技术领域
本发明涉及一种用于从源自血液的样品中对肿瘤细胞进行浓缩分离的循 环肿瘤细胞浓缩分离设备。更详细而言，本发明涉及一种能够利用比重差在 离心分离后于肿瘤细胞和其它的血液细胞之间由细胞分离剂形成隔壁的循环 肿瘤细胞浓缩分离设备及分离方法。
背景技术
所谓循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells：CTC)是从原发性肿瘤组织或 转移性肿瘤组织中游离，并浸润到血中，由此分布在外周血中的癌细胞。这 样的循环肿瘤细胞与癌的转移性密切相关。因此，循环肿瘤细胞的检测及其 动态的观察等备受关注。
另一方面，认为循环肿瘤细胞仅以极微量存在于血液中。因此，为了检 测循环肿瘤细胞或者观察循环肿瘤细胞的动态，需要将血液中存在的循环肿 瘤细胞浓缩分离至可观察的浓度。目前，作为血液样品中的循环肿瘤细胞的 浓缩分离方法，提出了各种方法。例如已知为了除去血液细胞即红血球，在 血样品整体中添加溶血剂的方法。然而，存在未发生溶血从而残留的红血球 较多这样的问题。另外，存在无法除去白血球这样的问题。此外，存在若在 源自血液的样品中添加大量的溶血剂则对目标肿瘤细胞的创伤较大这样的问 题。
在下述的专利文献1中，公开有一种使磁珠相对于循环肿瘤细胞上所表 达的上皮细胞粘附分子(EpCAM)反应，将肿瘤细胞与其它的细胞磁分选，选 择性地回收肿瘤细胞的方法。在下述的专利文献2中，公开有一种使用血球 分离过滤器根据细胞的大小分选肿瘤细胞的方法。在下述的非专利文献1中， 记载有一种使用了比重调整为1.077g/mL的分离剂商品的密度梯度离心法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2012-022002号公报
专利文献2：日本特开2013-042689号公报
非专利文献
非专利文献1：GEHealthcareBio-SciencesAB“Instructions71-7167-00AG Ficoll-PaquePLUS”
发明内容
发明所要解决的技术问题
在专利文献1中记载的方法中，只能够检测到源自上皮细胞的肿瘤细胞。 因此，存在肿瘤细胞的回收率较低这样的问题。另外，需要磁标记抗体及磁 石等，操作方法繁杂。此外，检查需要很长时间。
在专利文献2中记载的方法中，由于存在无法用血液分离过滤器回收的 肿瘤细胞，因此，肿瘤细胞的回收率依然较低。此外，有可能无法进行准确 的浓缩分离。
在非专利文献1中记载的方法中，在白血球由分离剂的表面扩散至下方 的情况下，有时比重局部地减少。因此，以免干扰与分离剂的界面，必须载 置血液样品。因此，操作繁杂。另外，肿瘤细胞的回收也需要谨慎的操作。 此外，肿瘤细胞层和分离介质的界面不明确。因此，肿瘤细胞的回收率较低。
本发明的目的在于，提供一种能够解除上述的现有技术的缺点，以简便 的操作、高回收率，而且，在不提高相对于细胞的创伤性的情况下，对源自 血液的样品中的循环肿瘤细胞进行浓缩分离的循环肿瘤细胞浓缩分离设备及 循环肿瘤细胞的浓缩分离方法。
用于解决技术问题的方案
本发明人等鉴于上述技术问题发现：通过使用具备特定比重的具有触变 性的细胞分离剂能够解决上述技术问题。即，本发明为一种循环肿瘤细胞浓 缩分离设备，其用于对源自血液的样品中存在的循环肿瘤细胞进行浓缩分离， 其具备：有底的管状容器，其一端封闭，另一端开口；具有触变性的细胞分 离剂，其被收纳于上述管状容器内，上述触变性能够在离心分离后，使肿瘤 细胞与上述肿瘤细胞以外的血液细胞分离，上述细胞分离剂的比重在1.050～ 1.080的范围内
在本发明的设备的某一特定方式中，上述细胞分离剂的比重在 1.055～1.080的范围内。
在本发明的设备的另一特定的方式中，上述细胞分离剂的比重在 1.065～1.077的范围内。
在本发明的设备的另一特定方式中，上述细胞分离剂含有数均分子量700 以上的聚亚烷基二醇作为触变性赋予剂，且该聚亚烷基二醇以细胞分离剂整 体的5重量％以下的浓度进行配合。
在本发明的设备的某一特定方式中，还含有收纳于上述管状容器内的抗 血液凝固剂。
在本发明的设备的另一特定方式中，上述循环肿瘤细胞浓缩分离设备还 含有细胞凝聚药剂，其使上述肿瘤细胞以外的血液细胞彼此选择性地凝聚并 通过离心分离操作而沉淀。
在本发明的设备的另一特定方式中，上述细胞凝聚药剂是使血球细胞选 择性地凝聚的细胞凝聚药剂。
在本发明的设备的另一特定方式中，上述细胞凝聚药剂是具有形成免疫 复合体的能力的抗体。
在本发明的设备的另一特定方式中，上述细胞凝聚药剂的抗体具备与白 血球表面上特有的抗原结合的抗原识别部位和与红血球表面上特有的抗原结 合的抗原识别部位这两者。
在本发明的设备的另一特定方式中，添加有上述细胞凝聚药剂，上述细 胞凝聚药剂的添加量相对于源自血液的样品1mL为25～150μL。
在本发明的设备的另一特定方式中，上述有底的管状容器的上述开口由 栓体密封，且其内部进行了减压，构成所述栓体的至少一部分能够被刺穿。
另外，本发明的循环肿瘤细胞的浓缩分离方法包括下述的各工序。
(1)在收纳有细胞分离剂且一端封闭且另一端开口的有底管状容器内，使 源自血液的样品、细胞凝聚药剂以及抗血液凝固剂共存的工序，所述细胞分 离剂的比重在1.050～1.080的范围内且通过离心分离操作能够使上述肿瘤细胞 与上述肿瘤细胞以外的血液细胞分离，所述细胞凝药剂用于使肿瘤细胞以外 的血液细胞彼此选择性地凝聚且通过离心分离操作而沉淀；
(2)使该细胞凝聚药剂和该源自血液的样品在该容器内进行反应的工序；
(3)对该容器进行离心分离，从而在该肿瘤细胞和该其它血液细胞之间由 细胞分离剂形成隔壁的工序；
(4)对被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的该肿瘤细胞进行回收的工序。
发明的效果
根据本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备及浓缩分离方法，能够以简便 的操作且高回收率，以及在不提高对细胞的创伤性的情况下，对源自血液的 样品中的循环肿瘤细胞进行浓缩分离。因此，能够高效地从源自血液的样品 中回收循环肿瘤细胞。
在本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备中，如上所述，由于能够以高纯 度回收源自血液的样品中极微量存在的肿瘤细胞，因此例如能够谋求使用浓 缩分离的样品利用流式细胞仪检测肿瘤细胞时的检测效率及检测精度的提 高。或者，能够在显微镜下高效且高精度地实施对浓缩分离的肿瘤细胞进行 细胞学分析的操作。并且，能够以简便的操作且高回收率且高纯度回收肿瘤 细胞，由此，认为能够贡献于高效的新颖肿瘤治疗药物的开发以及新的治疗 上及诊断上的靶标的发现。
附图说明
图1是示出本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备的一个结构例的示意性 的正面剖视图。
标记说明
1…循环肿瘤细胞浓缩分离设备
2…容器主体
3…细胞分离剂
具体实施方式
下面，通过对本发明的具体的实施方式进行说明来明确本发明。本发明 所提供的设备为对源自血液的样品中存在的极微量的肿瘤细胞进行浓缩分离 的设备，该循环肿瘤细胞浓缩分离设备的特征在于，在一端封闭，另一端开 口的有底的管状容器中收纳具有触变性的细胞分离剂，该细胞分离剂具有该 肿瘤细胞和其它的血液细胞的中间比重，从而能够通过离心分离操作使两者 分离。
(血液细胞)
本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备能够使用后面说明的细胞凝聚药剂 除去源自血液的样品中所含的血液细胞。本说明书中的血液细胞表示除期望 的肿瘤细胞以外的、存在于源自血液的样品中的血液细胞，例如可以举出： 血球细胞、血小板细胞，可更详细地举出：红血球、B细胞、T细胞、单核细 胞、NK细胞、颗粒细胞等，但并不限定于此。
(循环肿瘤细胞的比重及其它的血液细胞的比重)
循环肿瘤细胞的比重取决于肿瘤细胞的种类，但通常为1.040～1.065左 右。另一方面，红血球的比重为1.095，白血球的比重为1.063～1.085左右。 因此，循环肿瘤细胞以外的细胞的比重通常在1.063～1.095的范围。
(源自血液的样品)
在本说明书中的源自血液的样品中，直接使用采自被试验者的全血试样， 此外，同样地还包括例如为了保持血液的性质或者出于创造在肿瘤细胞的分 离浓缩中有利的环境等目的，添加了各种药剂的物质。
作为源自血液的样品中所添加的药剂，可以举出：葡萄糖、麦芽糖等糖 类、柠檬酸钠等，但并不限定于此。另外，后述的抗血液凝固剂可以采取预 先包含在源自血液的样品中的构成。
(细胞分离剂)
本发明提供一种将具有触变性的细胞分离剂收纳在一端封闭，另一端开 口的有底的管状容器中而成的设备，由此解决上述技术问题。
如上所述，在本发明中，细胞分离剂的比重需要设为循环肿瘤细胞的比 重和循环肿瘤细胞以外的血液细胞的比重之间的值。由此，在离心分离操作 后，能够在循环肿瘤细胞和其它的血液细胞之间可靠地形成隔壁。
但是，通常具有触变性的细胞分离剂随着比重升高流动敏感性因离心力 而降低，因此，通常所使用的血清或者血浆用的分离剂制备成比重 1.040～1.055。
本发明中的细胞分离剂的比重在1.050～1.080的范围内。因此，能够对肿 瘤细胞和其它的血液细胞进行分离。优选该比重在1.055～1.080的范围内，更 优选在1.065～1.077的范围内。进一步优选该比重在1.070～1.077的范围内。 若在这样的比重范围，则能够更加可靠地对循环肿瘤细胞和其它的血液细胞 进行分离。
但是，若比重范围升高，则有可能细胞分离剂的流动性降低。因此，优 选添加后述的触变性增强剂。作为触变性增强剂，如后所述，可以优选使用 数均分子量700以上的聚亚烷基二醇。通过添加这样的触变性增强剂，在离 心分离后能够在肿瘤细胞和其它的血液细胞之间更加可靠地形成强度充分的 隔壁。
本发明的细胞分离剂没有特别限定，优选含有液体成分和无机粉末。通 过组合液体成分和无机粉末，能够容易地实现上述的比重范围。无机粉末的 表面可以为亲水性，或者无机粉末的表面可以为疏水性。另外，作为上述无 机粉末，可以组合使用表面为亲水性的无机粉末和表面为疏水性的无机粉末。
在本发明中的细胞分离剂中，作为上述液体成分，没有特别限定，只要 使用聚硅氧烷类、α-烯烃-富马酸二酯共聚物类、丙烯酸类、聚酯类、癸二酸 和2,2-二甲基-1,3-丙二醇和1,2-丙二醇的共聚物类、聚醚聚氨酯类、聚醚酯类 等液体树脂、聚-α-蒎烯聚合物和氯代烃的液体混合物类、氯化聚丁烯和环氧 化动植物油等液体化合物的液体混合物类、三氟氯化乙烯及苯多羧酸烷基酯 衍生物等和聚氧亚烷基二醇等液体混合物类、环戊二烯低聚物和邻苯二甲酸 酯等液体混合物类等液/液或者固/液混合物这样的在常温下为液体的现有公 知的物质即可。
另外，上述无机粉末没有特别限制，可以使用选自利用公知的气相法(也 称为干式法)或者沉淀法所制造的包含二氧化硅或由膨润土、蒙脱石等的粘土 矿物等二氧化硅类、或者氧化钛类、氧化铝类等微粉末中的一种，或者混合 使用两种以上。
另外，在本发明中，就上述无机粉末而言，表面可以具有亲水性，也可 以具有疏水性。另外，可以组合使用表面为疏水性的无机粉末和表面为亲水 性的无机粉末。
在本发明中，作为上述无机粉末，可以优选使用二氧化硅类粉末或者氧 化钛类粉末，也可以组合使用这两者。
在二氧化硅类粉末中，作为亲水性的二氧化硅，可以获得并容易使用下 列气相法亲水性二氧化硅，例如：AEROSIL(注册商标)90G、AEROSIL130、 AEROSIL200、AEROSIL300等AEROSIL系列(日本AEROSIL公司制造)、 REOLOSIL(注册商标)QS-10、REOLOSILQS-20、REOLOSILQS-30等 REOLOSIL系列(Tokuyama公司制造)、WACKERHDKS13、WACKERHDK N20、WACKERHDKT30等WACKERHDK系列(旭化成Wacker-silicone公 司(旭化成ワッカーシリコン社)制造)等。
另外，作为疏水性二氧化硅，可以获得并容易使用下列气相法疏水性二 氧化硅，例如：AEROSILR972、AEROSILR974、AEROSILR805、AEROSIL R812等AEROSIL系列(日本AEROSIL公司制造)、REOLOSILMT-10、 REOLOSILDM-30S、REOLOSILHM-30S、REOLOSILKS-20S、REOLOSIL PM-20等REOLOSIL系列(Tokuyama公司制造)、WACKERHDKH15、 WACKERHDKH18、WACKERHDKH30等WACKERHDK系列(旭化成 Wacker-silicone公司(旭化成ワッカーシリコン社)制造)等。
在本发明中，优选还添加触变性增强剂。作为这样的触变性增强剂，只 要可提高触变性就没有特别限定，可优选使用聚亚烷基二醇。可更优选使用 对碳原子数为2～4的环氧烷烃单体的一种或量种以上进行聚合而得到的聚合 物。进一步优选为对碳原子数为3或4的环氧烷烃单体的一种或两种以上进 行聚合而得到的聚合物，可使用数均分子量700以上的聚亚烷基二醇。通过 这样的触变性增强剂的添加可在离心分离后更加可靠地形成隔壁，且可以形 成强度充分的隔壁。
在本发明的细胞分离剂中，上述特定的聚亚烷基二醇可以单独使用一种， 也可以配合两种以上。
在本发明中所使用的聚亚烷基二醇中，若分子内过量地含有碳原子数为2 的乙二醇单体的聚合成分，则水溶性增大，故不优选，可优选使用戴维斯法 的HLB值为16以下的物质。需要说明的是，所谓戴维斯法的HLB值，由下 述式算出。
<HLB值＝7+亲水基的基数的总和-亲油基的基数的总和>
需要说明的是，所谓基数为各官能团所确定的固有的数值。
另外，根据源自起始物质醇类的官能团数的羟基数或者有无基于该羟基 的烷基等的封端处理等，可任意使用具有数量为1或者大于1的羟基的聚亚 烷基二醇。为了降低水溶性，更优选每1分子的羟基数为3个以下。
另外，在上述聚亚烷基二醇的分子内，可以含有羟基的封端目的以外所 引入的疏水性残基。作为这样的疏水性残基，可以举出：亚烷基、链烯烃基、 链炔烃基、芳香环基、二甲基硅氧烷类取代基等。
另外，可以代替上述羟基或者追加含有羰基、氨基或巯基等氢键合性极 性基团。在这样的情况下，为了降低水溶性，也更优选每1分子的极性基团 的数量为3个以下。
若聚亚烷基二醇的数均分子量小于700，则有时在离心分离后所形成的隔 壁上产生龟裂。其结果，可能血球细胞和肿瘤细胞混合使肿瘤细胞的纯度降 低。因此，数均分子量优选为700以上。在具有2个以上的羟基的聚亚烷基 二醇的情况下，数均分子量更优选为1000以上。需要说明的是，上述聚亚烷 基二醇的数均分子量的上限值没有特别限定，但优选为100,000以下。若超过 100,000，则有时羟基密度减小而不发挥作为触变性增强剂的作用。
上述聚亚烷基二醇的浓度优选为血液分离剂整体的5重量％以下。通过 调整为5重量％以下可以更加容易地将细胞分离剂调整为优选的粘度范围。 更优选为3重量％以下，进一步优选为2重量％以下。另外，上述聚亚烷基二 醇的浓度的优选下限为0.1重量％。通过调整为0.1重量％以上，将细胞分离 剂的粘度范围调整为优选的范围变得更加容易。
作为上述特定的聚亚烷基二醇的具体例，可以举出以下的各种聚亚烷基 二醇。但是，并不限定于下述例示的物质。
作为具有数量大于1的末端羟基的聚亚烷基二醇，例如可以举出：聚丁 二醇(日油公司制造、PB-700、PB-1000、PB-2000等UNIOL(注册商标)PB系 列)、聚丙二醇(日油公司制造、D-700、D-1200、D-4000等UNIOLD系列)、 聚氧丙烯甘油醚(日油公司制造、TG-1000、TG-3000、TG-4000等UNIOLTG 系列)、聚氧丙烯山梨糖醇(日油公司制造、HS-1600D等UNIOLHS系列)、聚 丝氨酸(日油公司制造、DCB-1000、DCB-2000、DCB-4000等聚丝氨酸DCB 系列、及DC-1100、DC-1800E、DC-3000E等聚丝氨酸DC系列)、聚氧丙烯 二甘油醚(日油公司制造、DGP-700等UNILUB(注册商标)系列)、聚氧丙烯甘 油醚(旭硝子公司制造、S3003、S3006、S3011等Preminol系列)、聚丙二醇(旭 硝子公司制造、S4001、S4006、S4011、S4015等Preminol(注册商标)系列)、 聚氧乙烯聚氧丙二醇(三洋化成工业公司制造、PE-34、PE-61、PE-62、PE-64、 PE-71、PE-74等Nieuport(注册商标)PE系列)、聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚 (ADEKA公司制造、AM-502等ADEKA聚醚)。
作为具有1个末端羟基的聚亚烷基二醇，例如可以举出：聚氧丙烯丁醚(日 油公司制造、MB-7、MB-14、MB-38、MB-700等UNILUBMB系列)、聚氧 丙二醇单醚(三洋化成公司制造、LB-285、LB-625、LB-3000、LB-1800X等 NieuportLB系列)、聚氧丙烯烷基醚(旭硝子公司制造、S1004F、S1005等 Preminol系列)。
在本发明的细胞分离剂中，可以在能够维持作为细胞分离剂的性能的范 围内进一步配合相容剂、抗氧化剂等添加剂。
本发明的细胞分离剂的比重调整为1.050～1.080。本发明的细胞分离剂的 比重优选调整为1.055～1.080，更优选调整为1.065～1.077。在将比重设为低于 1.055的情况下，有时低于肿瘤细胞的比重或者期望的肿瘤细胞的回收率降 低。另一方面，若使比重高于1.080，则有时由于接近于不期望的肿瘤细胞以 外的血液细胞特别是血球细胞的比重，因此，离心分离时的细胞分离剂的流 动性降低，从而无法在肿瘤细胞和其它的血液细胞之间形成隔壁。
(抗血液凝固剂)
在本发明的肿瘤细胞浓缩分离设备中，可以根据需要添加抗血液凝固剂。 该抗血液凝固剂只要采取在后面说明的细胞凝聚药剂和源自血液的样品的反 应时两者共存的形态即可。即，该抗血液凝固剂可以采取预先被收纳在上述 容器内的形态，另外，也可以采取预先另行添加到源自血液的样品中的形态。 在采用预先被收纳在上述容器内的形态的情况下，可以采取涂布在容器内壁 面的形态或制成颗粒状、片状等易于溶解于源自血液的样品中的形状收纳在 容器内的形态。
作为本发明中所使用的抗血液凝固剂，没有特别限定，可以使用柠檬酸、 肝素、EDTA等公知的抗血液凝固剂。
(细胞凝聚药剂)
本发明的肿瘤细胞浓缩分离设备根据需要含有细胞凝聚药剂。所谓本发 明中的细胞凝聚药剂是指：选择性地使期望的肿瘤细胞以外的血液细胞凝聚， 通过使用了比重差的离心分离操作，使其变得容易沉淀、分离，由此，能够 提高该肿瘤细胞的纯度的药剂。因此，只要为具有这样的作用机理的药剂就 可应用公知的药剂，可优选使用具备与白血球表面上特有的抗原结合的抗原 识别部位和与红血球表面上特有的抗原结合的抗原识别部位这两者的抗体 (RosetteSephumanCD45depletioncocktail、STEMCELLTechnologies公司制 造)。
另外，作为具有其它凝聚方法的药剂，可以使用将能够与白血球表面上 特有的抗原结合的抗原识别部位与比重较大的载体物理结合或者化学结合而 成的药剂、使血球细胞微球等物理吸附于不溶性载体的药剂。
(细胞分离剂的制造方法)
本发明的细胞分离剂的制造方法可以使用现有公知的方法，没有特别限 定。即，只要将上述液体成分、上述无机粉末及上述特定的聚亚烷基二醇以 适宜的方法混合即可。混合方法没有特别限定，可以举出使用了行星式混合 器、开放式炼胶机、均质机等公知的混炼机的方法。
(循环肿瘤细胞浓缩分离设备)
本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备具备容器主体和被收纳在容器主体 内且上述本发明的细胞分离剂、以及根据需要添加的抗血液凝固剂及细胞凝 聚药剂作为构成要素。作为该容器主体，没有特别限定，以广泛用作采血管 的有底的管状容器为代表，可以使用试验管、离心管、微管等任意的可进行 离心分离的有底的管状容器。
图1是示出这样的循环肿瘤细胞浓缩分离设备的一种结构例子的示意性 的正面剖视图。循环肿瘤细胞浓缩分离设备1具有由有底的管状容器构成的 容器主体2。该容器主体2内收纳有细胞分离剂3。
上述有底的管状容器的开口的一端由栓体密封，且该容器的内部可以进 行减压，构成所述栓体的至少一部分能够被刺穿。另外，关于上述容器主体 的材质，只要可耐受离心分离即可，没有特别限定，可以使用合成树脂及玻 璃等任意的材料。
就容器主体及栓体而言，为了分别起到防止血块附着等效果，可以实施 内部表面处理。
另外，细胞分离剂的添加量通常优选该容器每1根添加0.3g～3.0g左右， 但可以根据使用的容器的容积及形状选择最佳的添加量。
另外，就本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备而言，上述细胞凝聚药剂 优选收纳在容器中，并使其添加量相对于源自血液的样品1mL为25～150μL。 由此，可以按照本发明更加有效地分离肿瘤细胞和肿瘤细胞以外的血液细胞。
另外，在本发明中，包括使用用于将源自血液的样品中的循环肿瘤细胞 浓缩分离的循环肿瘤细胞浓缩分离设备。本发明使用一种用于将源自血液的 样品中存在的循环肿瘤细胞浓缩分离的设备，其具备：具有触变性的细胞分 离剂，其被收纳于所述管状容器内，所述触变性能够在离心分离后，使肿瘤 细胞与所述肿瘤细胞以外的血液细胞分离，所述细胞分离剂的比重在1.050～ 1.080的范围内。
如上所述，通过使用本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，可实现源自 血液的样品中的肿瘤细胞的浓缩分离方法。使用了本发明的循环肿瘤细胞浓 缩分离设备的源自血液的样品中的肿瘤细胞的浓缩分离方法具备以下的工 序。
(使用循环肿瘤细胞浓缩分离设备的源自血液的样品中的循环肿瘤细胞 的浓缩分离方法)
(1)在收纳有细胞分离剂且一端封闭且另一端开口的有底管状容器内，使 源自血液的样品、细胞凝聚药剂以及抗血液凝固剂共存的工序，上述细胞分 离剂的比重在1.050～1.080的范围内且通过离心分离操作能够使上述肿瘤细 胞与上述肿瘤细胞以外的血液细胞分离，上述细胞凝药剂用于使肿瘤细胞以 外的血液细胞彼此选择性地凝聚且通过离心分离操作而沉淀；
(2)使该细胞凝聚药剂和该源自血液的样品在该容器内进行反应的工序；
(3)对该容器进行离心分离，从而在该肿瘤细胞和该其它血液细胞之间由 细胞分离剂形成隔壁的工序；
(4)对被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的该肿瘤细胞进行回收的工序。
涉及设备的详细内容如上所述，接触了本说明书的本领域技术人员可以 参照说明书的记载适宜地进行变更等，实施本发明的源自血液的样品中的循 环肿瘤细胞的浓缩分离方法。
使用本发明中的设备所浓缩分离的循环肿瘤细胞可以在使用检测试剂标 记后采用流式细胞术等方法计数、分析。作为检测试剂，可以举出例如：含 有识别循环肿瘤细胞的表面上表达的特有的抗原的抗体的试剂、含有感染肿 瘤细胞而以肿瘤细胞特有的端粒酶活性反应增殖并发出荧光的病毒的试剂 等。
通过使用本发明的设备能够以高纯度回收肿瘤细胞，因此，期待利用流 式细胞仪的肿瘤细胞的检测效率及检测精度的提高。
实施例
下面，举出本发明的具体的实施例及比较例，由此明确本发明。需要说 明的是，本发明并不限定于以下的实施例。
[实施例1～12及比较例1～2]
(实施例1～12及比较例1～2中使用的物质)
1)液体成分
液体成分1：丙烯酸酯聚合物(比重1.032、25℃下的粘度＝65Pa·s)
粘度的测定利用流变仪DV-III(Brookfield公司制造)进行。
2)无机粉末
作为无机粉末，组合使用疏水性二氧化硅(日本AEROSIL公司制造、 AEROSILR974、粒径：约12nm、比表面积：约170m2/g、将表面用CH3基 化学处理而成为疏水性)和氧化钛(石原产业公司制造、TIPAQUEA-100、粒径 0.15μm)。
3)聚亚烷基二醇
准备下述的表1所示的聚亚烷基二醇作为触变性增强剂1～3。
增强剂1：聚氧丙烯甘油醚(旭硝子公司制造、PreminolS3011)
增强剂2：聚丁二醇(日油公司制造、UNIOLPB700)
增强剂3：聚氧丙烯甘油醚(ADEKA公司制造、ADEKA聚醚G300)
[表1]
物质名称 商品名 Mn HLB(戴维斯法) 增强剂1 聚氧丙烯甘油醚 S3011 10,000 -13 增强剂2 聚丁二醇 PB700 700 5 增强剂3 聚氧丙烯甘油醚 G300 350 12
(细胞分离剂的制作)
(实施例1)
如下述的表2所示，配合下述物质，使得含有94.9重量％的液体成分1、 上述混合物即无机粉末共4.6重量％、0.5重量％的作为聚亚烷基二醇的表1 示出的触变性增强剂1，在室温下使用行星式混合器搅拌混合，制作细胞分离 剂。
(实施例2～12及比较例1～2)
如下述的表2所示，变更使用的材料及配合比例，除此以外，与实施例1 同样地制作细胞分离剂。需要说明的是，在实施例11中，不使用聚亚烷基二 醇。在实施例12中，使用数均分子量350的触变性增强剂3。在比较例1中， 将细胞分离剂的比重调整为1.045。在比较例2中，将细胞分离剂的比重调整 为1.085。
[表2]
(循环肿瘤细胞浓缩分离设备的制作)
准备15mL容量的锥形管(BD公司制造)，在各管中收纳实施例1～12及比 较例1～2的细胞分离剂各约1.8g，由此，制作循环肿瘤细胞浓缩分离设备。
(评价)
以下的评价使用如下得到的拟患者血进行：在利用EDTA进行了抗凝固 处理的健康人血中添加结肠腺癌培养细胞(DLD-1)，使其成为50个/血液1mL。
1)细胞分离剂的流动性评价
在循环肿瘤细胞浓缩分离设备3根中注入拟患者血各2mL后，在 1200g×20分/室温的条件下进行离心分离。在基于细胞分离剂的隔壁的平均厚 度为5mm以上的情况下，标记为○，在2mm以上且低于5mm的厚度的情况 下，标记为△，在低于2mm的厚度的情况下，标记为×。将结果示于下述的 表3。
2)隔壁强度
将离心分离后的循环肿瘤细胞浓缩分离设备倾斜，以60Hz给予1小时的 振动。在隔壁不移动的情况下，标记为○，在移动但保持隔壁的情况下，标记 为△，在隔壁崩塌与血球细胞混合的情况下，标记为×。将结果示于下述的表 3。
3)隔壁形成状态评价
利用目视对离心分离后所形成的隔壁的状态以及有无油状浮游物及油膜 进行观察。将结果示于下述的表3。在表3中，在隔壁产生龟裂的情况下，标 记为“龟裂”。另外，在产生油状浮游物或油膜的情况下，记载为“△油”。在这 些情况均未观察到的情况下，标记为○。
4)肿瘤细胞回收率
将离心分离后被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的肿瘤细胞通过吸液回 收。DLD-1为上皮类的细胞，因此，在回收的悬浮液中添加CD326-FITC抗 体(Miltenyi公司制造)进行荧光标记。另外，将残留的不期望的白血球通过 CD45-APC(Miltenyi公司制造)进行荧光标记，利用流式细胞仪(FACSAria、BD 公司制造)，对CD326+/CD45-的细胞数进行测量，算出相对于拟患者血中所 含的肿瘤细胞数100个的回收率。将结果示于表3。
[表3]
由表3可知，在实施例1～9中，细胞分离剂的流动性、隔壁强度、隔壁 形成状态、肿瘤细胞回收率均显示良好的结果。另外，在实施例10中，在隔 壁形成状态的观察中，产生油状浮游物或油膜，隔壁强度很低，但能够与实 施例1～9同样地高回收率回收肿瘤细胞。在实施例10中，认为由于添加聚氧 亚烷基二醇多达10重量％，因此产生上述油状浮游物或油膜。
相对于此，在未添加聚亚烷基二醇的实施例11中，无法得到充分的触变 性而无法得到充分的隔壁强度，但肿瘤细胞回收率良好。
在使用了平均分子量350的聚亚烷基二醇的实施例12中，肿瘤细胞回收 率良好，但在离心分离后的隔壁上产生龟裂。认为即使使用平均分子量350 的聚亚烷基二醇，也与实施例11同样地无法充分地提高触变性，因此无法形 成强度充分的隔壁。然而，在实施例12中，认为无法形成强度充分的隔壁， 但与实施例11同样地肿瘤细胞回收率良好。
需要说明的是，在无法得到充分的隔壁强度或隔壁上产生龟裂的情况下， 可能产生通过分离剂所分离的血球或肿瘤细胞的漏出。因此，有可能对肿瘤 细胞的回收率造成影响或在含有所回收的肿瘤细胞的液相中混有血球。
在将细胞分离剂的比重调整为1.045的比较例1中，流动性、隔壁强度、 隔壁状态良好，但肿瘤细胞的回收率低至39％。在将细胞分离剂的比重调整 为1.085的比较例2中，即使进行离心分离也无法形成隔壁。
因此，细胞分离剂的比重优选调整为1.055～1.080。并且，由于能够以更 高的回收率得到肿瘤细胞且使细胞分离剂的流动性提高，因此细胞分离剂的 比重优选调整为1.065～1.077。
[实施例13～18]
对源自血液的样品和细胞凝聚药剂共存的下述的实施例13～18进行说 明。
需要说明的是，在以下的评价中，使用与实施例3相同的循环肿瘤细胞 浓缩分离设备及拟患者血。
(实施例13)
使用RosetteSephumanCD45depletioncocktail(STEMCELLTechnologies 公司制造)作为细胞凝聚药剂。在以EDTA抗凝固处理后的拟患者血2mL中 添加细胞凝聚药剂10μL(5μL/血液1mL)并进行摇动混合，在室温下静置20分 钟后，在1200G×20分/室温的条件下进行离心分离。
将离心分离后被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的肿瘤细胞通过吸液回 收。在回收的悬浮液中通过CD326-FITC抗体(Miltenyi公司制造)及 CD45-APC(Miltenyi公司制造)进行荧光标记，利用流式细胞仪(FACSAria、BD 公司制造)对CD326+/CD45-的细胞数及总细胞数进行测量，算出相对于拟患 者血中所含的肿瘤细胞数100个的回收率及残留的不期望的肿瘤细胞以外的 血液细胞数。将结果示于表3。
(实施例14～18)
如下述的表4所示变更细胞凝聚药剂的添加量，除此以外，与实施例13 同样地进行评价。将结果示于表4。需要说明的是，表中的细胞凝聚药剂的添 加量及肿瘤细胞以外的血液细胞数换算为源自血液的样品每1mL而示出。
[表4]
由表4可知，随着细胞凝聚药剂相对于源自血液的样品1mL的添加量增 加，肿瘤细胞以外的血液细胞数减少。相对于源自血液的样品1mL添加细胞 凝聚药剂25μL以上，由此，肿瘤细胞以外的血液细胞数的残留数显著减少。 因此，细胞凝聚药剂的添加量优选相对于源自血液的样品1mL为25μL以上。
另一方面，在实施例13～17中，随着细胞凝聚药剂的添加量增加，肿瘤 细胞以外的血液细胞数依次减少。但是，在实施例18中，残留数稍微显示上 升倾向。因此，细胞凝聚药剂的添加量优选相对于源自血液的样品1mL设为 150μ以下。
因此，细胞凝聚药剂的添加量优选相对于源自血液的样品1mL调整为 25μL～150μL。
另外，由表4的结果可知，相对于源自血液的样品1mL中的约 5,300,000,000个血液细胞，使用内包细胞分离剂的肿瘤细胞浓缩分离设备， 由此，能够容易地除去源自血液的样品中的肿瘤细胞以外的血液细胞至约 2,000分之1。另外，将源自血液的样品中的细胞凝聚试剂设为优选的添加量 范围25μL～150μL，由此，能够容易地除去肿瘤细胞以外的血液细胞数至约 50,000分之1。在这样的情况下，肿瘤细胞的回收率也较高。
高纯度回收源自血液的样品中仅极微量存在的肿瘤细胞，由此，认为期 待利用流式细胞仪的肿瘤细胞的检测效率及检测精度的提高或者可高效且高 精度地实施显微镜下细胞学分析肿瘤细胞的操作。并且，本发明的肿瘤细胞 浓缩设备能够以简便的操作来高回收率且高纯度地回收肿瘤细胞，因此，认 为对开发新且有效的肿瘤治疗药物有贡献，另外，可以帮助发现新的治疗上 及诊断上的靶标。