循环肿瘤细胞浓缩分离设备及循环肿瘤细胞的浓缩分离方法.pdf

1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201480053961.7 (22)申请日 2014.09.30 2013-203613 2013.09.30 JP C12M 1/26(2006.01) C12N 5/078(2006.01) C12N 5/09(2006.01) G01N 33/48(2006.01) (71)申请人 积水医疗株式会社 地址 日本东京都 (72)发明人 冈本隆介 井上智雅 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 张涛 (54) 发明名称 循环肿瘤细胞浓缩分离设备及循环肿瘤细胞 的浓缩分离方法 (57) 摘要 本发明提供一种循环

2、肿瘤细胞浓缩分离设 备， 其能够简便且高回收率、 以及对肿瘤细胞微创 地回收源自血液的样品中的循环肿瘤细胞。一种 循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其用于对源自血液 的样品中存在的循环肿瘤细胞进行浓缩分离， 其 中， 在有底的管状容器中收纳具有触变性的细胞 分离剂， 所述管状容器的一端封闭， 另一端开口， 所述细胞分离剂的比重在 1.050 1.080 的范围 内， 能够通过离心分离操作对肿瘤细胞和所述肿 瘤细胞以外的血液细胞进行分离。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2016.03.30 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/JP2014/076004 2014.09

3、.30 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2015/046557 JA 2015.04.02 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书13页 附图1页 CN 105683353 A 2016.06.15 CN 105683353 A 1.一种循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其用于对源自血液的样品中存在的循环肿瘤细胞 进行浓缩分离， 其具备： 有底的管状容器， 其一端封闭， 另一端开口； 具有触变性的细胞分离剂， 其被收纳于所述管状容器内， 所述触变性能够在离心分离 后， 使肿瘤细胞与所述肿瘤细胞以外的血液细胞分离， 所述细胞分离

4、剂的比重在1.0501.080的范围内。 2.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其中， 所述细胞分离剂的比重在1.0551.080的范围内。 3.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其中， 所述细胞分离剂的比重在1.0651.077的范围内。 4.如权利要求13中任一项所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其中， 所述细胞分离 剂含有数均分子量700以上的聚亚烷基二醇作为触变性赋予剂， 且该聚亚烷基二醇以细胞 分离剂整体的5重量以下的浓度进行配合。 5.如权利要求1所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其还含有收纳于所述管状容器内 的抗血液凝固剂。 6.如权利要求15中任一项所述

5、的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其还含有细胞凝聚药 剂， 其使所述肿瘤细胞以外的血液细胞彼此选择性地凝聚并通过离心分离操作而沉淀。 7.如权利要求6所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其中， 所述细胞凝聚药剂是使血球细胞选择性地凝聚的细胞凝聚药剂。 8.如权利要求7所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其中， 所述细胞凝聚药剂是具有形成免疫复合体的能力的抗体。 9.如权利要求8所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其中， 所述细胞凝聚药剂的抗体具备与白血球表面上特有的抗原结合的抗原识别部位和与 红血球表面上特有的抗原结合的抗原识别部位这两者。 10.如权利要求69中任一项所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备，

6、其添加有所述细胞 凝聚药剂， 所述细胞凝聚药剂的添加量相对于源自血液的样品1mL为25150 L。 11.如权利要求110中任一项所述的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其中， 所述有底的管状容器的开口由栓体密封， 并且其内部进行了减压， 构成所述栓体的至 少一部分能够被刺穿。 12.一种源自血液的样品中的循环肿瘤细胞的浓缩分离的方法， 其是对源自血液的样 品中的循环肿瘤细胞进行浓缩分离的方法， 该方法包括： (1)在收纳有细胞分离剂且一端封闭且另一端开口的有底管状容器内， 使源自血液的 样品、 细胞凝聚药剂以及抗血液凝固剂共存的工序， 所述细胞分离剂的比重在1.050 1.080的范围内且通过离心

7、分离操作能够使所述肿瘤细胞与所述肿瘤细胞以外的血液细胞 分离， 所述细胞凝药剂用于使肿瘤细胞以外的血液细胞彼此选择性地凝聚且通过离心分离 操作而沉淀； (2)使该细胞凝聚药剂和该源自血液的样品在该容器内进行反应的工序； (3)对该容器进行离心分离， 从而在该肿瘤细胞和该其它血液细胞之间由细胞分离剂 权利要求书 1/2 页 2 CN 105683353 A 2 形成隔壁的工序； (4)对被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的该肿瘤细胞进行回收的工序。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105683353 A 3 循环肿瘤细胞浓缩分离设备及循环肿瘤细胞的浓缩分离方法 技术领域 0001 本发明涉及一种用于

8、从源自血液的样品中对肿瘤细胞进行浓缩分离的循环肿瘤 细胞浓缩分离设备。 更详细而言， 本发明涉及一种能够利用比重差在离心分离后于肿瘤细 胞和其它的血液细胞之间由细胞分离剂形成隔壁的循环肿瘤细胞浓缩分离设备及分离方 法。 背景技术 0002 所谓循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells： CTC)是从原发性肿瘤组织或转移 性肿瘤组织中游离， 并浸润到血中， 由此分布在外周血中的癌细胞。 这样的循环肿瘤细胞与 癌的转移性密切相关。 因此， 循环肿瘤细胞的检测及其动态的观察等备受关注。 0003 另一方面， 认为循环肿瘤细胞仅以极微量存在于血液中。 因此， 为了检测循环肿瘤 细胞或者

9、观察循环肿瘤细胞的动态， 需要将血液中存在的循环肿瘤细胞浓缩分离至可观察 的浓度。 目前， 作为血液样品中的循环肿瘤细胞的浓缩分离方法， 提出了各种方法。 例如已 知为了除去血液细胞即红血球， 在血样品整体中添加溶血剂的方法。 然而， 存在未发生溶血 从而残留的红血球较多这样的问题。 另外， 存在无法除去白血球这样的问题。 此外， 存在若 在源自血液的样品中添加大量的溶血剂则对目标肿瘤细胞的创伤较大这样的问题。 0004 在下述的专利文献1中， 公开有一种使磁珠相对于循环肿瘤细胞上所表达的上皮 细胞粘附分子(EpCAM)反应， 将肿瘤细胞与其它的细胞磁分选， 选择性地回收肿瘤细胞的方 法。 在

10、下述的专利文献2中， 公开有一种使用血球分离过滤器根据细胞的大小分选肿瘤细胞 的方法。 在下述的非专利文献1中， 记载有一种使用了比重调整为1.077g/mL的分离剂商品 的密度梯度离心法。 0005 现有技术文献 0006 专利文献 0007 专利文献1： 日本特开2012-022002号公报 0008 专利文献2： 日本特开2013-042689号公报 0009 非专利文献 0010 非专利文献1： GEHealthcareBio-SciencesAB “Instructions71-7167-00AG Ficoll-PaquePLUS” 发明内容 0011 发明所要解决的技术问题 001

11、2 在专利文献1中记载的方法中， 只能够检测到源自上皮细胞的肿瘤细胞。 因此， 存 在肿瘤细胞的回收率较低这样的问题。 另外， 需要磁标记抗体及磁石等， 操作方法繁杂。 此 外， 检查需要很长时间。 0013 在专利文献2中记载的方法中， 由于存在无法用血液分离过滤器回收的肿瘤细胞， 因此， 肿瘤细胞的回收率依然较低。 此外， 有可能无法进行准确的浓缩分离。 说明书 1/13 页 4 CN 105683353 A 4 0014 在非专利文献1中记载的方法中， 在白血球由分离剂的表面扩散至下方的情况下， 有时比重局部地减少。 因此， 以免干扰与分离剂的界面， 必须载置血液样品。 因此， 操作繁

12、杂。 另外， 肿瘤细胞的回收也需要谨慎的操作。 此外， 肿瘤细胞层和分离介质的界面不明确。 因此， 肿瘤细胞的回收率较低。 0015 本发明的目的在于， 提供一种能够解除上述的现有技术的缺点， 以简便的操作、 高 回收率， 而且， 在不提高相对于细胞的创伤性的情况下， 对源自血液的样品中的循环肿瘤细 胞进行浓缩分离的循环肿瘤细胞浓缩分离设备及循环肿瘤细胞的浓缩分离方法。 0016 用于解决技术问题的方案 0017 本发明人等鉴于上述技术问题发现： 通过使用具备特定比重的具有触变性的细胞 分离剂能够解决上述技术问题。 即， 本发明为一种循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 其用于对源 自血液的样品中存在的

13、循环肿瘤细胞进行浓缩分离， 其具备： 有底的管状容器， 其一端封 闭， 另一端开口； 具有触变性的细胞分离剂， 其被收纳于上述管状容器内， 上述触变性能够 在离心分离后， 使肿瘤细胞与上述肿瘤细胞以外的血液细胞分离， 上述细胞分离剂的比重 在1.0501.080的范围内 0018 在本发明的设备的某一特定方式中， 上述细胞分离剂的比重在1.0551.080的范 围内。 0019 在本发明的设备的另一特定的方式中， 上述细胞分离剂的比重在1.0651.077的 范围内。 0020 在本发明的设备的另一特定方式中， 上述细胞分离剂含有数均分子量700以上的 聚亚烷基二醇作为触变性赋予剂， 且该聚亚

14、烷基二醇以细胞分离剂整体的5重量以下的 浓度进行配合。 0021 在本发明的设备的某一特定方式中， 还含有收纳于上述管状容器内的抗血液凝固 剂。 0022 在本发明的设备的另一特定方式中， 上述循环肿瘤细胞浓缩分离设备还含有细胞 凝聚药剂， 其使上述肿瘤细胞以外的血液细胞彼此选择性地凝聚并通过离心分离操作而沉 淀。 0023 在本发明的设备的另一特定方式中， 上述细胞凝聚药剂是使血球细胞选择性地凝 聚的细胞凝聚药剂。 0024 在本发明的设备的另一特定方式中， 上述细胞凝聚药剂是具有形成免疫复合体的 能力的抗体。 0025 在本发明的设备的另一特定方式中， 上述细胞凝聚药剂的抗体具备与白血球表

15、面 上特有的抗原结合的抗原识别部位和与红血球表面上特有的抗原结合的抗原识别部位这 两者。 0026 在本发明的设备的另一特定方式中， 添加有上述细胞凝聚药剂， 上述细胞凝聚药 剂的添加量相对于源自血液的样品1mL为25150 L。 0027 在本发明的设备的另一特定方式中， 上述有底的管状容器的上述开口由栓体密 封， 且其内部进行了减压， 构成所述栓体的至少一部分能够被刺穿。 0028 另外， 本发明的循环肿瘤细胞的浓缩分离方法包括下述的各工序。 0029 (1)在收纳有细胞分离剂且一端封闭且另一端开口的有底管状容器内， 使源自血 说明书 2/13 页 5 CN 105683353 A 5 液

16、的样品、 细胞凝聚药剂以及抗血液凝固剂共存的工序， 所述细胞分离剂的比重在1.050 1.080的范围内且通过离心分离操作能够使上述肿瘤细胞与上述肿瘤细胞以外的血液细胞 分离， 所述细胞凝药剂用于使肿瘤细胞以外的血液细胞彼此选择性地凝聚且通过离心分离 操作而沉淀； 0030 (2)使该细胞凝聚药剂和该源自血液的样品在该容器内进行反应的工序； 0031 (3)对该容器进行离心分离， 从而在该肿瘤细胞和该其它血液细胞之间由细胞分 离剂形成隔壁的工序； 0032 (4)对被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的该肿瘤细胞进行回收的工序。 0033 发明的效果 0034 根据本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备及浓

17、缩分离方法， 能够以简便的操作且 高回收率， 以及在不提高对细胞的创伤性的情况下， 对源自血液的样品中的循环肿瘤细胞 进行浓缩分离。 因此， 能够高效地从源自血液的样品中回收循环肿瘤细胞。 0035 在本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备中， 如上所述， 由于能够以高纯度回收源 自血液的样品中极微量存在的肿瘤细胞， 因此例如能够谋求使用浓缩分离的样品利用流式 细胞仪检测肿瘤细胞时的检测效率及检测精度的提高。 或者， 能够在显微镜下高效且高精 度地实施对浓缩分离的肿瘤细胞进行细胞学分析的操作。 并且， 能够以简便的操作且高回 收率且高纯度回收肿瘤细胞， 由此， 认为能够贡献于高效的新颖肿瘤治疗药物的

18、开发以及 新的治疗上及诊断上的靶标的发现。 附图说明 0036 图1是示出本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备的一个结构例的示意性的正面剖 视图。 0037 标记说明 0038 1循环肿瘤细胞浓缩分离设备 0039 2容器主体 0040 3细胞分离剂 具体实施方式 0041 下面， 通过对本发明的具体的实施方式进行说明来明确本发明。 本发明所提供的 设备为对源自血液的样品中存在的极微量的肿瘤细胞进行浓缩分离的设备， 该循环肿瘤细 胞浓缩分离设备的特征在于， 在一端封闭， 另一端开口的有底的管状容器中收纳具有触变 性的细胞分离剂， 该细胞分离剂具有该肿瘤细胞和其它的血液细胞的中间比重， 从而能够 通

19、过离心分离操作使两者分离。 0042 (血液细胞) 0043 本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备能够使用后面说明的细胞凝聚药剂除去源 自血液的样品中所含的血液细胞。 本说明书中的血液细胞表示除期望的肿瘤细胞以外的、 存在于源自血液的样品中的血液细胞， 例如可以举出： 血球细胞、 血小板细胞， 可更详细地 举出： 红血球、 B细胞、 T细胞、 单核细胞、 NK细胞、 颗粒细胞等， 但并不限定于此。 0044 (循环肿瘤细胞的比重及其它的血液细胞的比重) 说明书 3/13 页 6 CN 105683353 A 6 0045 循环肿瘤细胞的比重取决于肿瘤细胞的种类， 但通常为1.0401.065左右。

20、 另一 方面， 红血球的比重为1.095， 白血球的比重为1.0631.085左右。 因此， 循环肿瘤细胞以外 的细胞的比重通常在1.0631.095的范围。 0046 (源自血液的样品) 0047 在本说明书中的源自血液的样品中， 直接使用采自被试验者的全血试样， 此外， 同 样地还包括例如为了保持血液的性质或者出于创造在肿瘤细胞的分离浓缩中有利的环境 等目的， 添加了各种药剂的物质。 0048 作为源自血液的样品中所添加的药剂， 可以举出： 葡萄糖、 麦芽糖等糖类、 柠檬酸 钠等， 但并不限定于此。 另外， 后述的抗血液凝固剂可以采取预先包含在源自血液的样品中 的构成。 0049 (细胞分

21、离剂) 0050 本发明提供一种将具有触变性的细胞分离剂收纳在一端封闭， 另一端开口的有底 的管状容器中而成的设备， 由此解决上述技术问题。 0051 如上所述， 在本发明中， 细胞分离剂的比重需要设为循环肿瘤细胞的比重和循环 肿瘤细胞以外的血液细胞的比重之间的值。 由此， 在离心分离操作后， 能够在循环肿瘤细胞 和其它的血液细胞之间可靠地形成隔壁。 0052 但是， 通常具有触变性的细胞分离剂随着比重升高流动敏感性因离心力而降低， 因此， 通常所使用的血清或者血浆用的分离剂制备成比重1.0401.055。 0053 本发明中的细胞分离剂的比重在1.0501.080的范围内。 因此， 能够对肿

22、瘤细胞 和其它的血液细胞进行分离。 优选该比重在1.0551.080的范围内， 更优选在1.065 1.077的范围内。 进一步优选该比重在1.0701.077的范围内。 若在这样的比重范围， 则能 够更加可靠地对循环肿瘤细胞和其它的血液细胞进行分离。 0054 但是， 若比重范围升高， 则有可能细胞分离剂的流动性降低。 因此， 优选添加后述 的触变性增强剂。 作为触变性增强剂， 如后所述， 可以优选使用数均分子量700以上的聚亚 烷基二醇。 通过添加这样的触变性增强剂， 在离心分离后能够在肿瘤细胞和其它的血液细 胞之间更加可靠地形成强度充分的隔壁。 0055 本发明的细胞分离剂没有特别限定，

23、 优选含有液体成分和无机粉末。 通过组合液 体成分和无机粉末， 能够容易地实现上述的比重范围。 无机粉末的表面可以为亲水性， 或者 无机粉末的表面可以为疏水性。 另外， 作为上述无机粉末， 可以组合使用表面为亲水性的无 机粉末和表面为疏水性的无机粉末。 0056 在本发明中的细胞分离剂中， 作为上述液体成分， 没有特别限定， 只要使用聚硅氧 烷类、 -烯烃-富马酸二酯共聚物类、 丙烯酸类、 聚酯类、 癸二酸和2,2-二甲基-1,3-丙二醇 和1,2-丙二醇的共聚物类、 聚醚聚氨酯类、 聚醚酯类等液体树脂、 聚- -蒎烯聚合物和氯代 烃的液体混合物类、 氯化聚丁烯和环氧化动植物油等液体化合物的液

24、体混合物类、 三氟氯 化乙烯及苯多羧酸烷基酯衍生物等和聚氧亚烷基二醇等液体混合物类、 环戊二烯低聚物和 邻苯二甲酸酯等液体混合物类等液/液或者固/液混合物这样的在常温下为液体的现有公 知的物质即可。 0057 另外， 上述无机粉末没有特别限制， 可以使用选自利用公知的气相法(也称为干式 法)或者沉淀法所制造的包含二氧化硅或由膨润土、 蒙脱石等的粘土矿物等二氧化硅类、 或 说明书 4/13 页 7 CN 105683353 A 7 者氧化钛类、 氧化铝类等微粉末中的一种， 或者混合使用两种以上。 0058 另外， 在本发明中， 就上述无机粉末而言， 表面可以具有亲水性， 也可以具有疏水 性。 另

25、外， 可以组合使用表面为疏水性的无机粉末和表面为亲水性的无机粉末。 0059 在本发明中， 作为上述无机粉末， 可以优选使用二氧化硅类粉末或者氧化钛类粉 末， 也可以组合使用这两者。 0060 在二氧化硅类粉末中， 作为亲水性的二氧化硅， 可以获得并容易使用下列气相法 亲水性二氧化硅， 例如： AEROSIL(注册商标)90G、 AEROSIL130、 AEROSIL200、 AEROSIL300等 AEROSIL系列(日本AEROSIL公司制造)、 REOLOSIL(注册商标)QS-10、 REOLOSILQS-20、 REOLOSILQS-30等REOLOSIL系列(Tokuyama公司制

26、造)、 WACKERHDKS13、 WACKERHDKN20、 WACKERHDKT30等WACKERHDK系列(旭化成Wacker-silicone公司(旭化成 社)制造)等。 0061 另外， 作为疏水性二氧化硅， 可以获得并容易使用下列气相法疏水性二氧化硅， 例 如： AEROSILR972、 AEROSILR974、 AEROSILR805、 AEROSILR812等AEROSIL系列(日本 AEROSIL公司制造)、 REOLOSILMT-10、 REOLOSILDM-30S、 REOLOSILHM-30S、 REOLOSILKS- 20S、 REOLOSILPM-20等REOLOS

27、IL系列(Tokuyama公司制造)、 WACKERHDKH15、 WACKERHDK H18、 WACKERHDKH30等WACKERHDK系列(旭化成Wacker-silicone公司(旭化成 社)制造)等。 0062 在本发明中， 优选还添加触变性增强剂。 作为这样的触变性增强剂， 只要可提高触 变性就没有特别限定， 可优选使用聚亚烷基二醇。 可更优选使用对碳原子数为24的环氧 烷烃单体的一种或量种以上进行聚合而得到的聚合物。 进一步优选为对碳原子数为3或4的 环氧烷烃单体的一种或两种以上进行聚合而得到的聚合物， 可使用数均分子量700以上的 聚亚烷基二醇。 通过这样的触变性增强剂的添加

28、可在离心分离后更加可靠地形成隔壁， 且 可以形成强度充分的隔壁。 0063 在本发明的细胞分离剂中， 上述特定的聚亚烷基二醇可以单独使用一种， 也可以 配合两种以上。 0064 在本发明中所使用的聚亚烷基二醇中， 若分子内过量地含有碳原子数为2的乙二 醇单体的聚合成分， 则水溶性增大， 故不优选， 可优选使用戴维斯法的HLB值为16以下的物 质。 需要说明的是， 所谓戴维斯法的HLB值， 由下述式算出。 0065 0066 需要说明的是， 所谓基数为各官能团所确定的固有的数值。 0067 另外， 根据源自起始物质醇类的官能团数的羟基数或者有无基于该羟基的烷基等 的封端处理等， 可任意使用具有数

29、量为1或者大于1的羟基的聚亚烷基二醇。 为了降低水溶 性， 更优选每1分子的羟基数为3个以下。 0068 另外， 在上述聚亚烷基二醇的分子内， 可以含有羟基的封端目的以外所引入的疏 水性残基。 作为这样的疏水性残基， 可以举出： 亚烷基、 链烯烃基、 链炔烃基、 芳香环基、 二甲 基硅氧烷类取代基等。 0069 另外， 可以代替上述羟基或者追加含有羰基、 氨基或巯基等氢键合性极性基团。 在 这样的情况下， 为了降低水溶性， 也更优选每1分子的极性基团的数量为3个以下。 0070 若聚亚烷基二醇的数均分子量小于700， 则有时在离心分离后所形成的隔壁上产 说明书 5/13 页 8 CN 1056

30、83353 A 8 生龟裂。 其结果， 可能血球细胞和肿瘤细胞混合使肿瘤细胞的纯度降低。 因此， 数均分子量 优选为700以上。 在具有2个以上的羟基的聚亚烷基二醇的情况下， 数均分子量更优选为 1000以上。 需要说明的是， 上述聚亚烷基二醇的数均分子量的上限值没有特别限定， 但优选 为100,000以下。 若超过100,000， 则有时羟基密度减小而不发挥作为触变性增强剂的作用。 0071 上述聚亚烷基二醇的浓度优选为血液分离剂整体的5重量以下。 通过调整为5重 量以下可以更加容易地将细胞分离剂调整为优选的粘度范围。 更优选为3重量以下， 进 一步优选为2重量以下。 另外， 上述聚亚烷基二

31、醇的浓度的优选下限为0.1重量。 通过调 整为0.1重量以上， 将细胞分离剂的粘度范围调整为优选的范围变得更加容易。 0072 作为上述特定的聚亚烷基二醇的具体例， 可以举出以下的各种聚亚烷基二醇。 但 是， 并不限定于下述例示的物质。 0073 作为具有数量大于1的末端羟基的聚亚烷基二醇， 例如可以举出： 聚丁二醇(日油 公司制造、 PB-700、 PB-1000、 PB-2000等UNIOL(注册商标)PB系列)、 聚丙二醇(日油公司制 造、 D-700、 D-1200、 D-4000等UNIOLD系列)、 聚氧丙烯甘油醚(日油公司制造、 TG-1000、 TG- 3000、 TG-400

32、0等UNIOLTG系列)、 聚氧丙烯山梨糖醇(日油公司制造、 HS-1600D等UNIOLHS 系列)、 聚丝氨酸(日油公司制造、 DCB-1000、 DCB-2000、 DCB-4000等聚丝氨酸DCB系列、 及DC- 1100、 DC-1800E、 DC-3000E等聚丝氨酸DC系列)、 聚氧丙烯二甘油醚(日油公司制造、 DGP-700 等UNILUB(注册商标)系列)、 聚氧丙烯甘油醚(旭硝子公司制造、 S3003、 S3006、 S3011等 Preminol系列)、 聚丙二醇(旭硝子公司制造、 S4001、 S4006、 S4011、 S4015等Preminol(注册 商标)系列)

33、、 聚氧乙烯聚氧丙二醇(三洋化成工业公司制造、 PE-34、 PE-61、 PE-62、 PE-64、 PE-71、 PE-74等Nieuport(注册商标)PE系列)、 聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚(ADEKA公司制造、 AM-502等ADEKA聚醚)。 0074 作为具有1个末端羟基的聚亚烷基二醇， 例如可以举出： 聚氧丙烯丁醚(日油公司 制造、 MB-7、 MB-14、 MB-38、 MB-700等UNILUBMB系列)、 聚氧丙二醇单醚(三洋化成公司制造、 LB-285、 LB-625、 LB-3000、 LB-1800X等NieuportLB系列)、 聚氧丙烯烷基醚(旭硝子公司制 造、 S

34、1004F、 S1005等Preminol系列)。 0075 在本发明的细胞分离剂中， 可以在能够维持作为细胞分离剂的性能的范围内进一 步配合相容剂、 抗氧化剂等添加剂。 0076 本发明的细胞分离剂的比重调整为1.0501.080。 本发明的细胞分离剂的比重优 选调整为1.0551.080， 更优选调整为1.0651.077。 在将比重设为低于1.055的情况下， 有时低于肿瘤细胞的比重或者期望的肿瘤细胞的回收率降低。 另一方面， 若使比重高于 1.080， 则有时由于接近于不期望的肿瘤细胞以外的血液细胞特别是血球细胞的比重， 因 此， 离心分离时的细胞分离剂的流动性降低， 从而无法在肿瘤细

35、胞和其它的血液细胞之间 形成隔壁。 0077 (抗血液凝固剂) 0078 在本发明的肿瘤细胞浓缩分离设备中， 可以根据需要添加抗血液凝固剂。 该抗血 液凝固剂只要采取在后面说明的细胞凝聚药剂和源自血液的样品的反应时两者共存的形 态即可。 即， 该抗血液凝固剂可以采取预先被收纳在上述容器内的形态， 另外， 也可以采取 预先另行添加到源自血液的样品中的形态。 在采用预先被收纳在上述容器内的形态的情况 下， 可以采取涂布在容器内壁面的形态或制成颗粒状、 片状等易于溶解于源自血液的样品 说明书 6/13 页 9 CN 105683353 A 9 中的形状收纳在容器内的形态。 0079 作为本发明中所使

36、用的抗血液凝固剂， 没有特别限定， 可以使用柠檬酸、 肝素、 EDTA等公知的抗血液凝固剂。 0080 (细胞凝聚药剂) 0081 本发明的肿瘤细胞浓缩分离设备根据需要含有细胞凝聚药剂。 所谓本发明中的细 胞凝聚药剂是指： 选择性地使期望的肿瘤细胞以外的血液细胞凝聚， 通过使用了比重差的 离心分离操作， 使其变得容易沉淀、 分离， 由此， 能够提高该肿瘤细胞的纯度的药剂。 因此， 只要为具有这样的作用机理的药剂就可应用公知的药剂， 可优选使用具备与白血球表面上 特有的抗原结合的抗原识别部位和与红血球表面上特有的抗原结合的抗原识别部位这两 者的抗体(RosetteSephumanCD45depl

37、etioncocktail、 STEMCELLTechnologies公司制 造)。 0082 另外， 作为具有其它凝聚方法的药剂， 可以使用将能够与白血球表面上特有的抗 原结合的抗原识别部位与比重较大的载体物理结合或者化学结合而成的药剂、 使血球细胞 微球等物理吸附于不溶性载体的药剂。 0083 (细胞分离剂的制造方法) 0084 本发明的细胞分离剂的制造方法可以使用现有公知的方法， 没有特别限定。 即， 只 要将上述液体成分、 上述无机粉末及上述特定的聚亚烷基二醇以适宜的方法混合即可。 混 合方法没有特别限定， 可以举出使用了行星式混合器、 开放式炼胶机、 均质机等公知的混炼 机的方法。

38、0085 (循环肿瘤细胞浓缩分离设备) 0086 本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备具备容器主体和被收纳在容器主体内且上 述本发明的细胞分离剂、 以及根据需要添加的抗血液凝固剂及细胞凝聚药剂作为构成要 素。 作为该容器主体， 没有特别限定， 以广泛用作采血管的有底的管状容器为代表， 可以使 用试验管、 离心管、 微管等任意的可进行离心分离的有底的管状容器。 0087 图1是示出这样的循环肿瘤细胞浓缩分离设备的一种结构例子的示意性的正面剖 视图。 循环肿瘤细胞浓缩分离设备1具有由有底的管状容器构成的容器主体2。 该容器主体2 内收纳有细胞分离剂3。 0088 上述有底的管状容器的开口的一端由栓体密

39、封， 且该容器的内部可以进行减压， 构成所述栓体的至少一部分能够被刺穿。 另外， 关于上述容器主体的材质， 只要可耐受离心 分离即可， 没有特别限定， 可以使用合成树脂及玻璃等任意的材料。 0089 就容器主体及栓体而言， 为了分别起到防止血块附着等效果， 可以实施内部表面 处理。 0090 另外， 细胞分离剂的添加量通常优选该容器每1根添加0.3g3.0g左右， 但可以根 据使用的容器的容积及形状选择最佳的添加量。 0091 另外， 就本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备而言， 上述细胞凝聚药剂优选收纳 在容器中， 并使其添加量相对于源自血液的样品1mL为25150 L。 由此， 可以按照本发明

40、更 加有效地分离肿瘤细胞和肿瘤细胞以外的血液细胞。 0092 另外， 在本发明中， 包括使用用于将源自血液的样品中的循环肿瘤细胞浓缩分离 的循环肿瘤细胞浓缩分离设备。 本发明使用一种用于将源自血液的样品中存在的循环肿瘤 说明书 7/13 页 10 CN 105683353 A 10 细胞浓缩分离的设备， 其具备： 具有触变性的细胞分离剂， 其被收纳于所述管状容器内， 所 述触变性能够在离心分离后， 使肿瘤细胞与所述肿瘤细胞以外的血液细胞分离， 所述细胞 分离剂的比重在1.0501.080的范围内。 0093 如上所述， 通过使用本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备， 可实现源自血液的样 品中的肿瘤

41、细胞的浓缩分离方法。 使用了本发明的循环肿瘤细胞浓缩分离设备的源自血液 的样品中的肿瘤细胞的浓缩分离方法具备以下的工序。 0094 (使用循环肿瘤细胞浓缩分离设备的源自血液的样品中的循环肿瘤细胞的浓缩分 离方法) 0095 (1)在收纳有细胞分离剂且一端封闭且另一端开口的有底管状容器内， 使源自血 液的样品、 细胞凝聚药剂以及抗血液凝固剂共存的工序， 上述细胞分离剂的比重在1.050 1.080的范围内且通过离心分离操作能够使上述肿瘤细胞与上述肿瘤细胞以外的血液细胞 分离， 上述细胞凝药剂用于使肿瘤细胞以外的血液细胞彼此选择性地凝聚且通过离心分离 操作而沉淀； 0096 (2)使该细胞凝聚药剂

42、和该源自血液的样品在该容器内进行反应的工序； 0097 (3)对该容器进行离心分离， 从而在该肿瘤细胞和该其它血液细胞之间由细胞分 离剂形成隔壁的工序； 0098 (4)对被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的该肿瘤细胞进行回收的工序。 0099 涉及设备的详细内容如上所述， 接触了本说明书的本领域技术人员可以参照说明 书的记载适宜地进行变更等， 实施本发明的源自血液的样品中的循环肿瘤细胞的浓缩分离 方法。 0100 使用本发明中的设备所浓缩分离的循环肿瘤细胞可以在使用检测试剂标记后采 用流式细胞术等方法计数、 分析。 作为检测试剂， 可以举出例如： 含有识别循环肿瘤细胞的 表面上表达的特有的抗原的抗

43、体的试剂、 含有感染肿瘤细胞而以肿瘤细胞特有的端粒酶活 性反应增殖并发出荧光的病毒的试剂等。 0101 通过使用本发明的设备能够以高纯度回收肿瘤细胞， 因此， 期待利用流式细胞仪 的肿瘤细胞的检测效率及检测精度的提高。 0102 实施例 0103 下面， 举出本发明的具体的实施例及比较例， 由此明确本发明。 需要说明的是， 本 发明并不限定于以下的实施例。 0104 实施例112及比较例12 0105 (实施例112及比较例12中使用的物质) 0106 1)液体成分 0107 液体成分1： 丙烯酸酯聚合物(比重1.032、 25下的粘度65Pas) 0108 粘度的测定利用流变仪DV-III(

44、Brookfield公司制造)进行。 0109 2)无机粉末 0110 作为无机粉末， 组合使用疏水性二氧化硅(日本AEROSIL公司制造、 AEROSILR974、 粒径： 约12nm、 比表面积： 约170m2/g、 将表面用CH3基化学处理而成为疏水性)和氧化钛(石原 产业公司制造、 TIPAQUEA-100、 粒径0.15 m)。 0111 3)聚亚烷基二醇 说明书 8/13 页 11 CN 105683353 A 11 0112 准备下述的表1所示的聚亚烷基二醇作为触变性增强剂13。 0113 增强剂1： 聚氧丙烯甘油醚(旭硝子公司制造、 PreminolS3011) 0114 增强

45、剂2： 聚丁二醇(日油公司制造、 UNIOLPB700) 0115 增强剂3： 聚氧丙烯甘油醚(ADEKA公司制造、 ADEKA聚醚G300) 0116 表1 0117 物质名称商品名MnHLB(戴维斯法) 增强剂1聚氧丙烯甘油醚S301110,000-13 增强剂2聚丁二醇PB7007005 增强剂3聚氧丙烯甘油醚G30035012 0118 (细胞分离剂的制作) 0119 (实施例1) 0120 如下述的表2所示， 配合下述物质， 使得含有94.9重量的液体成分1、 上述混合物 即无机粉末共4.6重量、 0.5重量的作为聚亚烷基二醇的表1示出的触变性增强剂1， 在 室温下使用行星式混合器搅

46、拌混合， 制作细胞分离剂。 0121 (实施例212及比较例12) 0122 如下述的表2所示， 变更使用的材料及配合比例， 除此以外， 与实施例1同样地制作 细胞分离剂。 需要说明的是， 在实施例11中， 不使用聚亚烷基二醇。 在实施例12中， 使用数均 分子量350的触变性增强剂3。 在比较例1中， 将细胞分离剂的比重调整为1.045。 在比较例2 中， 将细胞分离剂的比重调整为1.085。 0123 表2 0124 0125 (循环肿瘤细胞浓缩分离设备的制作) 0126 准备15mL容量的锥形管(BD公司制造)， 在各管中收纳实施例112及比较例12 说明书 9/13 页 12 CN 1

47、05683353 A 12 的细胞分离剂各约1.8g， 由此， 制作循环肿瘤细胞浓缩分离设备。 0127 (评价) 0128 以下的评价使用如下得到的拟患者血进行： 在利用EDTA进行了抗凝固处理的健康 人血中添加结肠腺癌培养细胞(DLD-1)， 使其成为50个/血液1mL。 0129 1)细胞分离剂的流动性评价 0130 在循环肿瘤细胞浓缩分离设备3根中注入拟患者血各2mL后， 在1200g20分/室温 的条件下进行离心分离。 在基于细胞分离剂的隔壁的平均厚度为5mm以上的情况下， 标记为 ， 在2mm以上且低于5mm的厚度的情况下， 标记为， 在低于2mm的厚度的情况下， 标记为 。 将结

48、果示于下述的表3。 0131 2)隔壁强度 0132 将离心分离后的循环肿瘤细胞浓缩分离设备倾斜， 以60Hz给予1小时的振动。 在隔 壁不移动的情况下， 标记为， 在移动但保持隔壁的情况下， 标记为， 在隔壁崩塌与血球 细胞混合的情况下， 标记为。 将结果示于下述的表3。 0133 3)隔壁形成状态评价 0134 利用目视对离心分离后所形成的隔壁的状态以及有无油状浮游物及油膜进行观 察。 将结果示于下述的表3。 在表3中， 在隔壁产生龟裂的情况下， 标记为 “龟裂” 。 另外， 在产 生油状浮游物或油膜的情况下， 记载为 “油” 。 在这些情况均未观察到的情况下， 标记为 。 0135 4)

49、肿瘤细胞回收率 0136 将离心分离后被浓缩分离至隔壁上方的血浆中的肿瘤细胞通过吸液回收。 DLD-1 为上皮类的细胞， 因此， 在回收的悬浮液中添加CD326-FITC抗体(Miltenyi公司制造)进行 荧光标记。 另外， 将残留的不期望的白血球通过CD45-APC(Miltenyi公司制造)进行荧光标 记， 利用流式细胞仪(FACSAria、 BD公司制造)， 对CD326+/CD45-的细胞数进行测量， 算出相 对于拟患者血中所含的肿瘤细胞数100个的回收率。 将结果示于表3。 0137 表3 说明书 10/13 页 13 CN 105683353 A 13 0138 0139 由表3可知， 在实施例19中， 细胞分离剂的流动性、 隔壁强度、 隔壁形成状态、 肿 瘤细胞回收率均显示良好的结果。 另外， 在实施例10中， 在隔壁形成状态的观察中， 产生油 状浮游物或油膜， 隔壁强度很低， 但能够与实施例19同样地高回收率回收肿瘤细胞。 在实 施例10中， 认为由于添加聚氧亚烷基二醇多达10重量， 因此产生上述油状浮游物或油膜。 0140 相对于此， 在未添加聚亚烷基二醇的实施例11中， 无法得到充分的触变性而无法 得到充分的隔壁强度， 但肿瘤细胞回收率良好。 0141 在使用了