种至少包括如上述的镉-血红蛋白螯合物作为标准品的试剂 盒。
优选地，该试剂盒中还包括包被液，该包被液含有捕获血红蛋白的物质或捕 获镉的物质。
在本发明中，能实现本发明目的的试剂盒可以列出以下几种，但并不限于 此。
一种检测血样中镉-血红蛋白螯合物的试剂盒，包括含有捕获血红蛋白的物 质的包被液、封闭液、洗涤液、作为二抗的可捕获镉的物质、酶标抗体、红细胞 裂解液、底物、终止液、稀释缓冲液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中镉-血红蛋白螯合物的试剂盒，包括含有捕获血红蛋白的物 质的包被液、封闭液、洗涤液、洗脱液、红细胞裂解液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中镉-血红蛋白螯合物的试剂盒，包括含有捕获血红蛋白的物 质的包被液、封闭液、洗涤液、洗脱液、酸化剂、过氧化氢、红细胞裂解液、阳 性对照、阴性对照等。
一种检测血样中镉-血红蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中血红蛋 白所需提取试剂、复溶液、含有捕获镉的物质的包被液、、封闭液、洗涤液、酶 标抗体、底物、终止液、稀释缓冲液、红细胞裂解液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中镉-血红蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中血红蛋 白所需提取试剂、复溶液、红细胞裂解液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中镉-血红蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中血红蛋 白所需提取试剂、复溶液、酸化剂、过氧化氢、红细胞裂解液、阳性对照、阴性 对照等。
一种检测血样中镉-血红蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中血红蛋 白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、上样缓冲液、溶解胶床上含镉的蛋白条带 所需液体、含有捕获镉的物质的包被液、封闭液、洗涤液、酶标抗体、底物、终 止液、稀释缓冲液、红细胞裂解液、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中镉-血红蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中血红蛋 白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、上样缓冲液、溶解胶床上含镉的蛋白条带 所需液体、阳性对照、阴性对照等。
一种检测血样中镉-血红蛋白螯合物的试剂盒，包括作为提纯全血中血红蛋 白所需提取试剂、胶床介质、复溶液、上样缓冲液、溶解胶床上含镉的蛋白条带 所需液体、酸化剂、过氧化氢、红细胞裂解液、阳性对照、阴性对照等。
上述几种试剂盒中，所述阳性对照为标准品，即螯合有重金属镉的血红蛋白 螯合物或螯合有重金属镉的BSA螯合物；所述阴性对照为不含有标准品的稀释 缓冲液。
上述试剂盒用于检测螯合镉的血红蛋白，以提高检测的准确性，重复性，并 使之在临床中得到推广。
本发明还提供一种定量检测镉-血红蛋白螯合物的方法，以已知含量的上述 的镉-血红蛋白螯合物作为标准品，采用以下方法之一对样品进行检测：酶联免 疫法、酶联免疫与原子吸收光谱结合法、酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合 法、提纯镉-血红蛋白螯合物与酶联免疫结合法、提纯镉-血红蛋白螯合物与原子 吸收光谱结合法、提纯镉-血红蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法、电 泳与酶联免疫或原子吸收光谱或电感耦合等离子体质谱结合法。在本发明中，用 检测镉-血红蛋白螯合物的方法可以列出的有以下几种，但并不限于以下几种。
其中，上述定量检测镉-血红蛋白螯合物的方法中采用的试剂如下：
方法一：酶联免疫法(ELISA法)检测镉-血红蛋白螯合物，按照如下步骤 检测：
1)将能够捕获血红蛋白的物质，如抗血红蛋白抗体(抗HB Ab)包被于固 相载体上：用稀释缓冲液将抗HB A b稀释至500-4000倍，加入ELISA板微孔 中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)从循环系统取全血，作待检样品，将全血中加入去离子水，再加入红细 胞裂解液，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以 1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并 用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于36.5-37.5℃放置1-2小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镉- 血红蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔 中，37℃作用1-2小时；
5)加入可以捕获镉的物质，并且温育：移去待检样品，并用洗涤液进行洗 涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释至12500-100000倍的抗Cd Ab，37℃ 作用1-2小时，使抗Cd Ab与血红蛋白上的金属镉反应形成抗原抗体复合物；
6)酶结合物温育：移去抗镉抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后， 加入用稀释缓冲液稀释的酶标抗体，使稀释的酶标抗体的浓度为2μg/mL，37℃ 作用1-2小时，使其与酶标抗体反应；
7)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入 底物，37℃避光作用30分钟；
8)终止反应：将终止液滴加至每一微孔；
9)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读 取待检样品和标准品的OD值，通过绘制标准曲线，求得待检样品的含量(也可 不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测)。
该方法利用ELISA原理，可以将全血中的特异性血红蛋白提取出来，提取 出来的血红蛋白上部分螯合有重金属镉，而这部分血红蛋白上的镉被抗镉抗体所 捕获，之后可以再被辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获(该抗 体不识别包被蛋白)，捕获上的抗体在显色剂及终止液的作用下，可以在仪器下 读出OD值，而不含有螯合金属镉的血红蛋白，则不会被抗镉的特异性抗体所捕 获，也不会与辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记的抗体所捕获，而所用试剂 中也不含有金属镉(阴性对照组结果为阴性)，因而当所读取的OD值结果显示 为阳性时，即可证明检测出血红蛋白上螯合的金属镉。
方法二：酶联免疫与原子吸收光谱结合法(ELISA法+AAS法)检测镉-血 红蛋白螯合物按照如下步骤检测：
1)将能够捕获血红蛋白的物质，如抗血红蛋白抗体(抗HB Ab)包被于固 相载体上：用稀释缓冲液将抗HB Ab稀释至500-4000倍，加入ELISA板微孔中， 4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)从循环系统取全血，作待检样品，将全血中加入去离子水，再加入红细 胞裂解液，1000rpm离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以 1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并 用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于36.5-37.5℃放置1-2小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镉- 血红蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔 中，37℃作用1-2小时；
5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入洗脱 液，在37℃下洗脱1-3小时。
6)检测：从ELISA板的微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于血红蛋 白上的镉，并绘制标准曲线，读出数值；
该方法利用ELISA原理的基础上结合原子吸收光谱(AAS)原理，利用原 子吸收光谱仪检测螯合于血红蛋白上的镉，由于溶液中仅含有血红蛋白，且所用 试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对结果造成干扰，因而 当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出血红蛋白上螯合的金属镉。
方法三：酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法(ELISA法+ICP-MS法) 检测镉-血红蛋白螯合物按照如下步骤检测：
1)将能够捕获血红蛋白的物质，如抗血红蛋白抗体(抗HB Ab)包被于固 相载体上：用稀释缓冲液将抗HB Ab稀释至500-4000倍，加入ELISA板微孔中， 4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3小时，储存冰箱；
2)从循环系统取全血，作待检样品，将全血中加入去离子水，再加入红细 胞裂解液，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以 1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并 用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于36.5-37.5℃放置1-2小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镉- 血红蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40倍，加入微孔 中，37℃作用1-2小时；
5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入洗脱 液，在37℃下洗脱1-3小时。
6)酸化：在步骤5)中的溶液中加入酸化剂对溶液进行酸化，封口过夜， 彻底酸化，加入过氧化氢，并且加热赶酸；
7)检测：从步骤6)的ELISA板的溶液中取0.5ml液体，于电感耦合等离 子体质谱仪下检测螯合于血红蛋白的镉，并绘制标准曲线，读出数值。
该方法在利用ELISA原理的基础上，结合感耦合等离子体质谱(ICP-MS) 原理，用电感耦合等离子体质谱仪检测螯合于血红蛋白上的镉，由于溶液中仅含 有血红蛋白，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴性)，不会对 结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测出血红蛋白上 螯合的金属镉。
方法四：提纯镉-血红蛋白螯合物与酶联免疫结合法(提纯法+ELISA法)检 测镉-血红蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)从全血中提取血红蛋白：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超 滤或凝胶过滤等方法从全血提取纯化血液中的血红蛋白，并将血红蛋白复溶于溶 液中，得到血红蛋白溶液；
2)将抗Cd Ab包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗Cd Ab稀释至 12500-100000倍，加入ELISA板微孔中，4℃过夜16-18小时，或37℃水浴1-3 小时，储存冰箱；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入以 1％-5％牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并 用洗涤液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于36.5-37.5℃放置1-2小时；
4)加待检样品，并且温育：从步骤1)的溶液中取样，作待检样品；以已 知含量的镉-血红蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至10-40 倍，加入微孔中，37℃作用1-2小时；
5)酶结合物温育：移去步骤4)中的待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待 洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释的酶标抗体，使稀释的酶标抗体的浓度为 2μg/mL，37℃作用1-2小时，使其与酶标抗体反应；
6)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入 底物，37℃避光作用30分钟；
7)终止反应：将终止液滴加至每一微孔；
8)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别读 取待检样品和标准品的OD值，通过绘制标准曲线，求得待检样品的含量(也可 不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测)。
方法五：提纯镉-血红蛋白螯合物与原子吸收光谱结合法(提纯法+AAS法) 检测血样中镉-血红蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)从全血中提取血红蛋白：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超 滤或凝胶过滤等方法从全血提取纯化血液中的血红蛋白，并将血红蛋白复溶于溶 液中，得到血红蛋白溶液；
2)检测：从步骤1)得到的溶液中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于血 红蛋白上的镉，并绘制标准曲线，读出数值。
方法六：提纯镉-血红蛋白螯合物与电感耦合等离子体质谱结合法(提纯法 +ICP-MS法)检测镉-血红蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)从全血中提取血红蛋白：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超 滤或凝胶过滤等方法从全血提取纯化血液中的血红蛋白，并将血红蛋白复溶于溶 液中，得到血红蛋白溶液；
2)酸化：从步骤1)得到的溶液中取样，在溶液中加入酸化剂(如硝酸) 对溶液进行酸化，封口过夜，彻底酸化，加入过氧化氢，并且加热赶酸；
3)检测：从步骤2)得到的溶液中取0.5ml液体，于电感耦合等离子体质谱 仪下检测螯合于血红蛋白上的镉，并绘制标准曲线，读出数值。
方法七：电泳与酶联免疫法或原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱结合 法(电泳法-ELISA法/AAS法/ICP-MS法)检测镉-血红蛋白螯合物，按照如下 步骤检测：
1)从全血中提取血红蛋白：采用聚乙二醇PEG沉淀法或超速离心或分子超 滤或凝胶过滤等方法从全血提取纯化血液中的血红蛋白，并将血红蛋白复溶于溶 液中，得到血红蛋白溶液；
2)制备胶床：根据需要选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶或SDS-聚丙烯酰 胺凝胶等作为介质，按照常规方法制备好胶床；
3)加样：取步骤1)得到的溶液8μL加入2μL上样缓冲液，混匀，短暂 离心；(注意此处步骤不能煮)
4)电泳：连接电泳板，进行电泳分离；
5)检测：在胶床上找出含有镉的蛋白条带，将该条带取出，将该蛋白条带 溶于液体之中，然后再分别利用ELISA或ICP-MS或AAS检测溶于液体中的镉 含量。此外，还可以利用此方法检测螯合镉的血红蛋白的等电点、分子量及含量 等。
方法七中的血红蛋白从红细胞中释放后可以用多种方法提纯出来(例如超速 离心法或高压液相层析法或凝胶过滤层析法或凝胶电泳法或ELISA方法等)， 将提纯出来的血红蛋白复溶于溶液中，取一定量的血红蛋白，利用电荷移动原理， 进行电泳(electrophoresis，EP)，在凝胶板(可根据需要采用不同介质)上可 根据分子量、等电点等不同跑出不同的条带，寻找出富含镉的相应条带，将凝胶 中的蛋白质复溶于溶液中，即可以在特定波长下检测相关血红蛋白的含量，也可 以利用ELISA或AAS或ICP-MS等原理检测出螯合于血红蛋白上的镉含量，由 于溶液中仅含有血红蛋白，且所用试剂中不含任何重金属(阴性对照组结果为阴 性)，不会对结果造成干扰，因而当所读取的结果显示为阳性时，即可证明检测 出血红蛋白上螯合的金属镉。
下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。
实施例1：镉-血红蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：
A)镉与血红蛋白的螯合反应：在人源的血红蛋白中加入镉离子进行螯合反 应，得到反应溶液；
试剂配制：
1)硼酸盐缓冲液(0.01M)：称取0.31g硼酸溶于400ml超纯水中，用0.1M 的NaOH调节pH至9.0，定容至500mL。
2)血红蛋白溶液：称取4.0mg血红蛋白溶于4.0mL 0.01M pH9.0硼酸盐缓 冲液中，充分振荡溶解，配制成1.0mg/mL的蛋白溶液；
3)EDTA-NaHCO3混合溶液：称取EDTA·2H2O 1.86g、NaHCO3 16.8g溶于 900mL超纯水中，用1.0M NaOH调整pH至8.0定容至1000ml，高压灭菌，室 温保存；
4)ITCBE购买自日本同仁化学研究所，货号为M030；
5)透析袋购自Bioshop Inc，截留分子量14000。
镉-血红蛋白螯合物的螯合步骤：
1)透析袋的处理：将透析袋放入500ml的EDTA-NaHCO3混合溶液中，煮 沸10min；倾弃EDTA/NaHCO3液，用超纯水轻轻漂洗，再用500ml的5mmol/L EDTA溶液煮沸10min；弃掉煮沸液，用超纯水彻底清洗，加入超纯水浸泡透析 袋4℃过夜。使用时，戴上手套，取出透析袋，用超纯水彻底冲洗其内外表面；
2)取2.0mg ITCBE溶于2ml DMSO中；
3)取4.0mg血红蛋白溶于4.0ml硼酸盐缓冲溶液中；
4)缓慢将步骤2)配制的液体加入步骤3)配制的血红蛋白溶液中，边滴加 边震荡，置于温度为25℃，转速为100r/min的摇床中反应24h，然后用透析袋 透析24h，除去未与血红蛋白结合的ITCBE；
5)将步骤4)所得的液体用1mol/L HCl调节pH值至7.0，然后缓慢逐渐滴 加80μl的1mmol/L镉离子溶液，边滴加边振荡，以免镉离子使蛋白变性沉淀；
6)将步骤5)所得的溶液置于温度为25℃，转速为100r/min的摇床中反应 2h，用透析袋进行透析24h；
7)将步骤6)透析后的液体于-20℃分装保存，得到反应溶液。
B)纯化镉-血红蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液(即 步骤7)得到的反应溶液)中未反应的血红蛋白以及多余的镉离子，即得镉-血红 蛋白螯合物，具体步骤如下：
(1)溶解样品：向经过步骤7)得到的反应溶液中加入生理盐水使镉-血红 蛋白螯合物复溶；
(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能 与血红蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；
(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)中样品，然后上 柱，血红蛋白与填料特异性结合；
(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L 的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；
(5)收集：收集洗脱液Ⅰ；
(6)透析：将步骤(5)中的收集的洗脱液Ⅰ，装透析袋，用ddH2O透析 除盐，换水三次后，4℃透析过夜夜，收集样本；
(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱 中装入能与镉特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；
(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上 柱；
(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L 的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；
(10)收集：收集洗脱液Ⅱ；
(11)透析：将步骤(10)中的收集的洗脱液Ⅱ，装透析袋，用2升ddH2O 透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得镉-血红蛋白螯合物；
C)对镉-血红蛋白螯合物的鉴定，具体步骤如下：
(1)制备胶床：以琼脂糖凝胶作为介质制备胶床；
(2)加样：取步骤B)中8μL提取纯化得到的镉-血红蛋白螯合物，加入2μL 上样缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；
(3)电泳：连接电泳板，加入电泳缓冲液进行电泳；电泳过程中，电流为 22mA恒流，环境温度为4℃；电泳至至溴酚蓝移至胶底部时停止电泳；
(4)检测：在胶床上找出含镉的蛋白条带，将该蛋白条带取出并溶解，然 后再采用ELISA法或ICP-MS法或AAS法检测是否含有镉以及检测镉的含量。
D)检测结果
(1)石墨炉原子吸收光谱法(AAS)初步测定HB中重金属含量：结果见 表1
表1为血红蛋白中重金属含量(μg/L)
样本名 Cd(μg/L) HB 167.78 (NH4)2SO4 0.05 N.S 0.04 N.S 0
(2)电泳结果：
其中，图1为本发明所述的镉-血红蛋白螯合物的非变性电泳条带图。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为活性电泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可 以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电 泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电 泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，因此左边泳道M为变 性Marker，只用于检测，没有标记作用，泳道Hb为血红蛋白电泳条带。
(3)同步辐射X荧光分析：
蛋白条带内微量元素含量的SRXRF分析在北京正负电子对撞机(BEPC)的 4W1"同步辐射束线上完成。储存环中电子束流能量为2.2GeV，束流强度100 mA。样品移动台(TSA200型，北京卓立汉光公司)可在计算机控制的步进马达 驱动下沿X、Y二维方向上移动以改变入射光斑位置，移动步长为0.0025mm。 从样品发射出的X射线由Si(Li)探测器(PGT Inc.LS 30143-DS)探测，探头与入 射SR线共平面且相互垂直，距样品照射点20mm，信号用PGT多道分析仪(MCA 4000)获取输出。用11.5keV的单色同步辐射光激发样品，调节入射光斑(1mmx 3mm)位置使之处于条带一端，在300s的测定时间内，光斑一直沿条带均匀缓 慢移动，计数结束时光斑移到该条带另一端。沿电泳方向每1mm取一个谱。采 用AX IL软件处理数据，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它元素峰 进行归一处理，以抵消束流强度变化对信号强弱产生的影响。在相同的条件下以 同样的方式测量定量标准干胶膜的荧光谱。
图2为本发明所述的镉-血红蛋白螯合物的电泳条带的同步辐射X线荧光分 析图，图中横坐标为蛋白条带位置，纵坐标为该条带各金属能量(含量)值。
本发明一种定量检测镉-血红蛋白螯合物的方法的检测条件的确定：
1.抗血红蛋白抗体、抗隔抗体最佳工作浓度以及全血的最佳稀释倍数的确 定
步骤如下：
(1)将抗HB Ab用稀释缓冲液按照抗HB Ab与稀释缓冲液的质量体积比 为1:500、1:1000、1:2000、1:4000进行稀释，加入ELISA板微孔中，将抗HB Ab 包被于固相载体上，每个浓度包被三排，4℃过夜18小时；
(2)移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2％牛血清 白蛋白作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
(3)待检样品按待检样品与稀释缓冲液的质量体积比为1:10、1:20、1:40 进行稀释，加入微孔中，按照上述包被的抗HB Ab浓度，同一个浓度的抗HB Ab 的分别加入不同稀释度全血，37℃作用1小时；
(4)移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入抗Cd Ab， 抗Cd Ab按抗Cd Ab与稀释缓冲液的质量体积比为1:12500、1:25000、1:50000、 1:100000进行稀释，按照每一个相同抗HB Ab、全血稀释浓度，不同浓度抗Cd Ab 各加2孔，37℃作用1小时，使抗Cd Ab与HB上的金属镉反应；
(5)酶标抗体选择最适工作浓度，即2μg/mL，移去抗Cd抗体，并用洗涤 液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释HRP酶标抗体，37℃作用 1小时，使HRP酶标抗体与镉-血红蛋白螯合物反应；
(6)移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃ 避光作用30分钟；
(7)将终止液滴加至每一微孔；
(8)取波长405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别 读取各孔OD值。根据各孔OD值数值，选择抗HB Ab、抗Cd Ab的最佳工作 浓度以及全血的最佳稀释倍数。
试验中同时以所制标准品作为阳性对照，选择抗HB Ab+封闭+抗Cd Ab+ 酶标+底物(即不加待检样品)作为阴性对照1；抗HB Ab+封闭+全血+酶标+ 底物(即不加抗Cd Ab)作为阴性对照2；抗HB Ab+封闭+酶标+底物(即不加 待检样品和抗Cd Ab)作为阴性对照3；抗HB Ab+封闭+全血+抗Cd Ab+底物 (即不加酶标)作为阴性对照4；封闭+全血+抗Cd Ab+酶标+底物(即不加抗 HB Ab捕获HB)作为空白对照1；只加底物作为空白对照2及PBS作为空白对 照3。检测结果见表2-3。
表2：棋盘滴定法确定抗HB Ab、抗Cd Ab的 最佳工作浓度以及全血的最佳稀释倍数的数据(每个数据皆为平均值)
表3：ELISA阳性对照及阴性对照ELISA检测结果
由表2-3数据显示，我们可以看出当抗HB Ab的稀释度为1:1000、全血稀 释度为1:20、Cd抗稀释度为1:12500时，OD值最大，所以选此值所对应的浓度 作为最佳工作浓度。
2.定量检测镉-血红蛋白螯合物的方法中方法二、三中洗脱液最佳工作浓度 及洗脱时间的确定
步骤如下：(1)包被：将抗Cd抗体用稀释缓冲液稀释至12500倍(质量 体积比)，37℃水浴3小时，储存冰箱；
(2)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，用2％ 牛血清白蛋白作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤；
(3)移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲 液稀释的酶标抗体，酶标抗体稀释至浓度为2μg/mL，37℃作用2小时，使其与 抗Cd Ab反应；
(4)准备洗脱液：将木瓜蛋白酶用pH 8.0,0.1mol/L Tris-HCI缓冲液配制成 100ng/ml，再加入1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)37℃孵育30min；
(5)移去酶标抗体，用稀释缓冲液对洗脱液进行稀释，使洗脱液中的木瓜 蛋白酶的浓度与酶标抗体的浓度之比为1:80、1:40、1:20、1:10、1:5(其中每个 浓度作3个复孔)，分别放置于37℃温度下洗脱1h、2h、3h；
(6)移去洗脱液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入底物，37℃ 避光作用30分钟；
(7)将终止液滴加至每一微孔；
(8)取405nm波长，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分 别读取每组OD值，通过与PBS缓冲液组比较，比较出洗脱液的最适浓度及洗 脱时间，具体结果参见表4。
表4：ELISA洗脱液最佳工作浓度及洗脱时间确定
从表4中我们可以发现，当洗脱液中的木瓜蛋白酶的浓度与酶标抗体的浓度 之比＝1:20时，各组OD值均低于其他几组，说明该浓度洗脱液洗脱效果最优(即 将ELISA孔壁上结合的抗Cd Ab-酶标复合物洗脱程度达到最大，因而OD值最 低)；而洗脱时间不管是1h、2h、3h，各组OD值变化均不大，可见随着时间 的延长，酶活力逐渐减弱，在酶浓度不变的情况下，延长消化时间并不能提高消 化率，所以本试验中洗脱液的洗脱时间为1-3h皆可。
应用实施例1
取采用ELISA法检测100份标本全血中的镉-血红蛋白螯合物，按照以下步 骤进行检测：酶联免疫法(ELISA法)检测镉-血红蛋白螯合物，按照如下步骤 检测：
1)将抗HB Ab包被于固相载体上：用稀释缓冲液将抗HB Ab稀释至1000 倍，加入ELISA板微孔中，37℃水浴1小时，储存冰箱；
2)从循环系统取全血，作待检样品，将全血中加入去离子水，再加入红细 胞裂解液，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加2％ 牛血清白蛋白作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤， 洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镉- 血红蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至20倍，加入微孔中， 37℃作用1小时；
5)加入可以捕获镉的物质，并且温育：移去待检样品，并用洗涤液进行洗 涤，待洗涤完成后，加入用稀释缓冲液稀释12500倍，37℃作用1小时，使抗 Cd Ab与血红蛋白上的金属镉反应；
6)酶结合物温育：移去抗镉抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后， 加入用稀释缓冲液稀释的HRP酶标抗体，37℃作用1小时，使其与酶标抗体反 应；
7)底物温育：移去酶标抗体，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入 底物，37℃避光作用30分钟；
8)终止反应：将终止液滴加至每一微孔；
9)取波长为405nm，加完终止液后，将ELISA板置于酶标仪上检测，分别 读取待检样品OD值(也可不使用酶标仪，直接通过显色情况进行定性检测)， 具体检测值如表5所示。
表5：100份血样标本中镉-血红蛋白螯合物的ELISA检测结果
应用实施例2
采用酶联免疫与原子吸收光谱结合法(ELISA法+AAS法)检测100分标本 血样中的镉-血红蛋白螯合物，按照如下步骤检测：
1)将能够捕获血红蛋白的物质，如抗血红蛋白抗体(抗HB Ab)包被于固 相载体上：用稀释缓冲液将抗HB Ab稀释至1000倍，加入ELISA板微孔中，4℃ 过夜18小时；
2)从循环系统取全血，作待检样品，将全血中加入去离子水，再加入红细 胞裂解液，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入2％ 牛血清白蛋白或脱脂奶粉作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤 液进行洗涤，洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镉- 血红蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至20倍，加入微孔中， 37℃作用1小时；
5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入木瓜 蛋白酶浓度为100ng/ml的洗脱液，洗脱1-3小时；
6)检测：从ELISA板的微孔中取样，于原子吸收光谱仪检测螯合于血红蛋 白上的镉，检测值如表6所示。
表6：100份血样标本中镉-血红蛋白螯合物的AAS检测结果
应用实施例3
采用酶联免疫与电感耦合等离子体质谱结合法(ELISA法+ICP-MS法)检 测100分标本血样中的镉-血红蛋白螯合物含量，按照如下步骤检测：
1)将能够捕获血红蛋白的物质，如抗血红蛋白抗体(抗HB Ab)包被于固 相载体上：用稀释缓冲液将抗HB Ab稀释至1000倍，加入ELISA板微孔中，4℃ 过夜18小时；
2)取100份标准血样作为待检样品，将全血中加入去离子水，再加入红细 胞裂解液，1000rmp离心5-8分钟，离心弃去沉淀；
3)封闭：移去稀释缓冲液，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入2％ 牛血清白蛋白作为封闭液，37℃放置1小时，移去封闭液，并用洗涤液进行洗涤， 洗涤完成后，ELISA板于37℃放置1小时；
4)加待检样品，并且温育：加入步骤2)中的待检样品、以已知含量的镉- 血红蛋白螯合物作标准品；用稀释缓冲液将待检样品稀释至20倍，加入微孔中， 37℃作用1小时；
5)洗脱：移去待检样品，并用洗涤液进行洗涤，待洗涤完成后，加入木瓜 蛋白酶浓度为100ng/ml的洗脱液，洗脱1-3小时；
6)酸化：在步骤5)中的溶液中加入硝酸对溶液进行酸化，封口过夜，彻 底酸化，加入过氧化氢，并且加热赶酸；
7)检测：从步骤6)得到的溶液中取样，于电感耦合等离子体质谱仪下检 测螯合于血红蛋白的镉，检测值如表7所示。
表7：100份血样标本中镉-血红蛋白螯合物的ICP-MS检测结果
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它 各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要 求的保护范围之内。