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1、(10)授权公告号 CN 101648883 B (45)授权公告日 2013.01.16 CN 101648883 B *CN101648883B* (21)申请号 200910072812.6 (22)申请日 2009.09.08 C07C 225/16(2006.01) C07C 221/00(2006.01) C07D 295/112(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 东北林业大学 地址 150040 黑龙江省哈尔滨市和兴路 26 号东北林业大学 专利权人 付玉杰 (72)发明人 付玉杰 祖元刚 骆浩 马永婷 孔羽 李双明 罗猛 CN 1651。
2、384 A,2005.08.10, 权利要求 1-7， 说明书 1-4 页 . JP 2008106013 A,2008.05.08, 说明书 1-18 页 . (54) 发明名称 具有抗肿瘤活性的异甘草素衍生物及其合成 方法 (57) 摘要 本发明涉及一类具有抗肿瘤活性的异甘草素 衍生物及其合成方法， 属于医药技术领域。 以异甘 草素和小分子伯胺或仲胺为原料， 经过 Mannich 反应， 合成一系列含氮原子侧链的异甘草素衍生 物。此合成方法具有步骤简单， 条件温和， 产物易 纯化的优点。 该类化合物拥有良好的抗肿瘤活性、 水溶性而且细胞毒性大大低于异甘草素。 (51)Int.Cl. (56。
3、)对比文件 审查员 李钊博 权利要求书 1 页 说明书 10 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 10 页 1/1 页 2 1. 一类具有良好抗肿瘤活性的含氮原子侧链的异甘草素衍生物， 其特征在于 ： 具有通 式 I 所示的结构式， 式 I 中 R 为二甲胺甲基、 吗啉 -4- 基甲基、 环己胺甲基、 二乙胺甲基、 仲丁胺甲基、 叔丁 胺甲基、 羟乙基胺甲基、 二羟乙基胺甲基或吡咯烷 -1- 基甲基。 2.权利要求1所述通式I的含氮原子侧链的异甘草素衍生物的合成方法， 其特征在于 ： 以异甘草素和小分子伯胺或仲胺为原料， 经过 Mannich。
4、 反应， 合成一系列含氮原子侧链的 异甘草素衍生物， 其具体合成步骤如下 ： 取异甘草素放入圆底烧瓶中， 加入伯胺或仲胺溶液， 控制温度为 10-50， 电磁搅拌过 程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液与冰乙酸的混合物， 滴加完毕立刻停止反应， 加入 少量水稀释， 用二氯甲烷、 三氯甲烷或乙酸乙酯的其中一种萃取， 合并有机相， 用无水硫酸 钠干燥 ； 硅胶柱分离， 先用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为41的乙 酸乙酯 - 甲醇溶液洗脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体 ； 用体积比范围在 1 1 1 3 的石油醚、 丙酮混合溶剂重结晶得到黄色粉末。 3. 权利要求 2 。
5、所述的含氮原子侧链的异甘草素衍生物的合成方法， 其特征在于 ： 原料 异甘草素既可以通过人工全合成也可以通过天然产物提取获得。 4.权利要求1所述通式I的含氮原子侧链的异甘草素衍生物在制备抗肿瘤药物中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 101648883 B 2 1/10 页 3 具有抗肿瘤活性的异甘草素衍生物及其合成方法 技术领域 0001 本发明涉及一种异甘草素衍生物的合成方法以及它们的抗肿瘤活性。 背景技术 0002 异 甘 草 素 的 化 学 名 为 4， 2 ， 4 - 三 羟 基 查 尔 酮 (4， 2 ， 4 -tryhydroxychalcone)， 难溶于水、 易溶于丙酮、。
6、 乙醚、 氯仿等有机溶剂。因最初从豆科 植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、 胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘 草 Glycyrrhiza glabra L. 的干燥根及其根茎提取物分离出来而得名。 0003 异甘草素是甘草中的一个重要的查尔酮化合物， 具有抗肿瘤、 抗病毒、 抗自由 基、 抑制脂质过氧化、 抑制免疫缺陷病毒 HIV 等生物活性， 此外还可治疗肠痉挛， 糖尿病， 抑郁性精神病等。其中抗肿瘤作用是近年来国内外的研究热点， 张晶等研究发现异甘 草素可以显著抑制人宫颈癌细胞体内外增殖 张晶， 杨静， 汤宏斌， 异甘草素对人。
7、宫颈 癌细胞增殖的抑制作用， 中国药理学与毒理学杂志， 2005， 19(6)， 436-442 ； 王小芹等通 过研究异甘草素脂质体对人前列腺癌细胞体外增殖的作用时发现异甘草素能有效地抑 制前列腺癌细胞的增生 王小芹， 杨静， 郑航， 异甘草素脂质体对人前列腺癌细胞体外 增殖的抑制作用， 医学新知杂志， 2007， 17(2)， 84-85 ； Tetsuyuki Takahashi 等人研究 表明异甘草素在鼠和人结肠癌细胞中， 可以抑制细胞生长和促进细胞凋亡 Tetsuyuki Takahashi， Masaki Baba， Hoyoku Nishino， Toru Okuama， Cyc。
8、looxygenase-2 plays a suppressive role forinduction of apoptosis in isoliquritigenin-treated mouse colon cancer cells， CancerLetters， 2006， 231(2)， 319-325 ； Hsu 等研究了异甘草素能 诱导人肝癌 G2/M 期细胞停滞并诱导细胞凋亡， 从而抑制肝癌细胞的生长 Ya-Ling Hsu， Po-Lin Kuo， Chun-Ching Lin， Isoliquritigenin induces apoptosis and cell cycle 。
9、arrest throughp53-dependent pathway in Hep G2 cells， Life Sciences， 2005， 77(3)， 279-292。 但由于异甘草素难溶于水， 降低了其体内抗肿瘤活性， 进而影响了它在医药领域 的广泛应用。 0004 本发明旨在合成一系列含有氮原子侧链的异甘草素衍生物， 增加其抗肿瘤活性及 水溶性， 使之成为抗肿瘤新药前体， 满足医药领域用药需求。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种以异甘草素和小分子伯胺或仲胺为原料， 经过 Mannich 反应， 合成一系列具有良好抗肿瘤活性和水溶性的含氮原子侧链的异甘草素衍生 物的方法。
10、。 0006 本发明提供了一类具有良好抗肿瘤活性的含氮原子侧链的异甘草素衍生物， 具有 通式 I 所表示的结构式 ： 0007 说 明 书 CN 101648883 B 3 2/10 页 4 0008 式 I 中 R 为各种伯胺甲基或仲胺甲基。 0009 合成如通式 I 的含氮原子侧链的异甘草素衍生物的方法 ： 以异甘草素和小分子伯 胺或仲胺为原料， 经过 Mannich 反应， 合成一系列含氮原子侧链的异甘草素衍生物， 反应方 程式如下 ： 0010 0011 其中 ： R 为各种伯胺或仲胺， CH3COOH 为乙酸， R 为伯胺甲基或仲胺甲基。 0012 所述含氮原子侧链的异甘草素衍生物 。
11、(I) 的合成具体步骤如下 ： 0013 取异甘草素放入圆底烧瓶中， 加入伯胺或仲胺溶液， 控制温度为 10-50， 电磁搅 拌过程中， 快速滴加质量分数为36甲醛溶液与冰乙酸的混合物。 滴加完毕立刻停止反应。 加入少量水稀释， 用二氯甲烷、 三氯甲烷或乙酸乙酯的其中一种萃取， 合并有机相， 用无水 硫酸钠干燥 ； 硅胶柱分离， 先用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体 ； 用体积比范围在 1 1 1 3 的石油醚、 丙酮混合溶剂重结晶得到黄色粉末。 0014 本发明所述的通式 I 所表示的含氮原子侧链的异。
12、甘草素衍生物， 具有良好的抗肿 瘤活性、 水溶性而且细胞毒性大大低于异甘草素。 具体实施方式 0015 以下实例详述本发明， 但是， 本发明不限于具体叙述的下实例。 0016 实施例 1 0017 3 - 二甲胺甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备， 结构式如下 ： 0018 说 明 书 CN 101648883 B 4 3/10 页 5 0019 称取异甘草素 0.64g 放入圆底烧瓶中， 加入质量分数为 33二甲胺水溶液 0.46mL。控制温度为 20， 电磁搅拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.23mL 和 6mL 冰乙酸， 滴加完毕立刻停止反应。加入少量水稀释，。
13、 用乙酸乙酯萃取。合并有机相， 用 无水硫酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体。用体积比为 1 1 的 石油醚、 丙酮混合溶剂重结晶得到黄色粉末 0.28g， 收率 35.9。 0020 mp ： 176 0021 ESI-MS(m/z) ： 314M+1+； 312M-1- 0022 1H-NMR(500MHz， DMSO) ： 2.410(6H， s， (CH 3)2N-)， 3.836(2H， s， -CH2N)， 6.220(1H， d， J 9Hz， H3)， 6.8。
14、24-6.841(2H， m， H5， H6)， 7.670-7.747(4H， m， H2， 3 ， 5， 6 )， 8.032(1H， d， J 9Hz， H2). 0023 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 190.65， 172.59， 170.20， 164.47， 160.58， 143.63， 132.05， 131.46， 126.36， 118.04， 116.29， 111.01， 110.15， 106.89， 54.17， 43.76 0024 实施例 2 0025 3 - 吗啉甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备， 结构式如下 ： 0026 0。
15、027 称取异甘草素0.64g放入圆底烧瓶中， 加入吗啉0.26mL， 控制温度为20， 电磁搅 拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.23mL 和冰乙酸 6mL， 滴加完毕立刻停止反 应。加入少量水稀释， 用二氯甲烷萃取。合并有机相， 用无水硫酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先用 乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体。用体积比为 1 1.5 石油醚、 丙酮的混合溶剂重结晶得到 说 明 书 CN 101648883 B 5 4/10 页 6 黄色粉末 0.36g， 收率 40.4。 0028 mp ：。
16、 180 0029 ESI-MS(m/z) ： 356M+1+； 354M-1- 0030 1H-NMR(500MHz， DMSO) ： 2.506(4H， s， -(CH 2)2N)， 3.611(4H， s， -(CH2)2O)， 3.744(2H， s， -CH2N)， 6.385(1H， d， J 9Hz， H3)， 6.831 6.849(2H， m， H5， H6)， 7.751 7.768(4H， m， H2 ， 3 ， 5 ， 6 )， 8.133(1H， d， J 9Hz， H2). 0031 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 191.68， 165.27， 1。
17、63.75， 160.27， 144.30， 131.47， 131.24， 125.75， 117.31， 115.82， 112.35， 107.99， 107.75， 66.00， 52.54， 51.99. 0032 实施例 3 0033 3 - 环己胺甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备， 结构式如下 ： 0034 0035 称取异甘草素0.64g放入圆底烧瓶中， 加入环己胺0.35mL， 控制温度为20， 电磁 搅拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.23mL 和冰乙酸 6mL， 滴加完毕立刻停止 反应。加入少量水稀释， 用乙酸乙酯萃取。合并有机相， 用无水硫。
18、酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先 用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗 脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体。用体积比为 1 2 的石油醚、 丙酮混合溶剂重结晶得 到黄色粉末 0.40g， 收率 43.2。 0036 mp ： 168 0037 ESI-MS(m/z) ： 368M+1+； 366M-1- 0038 1H-NMR(500MHz， DMSO) ： 1.138 1.988(10H， m， -CH2-)， 2.742(1H， s， -CHN)， 4.008(2H， s， -CH2N)， 5.994(1H， d， J 9Hz， H3)，。
19、 6.803 6.820(2H， m， H5， H6)， 7.589 7.697(4H， m， H2 ， 3 ， 5 ， 6 )， 7.877(1H， d， J 9Hz， H2). 0039 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 188.20， 175.04， 164.28， 159.67， 141.63， 131.33， 130.63， 126.14， 117.91， 115.74， 111.99， 108.27， 105.14， 54.78， 29.88， 25.02， 23.93. 0040 实施例 4 0041 3 - 二异丙胺甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备，。
20、 结果式如下 ： 0042 说 明 书 CN 101648883 B 6 5/10 页 7 0043 称取异甘草素0.64g放入圆底烧瓶中， 加入二异丙胺0.43mL， 控制温度为20， 电 磁搅拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.23mL 和冰乙酸 6mL， 滴加完毕立刻停 止反应。加入少量水稀释， 用三氯甲烷萃取。合并有机相， 用无水硫酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗 脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体。用体积比为 1 2 的石油醚、 丙酮混合溶剂重结晶得 到黄色粉末 0.35g， 收率 。
21、38.2。 0044 mp ： 180 0045 ESI-MS(m/z) ： 370M+1+； 368M-1- 0046 1H-NMR(500MHz， DMSO) ： 1.125(12H， s， -CH 3)， 3.228(2H， s， -CHN)， 3.959(2H， s， -CH2N)， 6.156(1H， d， J 9Hz， H3)， 6.820 6.837(2H， m， H5， H6)， 7.704 7.741(4H， m， H2 ， 3 ， 5 ， 6 )， 8.004(1H， d， J 9Hz， H2). 0047 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 190.52， 1。
22、70.27， 163.17， 160.02， 143.27， 131.01， 125.89， 117.50， 115.78， 110.58， 109.59， 106.60， 49.11， 41.99， 30.66， 18.27. 0048 实施例 5 0049 3 - 二乙胺甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备， 结构式如下 ： 0050 0051 称取异甘草素0.64g放入圆底烧瓶中， 加入二乙胺0.32mL， 控制温度为20， 电磁 搅拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.23mL 和冰乙酸 6mL， 滴加完毕立刻停止 反应。加入少量水稀释， 用乙酸乙酯萃取。合并有机。
23、相， 用无水硫酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先 用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗 说 明 书 CN 101648883 B 7 6/10 页 8 脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体。用体积比为 1 1 的石油醚、 丙酮混合溶剂重结晶得 到黄色粉末 0.45g， 收率 52.8。 0052 mp ： 176 0053 ESI-MS(m/z) ： 342M+1+； 340M-1- 0054 1H-NMR(500MHz， DMSO) ： 1.087(6H， t， J 7Hz， CH3)， 2.708 2.751(4H， q， J 7Hz， (C。
24、H2)2N-)， 3.924(2H， s， -CH2N)， 6.189(1H， d， J 9Hz， H3)， 6.820 6.837(2H， m， H5， H6)， 7.670 7.748(4H， m， H2 ， 3 ， 5 ， 6 )， 8.023(1H， d， J 9Hz， H2). 0055 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 190.80， 170.48， 164.19， 160.52， 143.69， 131.85， 131.48， 126.38， 118.03， 116.27， 111.08， 110.13， 106.68， 49.28， 46.45， 10.79. 0。
25、056 实施例 6 0057 3 - 仲丁胺甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备， 结构式如下 ： 0058 0059 称取异甘草素0.64g放入圆底烧瓶中， 加入仲丁胺0.31mL， 控制温度为20， 电磁 搅拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.23mL 和冰乙酸 6mL， 滴加完毕立刻停止 反应。加入少量水稀释， 用乙酸乙酯萃取。合并有机相， 用无水硫酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先 用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗 脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体。用体积比为 1 3 的石油醚、 丙酮混合溶剂重结晶得 到黄。
26、色粉末 0.32g， 收率 37.4。 0060 mp ： 175 0061 ESI-MS(m/z) ： 342M+1+； 340M-1- 0062 1H-NMR(500MHz， DMSO) ： 0.916 0.930(6H， d， J 7Hz， CH3)， 1.821 1.875(1H， m， -CHN)， 2.562(2H， d， J 7Hz， -CH2-)3.986(2H， s， -CH2N)， 6.044(1H， d， J 9Hz， H3)， 6.810 6.827(2H， m， H5， H6)， 7.609 7.709(4H， m， H2 ， 3 ， 5 ， 6 )， 7.912(1。
27、H， d， J 9Hz， H2). 0063 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 189.17， 174.56， 164.68， 160.22， 142.45， 131.84， 131.19， 126.59， 118.34， 116.24， 111.95， 109.23， 105.78， 54.73， 44.17， 26.79， 20.58. 0064 实施例 7 0065 3 - 叔丁胺甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备， 结构式如下 ： 0066 说 明 书 CN 101648883 B 8 7/10 页 9 0067 称取异甘草素0.64g放入圆底烧瓶中， 加入叔。
28、丁胺0.33mL， 控制温度为20， 电磁 搅拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.23mL 和冰乙酸 6mL， 滴加完毕立刻停止 反应。加入少量水稀释， 用二氯甲烷萃取。合并有机相， 用无水硫酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先 用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗 脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体。用体积比为 1 3 的石油醚、 丙酮混合溶剂重结晶得 到黄色粉末 0.41g， 收率 48.5。 0068 mp ： 170 0069 ESI-MS(m/z) ： 342M+1+； 340M-1- 0070 1H-NMR(500MHz。
29、， DMSO) ： 1.268(9H， s， CH 3)， 3.975(2H， s， -CH2N)， 5.993(1H， d， J 9Hz， H3)， 6.810 6.827(2H， m， H5， H6)， 7.593 7.697(4H， m， H2 ， 3 ， 5 ， 6 )， 7.880(1H， d， J 9Hz， H2). 0071 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 188.59， 164.80， 160.18， 142.09， 131.89， 126.63， 118.39， 116.24， 112.66， 108.63， 105.64， 54.03， 37.54， 26.。
30、47. 0072 实施例 8 0073 3 - 乙醇胺甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备， 结构式如下 ： 0074 0075 称取异甘草素 0.64g 放入圆底烧瓶中， 加入乙醇胺 0.18mL， 控制温度为 20， 电 磁搅拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.23mL 和冰乙酸 6mL， 滴加完毕立刻停 说 明 书 CN 101648883 B 9 8/10 页 10 止反应。加入少量水稀释， 用乙酸乙酯萃取， 合并有机相， 用无水硫酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗 脱， 洗脱液。
31、浓缩至于， 得到黄色固体。用体积比为 1 2.5 石油醚、 丙酮的混合溶剂重结晶 得到黄色粉末 0.29g， 收率 35.3。 0076 mp ： 180 0077 ESI-MS(m/z) ： 330M+1+； 328M-1- 0078 1H-NMR(500MHz， DMSO) ： 2.821(2H， s， -CH 2OH)， 3.585(2H， s， -CH2N)， 4.012(2H， s， -CH2N)， 6.034(1H， d， J 8Hz， H3)， 6.818 6.829(2H， m， H5， H6)， 7.634 7.691(4H， m， H2 ， 3 ， 5 ， 6 )， 7.9。
32、02(1H， d， J 8Hz， H2). 0079 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 165.03， 160.16， 142.20， 131.89， 131.14， 126.64， 118.40， 116.23， 112.23， 108.95， 105.79， 58.14， 49.26， 43.30. 0080 实施例 9 0081 3 - 二乙醇胺甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备， 结构式如下 ： 0082 0083 称取异甘草素0.64g放入圆底烧瓶中， 加入二乙醇胺0.29mL， 控制温度为20， 电 磁搅拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.2。
33、3mL 和冰乙酸 6mL， 滴加完毕立刻停 止反应。加入少量水稀释， 用三氯甲烷萃取。合并有机相， 用无水硫酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗 脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体。用体积比为 1 1 的石油醚、 丙酮混合溶剂重结晶得 到黄色粉末 0.44g， 收率 47.5。 0084 mp ： 106 0085 ESI-MS(m/z) ： 374M+1+； 372M-1- 0086 1H-NMR(500MHz， DMSO) ： 2.741(4H， s， -(CH 2)2N)， 3.578 3.601(4H，。
34、 t， J 6Hz， -CH2OH)， 3.980(2H， s， -CH2N)， 6.284(1H， d， J 9Hz， H3)， 6.832 6.848(2H， m， H5， H6)， 7.742 7.759(4H， m， H2 ， 3 ， 5 ， 6 )， 8.085(1H， d， J 9Hz， H2) 0087 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 191.61， 172.47， 168.05， 164.05， 160.66， 144.30， 131.88， 131.62， 126.31， 117.93， 116.30， 112.05， 109.29， 108.12， 58.0。
35、7， 55.86， 50.29， 21.53. 0088 实施例 10 说 明 书 CN 101648883 B 10 9/10 页 11 0089 3 - 吡咯烷基甲基 -2， 4， 4 - 三羟基查尔酮的制备， 结构式如下 ： 0090 0091 称取异甘草素0.64g放入圆底烧瓶中， 加入四氢吡咯0.25mL， 控制温度为20， 电 磁搅拌过程中， 快速滴加质量分数为 36甲醛溶液 0.23mL 和冰乙酸 6mL， 滴加完毕立刻停 止反应。加入少量水稀释， 用三氯甲烷萃取， 合并有机相， 用无水硫酸钠干燥， 硅胶柱分离， 先用乙酸乙酯洗脱， 除去未反应的异甘草素， 再用体积比为 4 1 。
36、的乙酸乙酯 - 甲醇溶液洗 脱， 洗脱液浓缩至干， 得到黄色固体。用体积比为 1 1 石油醚、 丙酮的混合溶剂重结晶得 到黄色粉末 0.38g， 收率 45.4。 0092 mp ： 117 0093 ESI-MS(m/z) ： 340M+1+； 338M-1- 0094 1H-NMR(500MHz， DMSO) ： 1.837(4H， s， -CH 2-CH2-)， 2.824 2.843(4H， t， J 6Hz， (CH2)2N-)， 3.986(2H， s， -CH2N)， 6.180(1H， d， J 9Hz， H3)， 6.818 6.836(2H， m， H5， H6)， 7.6。
37、54 7.732(4H， m， H2 ， 3 ， 5 ， 6 )， 8.000(1H， d， J 9Hz， H2) 0095 13C-NMR(500MHz， DMSO) ： 190.20， 172.54， 171.03， 164.57， 160.48， 143.31， 132.02， 131.39， 126.43， 118.10， 116.28， 110.64， ， 110.51， 107.10， 53.34， 50.31， 23.54. 0096 实施例 11 0097 含氮原子侧链的异甘草素衍生物抗肿瘤活性实验 0098 (1) 含氮原子侧链的异甘草素衍生物体外抗肿瘤活性实验， 具体实验步。
38、骤如下 ： 0099 分别取处于指数生长期的肿瘤细胞， 用含有 10胎牛血清的 RPMI1640 培养液 稀释成 20000 个细胞 /mL。 0100 96 孔板每孔中加入 200L 细胞悬液， 置于 37、 5 CO2培养箱中培养 24h。 0101 将药物用二甲基亚砜溶解， 每孔中加入设定浓度药物， 稀释至需要的工作浓度， 用 RPMI1640 细胞维持稀释， 同时以异甘草素为阳性对照。 0102 置于 37、 5 CO2培养箱中培养 72h。 0103 MTT ： 用无血清 RPMI1640 培养液配成 5mg/mL 溶液， 每孔中加入 20L， 置于 37、 5 CO2孵箱中孵育 4。
39、h。 0104 吸出上清， 用培养液洗三次加入 100L 二甲基亚砜溶解沉淀物， 用振荡器摇匀 测定 OD570 值。 0105 按下列公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率 ： 0106 公式 ： 肿瘤细胞生长抑制率 (1- 实验组 OD/ 对照组 OD)100 说 明 书 CN 101648883 B 11 10/10 页 12 0107 根据72h的实验数据， 由OD值计算生长抑制率， 进而计算出半数抑制浓度IC50值。 0108 含氮原子侧链的异甘草素衍生物对肿瘤细胞 PC-3、 MCF-7、 HO-4980 的体外 0109 半数抑制浓度 0110 0111 (2) 含氮原子侧链的异甘草素衍。
40、生物体内抗肿瘤活性实验， 具体实验步骤如下 ： 0112 试验用小鼠随机分为对照组 ( 生理盐水 200ml/kg)、 异甘草素 (40mg/kg)、 衍生物 高剂量组 (180mg/kg)、 衍生物低剂量组 (90mg/kg)， 异甘草素作为阳性对照药品。选取移植 肿瘤 7 天、 肿瘤生长良好、 腹部隆起明显的小鼠， 腹部皮肤消毒， 用一次性无毒采血器经腹 壁刺入腹腔， 抽取腹水， 放入无菌烧杯中以生理盐水稀释成体积比为 1 3 的癌细胞混悬 液， 于每只小鼠右腋下接种 0.2ml， 各组动物与接种肿瘤次日开始给药， 每日一次， 连续给药 10天。 给药结束后， 将动物称重处死， 剥离肿块称重， 比较各组肿瘤生长情况， 其中各组动物 初始数目为 10 只， 表中所列动物数均为去除死亡动物后剩余的数目。对 S180 的肿瘤抑制 率具体结果见下表 ： 0113 含氮原子侧链的异甘草素衍生物对肿瘤细胞 S180 的体内抑制率 0114 0115 本发明的化合物具有较明显的体内肿瘤抑制作用， 且其肿瘤抑制率均大于异甘草 素， 细胞毒低于异甘草素， 并且水溶性好， 具有被开发成新药的潜力。 说 明 书 CN 101648883 B 12 。