新的乙内酰脲、乙内酰硫脲、嘧啶二酮和硫代嘧啶酮衍生物， 制备方法和作为药物的用途 本发明涉及如下通式(I)所示的乙内酰脲、乙内酰硫脲、嘧啶二酮和硫代嘧啶酮的新衍生物、它们的制备方法和它们作为药物的用途。这些化合物与生长激素释放抑制因子受体的某些亚型具有良好的亲和性，因此具有有用的药理性质。本发明还涉及含有所述化合物的药物组合物及其在制备药物中的用途，该药物意欲用于治疗其中涉及一种(或多种)生长激素释放抑制因子受体的病理状态或疾病。
生长激素释放抑制因子(SST)是一种环状十四肽，是首次从下丘脑分离的一种抑制生长激素的物质(Brazeau P.等《科学》(Science)1973，179，77-79)。它在脑中还充当神经递质(Reisine T.等《神经科学》(Neuroscience)1995，67，777-790；Reisine T.等《内分泌学》(Endocrinology)1995，16，427-442)。分子克隆已经可以显示，生长激素释放抑制因子的生物活性直接取决于与膜连接地五种受体的家族。
对生长激素释放抑制因子的生物功能异质性所进行的研究试图确定生长激素释放抑制因子受体上的肽类似物的结构-活性关系，于是发现了受体的5种亚型(Yamada等《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A)89，251-255，1992；Raynor，K.等《分子药理学》(Mol.Pharmacol.)44，385-392，1993)。这些受体的功用目前正在积极的研究当中。与生长激素释放抑制因子受体的不同亚型的亲和性已经与下列障碍/疾病的治疗关联起来。亚型2与5的活化已经与生长激素(GH)的抑制关联，更具体地说已经与分泌GH的腺瘤(肢端肥大症)和分泌激素TSH的腺瘤的抑制关联。亚型2、但不是亚型5的活化已经与分泌催乳素的腺瘤的治疗关联。其他与生长激素释放抑制因子受体亚型的活化有关的适应征是狭窄的复发、胰岛素和/或胰高血糖素分泌的抑制，特别是糖尿病、高脂血症、对胰岛素不敏感、X综合征、血管病、糖尿病增殖性视网膜病变、黎明现象和肾病；胃酸分泌的抑制，特别是消化性溃疡、肠皮与胰皮瘘、易激性结肠综合征、倾倒综合征、水性腹泻综合征、与AIDS有关的腹泻、由化疗诱发的腹泻、急性或慢性胰腺炎和分泌性胃肠肿瘤；诸如肝细胞瘤等癌症的治疗；血管生成的抑制、诸如关节炎等炎症的治疗；慢性同种异体移植物排斥；血管成形术；移植血管出血和胃肠出血的预防。生长激素释放抑制因子激动剂也能够用于减少患者的体重。
在与生长激素释放抑制因子有关的病理障碍(Moreau J.P.等《生命科学》(Life Sciences)1987，40，419；Harris A.G.等《欧洲医学杂志》(The European Journal of Medicine)1993，2，97-105)中，例如可以提到：肢端肥大症、垂体腺瘤、库兴氏病、促性腺素瘤与催乳素瘤、糖皮质激素的分解代谢副作用、胰岛素依赖性糖尿病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、甲状腺机能亢进、巨人症、内分泌性胃肠胰肿瘤(包括类癌综合征、血管活性肠多肽瘤、胰岛素瘤、成胰岛细胞瘤、高胰岛素血症、胰升糖素瘤、胃泌素瘤和佐-埃综合征)、食管静脉曲张的生长激素释放因子瘤以及急性出血、胃食管反流、胃十二指肠反流、胰腺炎、肠皮与胰腺瘘伴有腹泻、获得性免疫缺陷综合征的顽固性腹泻、慢性分泌性腹泻、与肠易激综合征有关的腹泻、与胃泌素释放肽有关的障碍、肠移植的继发病变、肝硬化患者肝门高血压以及静脉曲张出血、胃肠出血、胃十二指肠溃疡出血、局限性回肠炎、系统性硬化病、倾倒综合征、小肠综合征、低血压、硬皮病与髓样甲状腺癌、与细胞过度增殖有关的疾病(例如癌症，更确切为乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌以及胰腺癌和结肠直肠癌)、纤维样变性(更确切为肾纤维样变性、肝纤维样变性、肺纤维样变性、皮肤纤维样变性、中枢神经系统纤维样变性以及鼻纤维样变性和由化疗诱发的纤维样变性)和其他治疗领域，例如头痛(包括与垂体肿瘤有关的头痛)、疼痛、恐慌发作、化疗、伤口结瘢、由发育迟缓引起的肾机能不全、肥胖和与肥胖有关的发育迟缓、子宫发育迟缓、骨骼发育异常、努南综合征、睡眠呼吸暂停综合征、格雷夫斯氏病、卵巢多囊病、胰腺假性囊肿与腹水、白血病、脑膜瘤、癌性恶病质、幽门螺杆菌(H pylori)的抑制、牛皮癣以及阿耳茨海默氏病。还可以提到骨质疏松。
申请人发现，下述通式(I)化合物对生长激素释放抑制因子受体具有亲和性和选择性。由于生长激素释放抑制因子及其肽类似物经常具有较差的口服生物利用度和较低的选择性(Robinson，C.《未来药物》(Drugsof the Future)1994，19，992；Reubi，J.C.等《TIPS》1995，16，110)，所述化合物是生长激素释放抑制因子的非肽类激动剂或拮抗剂，能够有利地用于治疗上述和其中涉及一种(或多种)生长激素释放抑制因子受体的病理状态或疾病。优选地，所述化合物能够用于肢端肥大症、垂体腺瘤或包括类癌综合征在内的内分泌性胃肠胰肿瘤的治疗。
本发明化合物具有通式(I)呈外消旋形式、对映异构形式或所有这些形式的组合，其中：R1代表(C1-C12)烷基、(C0-C6)烷基-C(O)-O-Z1、(C0-C6)烷基-C(O)-NH-(CH2)p-Z2或任选取代的芳基，Z1代表H、(C1-C6)烷基、-(CH2)p-芳基；Z2代表氨基、(C1-C12)烷基氨基、(C3-C8)环烷基氨基、N，N-二(C1-C12)烷基氨基、NH-C(O)-O-(CH2)p-苯基、NH-C(O)-O-(CH2)p-(C1-C6)烷基、任选取代的碳环或杂环芳基或任选取代的杂环非芳香基团；R2代表H、(C1-C12)烷基或任选取代的芳基；R3代表H或(CH2)p-Z3；Z3代表(C1-C12)烷基、(C1-C12)链烯基、(C3-C8)环烷基、-Y1-(CH2)p-苯基-(X1)n、-S-(C1-C12)烷基、S-(C1-C12)烷基-S-S-(C1-C12)烷基、任选取代的碳环或杂环芳基，特别是下式所示基团之一：任选取代的杂环非芳香基团，双-芳基烷基或联-芳基烷基(di-arylalkyl)或下式基团：Y1代表O、S、NH或不存在；R4代表(CH2)p-Z4；Z4代表氨基、(C1-C12)烷基、(C3-C8)环烷基、(C1-C12)烷基氨基、N，N-二(C1-C12)烷基氨基、氨基(C3-C6)环烷基、氨基(C1-C6)烷基(C3-C6)环烷基(C1-C6)烷基、碳环或杂环氨基芳基、(C1-C12)烷氧基、(C1-C12)链烯基、N-C(O)O(C1-C6)烷基、任选取代的碳环或杂环芳基、任选取代的杂环非芳香基团、双-芳基烷基、联-芳基烷基或下式所示基团之一：或Z4代表N(R6)(R7)基团，其中R6和R7与它们所携带的氮原子一起形成5-7元杂环；R5代表H、-(CH2)p-C(O)-(CH2)p-Z5、-(CH2)p-Z5、-(CH2)p-OZ5或-(C0-C6)烷基-C(O)-NH-(CH2)p-Z5；Z5代表任选取代的基团，选自-(C1-C12)烷基、苯并[b]噻吩、苯基、萘基、苯并[b]呋喃基(furannyl)、噻吩、异恶唑基、吲哚基以及应该理解的是任选取代的基团或任选取代的苯基被一个或多个取代基任选取代，所述取代基各自优选独立地选自Cl、F、Br、I、CF3、NO2、OH、NH2、CN、N3、-OCF3、(C1-C12)烷基、(C1-C12)烷氧基、-(CH2)p-苯基-(X1)q、-NH-CO-(C1-C6)烷基、-NH-C(O)O-(C1-C6)烷基、-S-(C1-C6)烷基、-S-苯基-(X1)q、-O-(CH2)p-苯基-(X1)q、-(CH2)p-C(O)-O-(C1-C6)烷基、-(CH2)p-C(O)-(C1-C6)烷基、-O-(CH2)p-NH2、-O-(CH2)p-NH-(C1-C6)烷基、-O-(CH2)p-N-二-((C1-C6)烷基)和-(C0-C12)烷基-(X1)q；X1在每次出现时独立地选自H、Cl、F、Br、I、CF3、NO2、OH、NH2、CN、N3、-OCF3、(C1-C12)烷基、(C1-C12)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、-(CH2)p-氨基、-(CH2)p-NH-(C1-C6)烷基、-(CH2)p-N-二-((C1-C6)烷基)、-(CH2)p苯基和-(CH2)p-NH-(C3-C6)环烷基；p在每次出现时独立地为0或1-6的整数；q在每次出现时独立地为1-5的整数；X代表O或S；n代表0或1；且最后当n代表0时，m代表1、2或3，且当n代表1时，m代表0或1。
根据本发明的一个优选方案，通式(I)的化合物中R5代表H。
通式(I)的化合物合适的话可以含有不止一个不对称中心。若如此，非对映异构体或非对映异构体的任何混合物也包括在本发明内。例如当通式(I)的化合物具有两个不对称中心时，本发明将包括具有“R，S”、“S，R”、“R，R”和“S，S”构型的通式(I)化合物以及所述构型呈任何比例的混合物。
在本发明中，烷基可以是直链或支化的。除非另有指定，烷基表示含有1至6个碳原子的直链或支链烷基。除非另有指定，环烷基表示含有3至7个碳原子的单环碳系。除非另有指定，链烯基表示含有1至6个碳原子和至少一个不饱和度(双键)的直链或支链烷基。除非另有指定，炔基表示含有1至6个碳原子和至少一个双不饱和度(叁键)的直链或支链烷基。碳环或杂环芳基表示含有至少一个芳环的碳环或杂环体系，若至少一个包含某体系的环含有杂原子(O、N或S)，则称该体系为杂环体系。除非另有指定，芳基表示包含至少一个芳环的碳环体系。卤代烷基表示其中至少一个氢原子(可选地全部)被卤素原子代替的烷基。杂环非芳香基团是指不含芳环的杂环体系，其中至少一个环包含含有至少一个杂原子(O、N或S)的所述体系。
烷硫基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、氨基烷基、链烯基、炔基和芳烷基分别表示其中的烷基具有前述含义的烷硫基、烷氧基、卤代烷基、卤代烷氧基、氨基烷基、烷基氨基、链烯基、炔基和芳烷基。
N，N-二(C1-C12)烷基氨基是指其中取代氮原子的两个烷基可以独立地具有1-12个碳原子的二烷基氨基。
具有1至6个碳原子的直链或支链烷基尤其表示甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基、戊基、新戊基、异戊基、己基、异己基。环烷基尤其表示环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。碳环或杂环芳基尤其表示苯基、萘基、吡啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、2，3-二氢化茚基、吲哚基、咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯二甲酰亚氨基。碳环或杂环芳烷基尤其表示苄基、苯乙基、苯基丙基、苯基丁基、吲哚基烷基、苯二甲酰亚氨基烷基。
若从化学结构中发出箭头，则所述箭头表示连接点。例如：
代表氨基乙基。
当箭头通过双环或三环基团画出时，所述箭头表示所述双环或三环基团可以通过所述基团的任何芳环上的任何可用连接点连接。例如：
表示在苯环上的任何位置连接的基团。
特别是，本发明通式(I)的化合物可以是如下化合物，其中：R1代表任选取代的芳基；R2代表H或烷基；R3代表下列基团之一：R4代表下列基团之一：R5代表H或烷基。
优选地，通式(I)的化合物是如下化合物，其中：R1代表被卤素原子或(C1-C12)烷基、(C1-C12)烷氧基或硝基任选取代的苯基；R2和R5代表H或烷基；R3代表H或(CH2)p-Z3；Z3代表(C1-C12)烷基、(C3-C8)环烷基、Y1-(CH2)p-苯基-(X1)n、任选取代的碳环或杂环芳基、任选取代的杂环非芳香基团、双-芳基烷基、联-芳基烷基或如下所示基团之一：Y1代表O、S、NH或不存在；R4代表(CH2)p-Z4；Z4代表氨基、(C3-C8)环烷基、(C1-C12)烷基氨基、N，N-二(C1-C12)烷基氨基、氨基(C3-C6)环烷基、氨基(C1-C6)烷基(C3-C6)环烷基(C1-C6)烷基、碳环或杂环氨基芳基、任选取代的碳环或杂环芳基、任选取代的杂环非芳香基团、双-芳基烷基、联-芳基烷基或如下所示基团之一：应该理解的是任选取代的基团或任选取代的苯基被一个或多个取代基任选取代，所述取代基各自优选独立地选自Cl、F、Br、I、CF3、NO2、OH、NH2、CN、N3、-OCF3、(C1-C12)烷基、(C1-C12)烷氧基、-(CH2)p-苯基-(X1)q、-NH-CO-(C1-C6)烷基、-NH-C(O)O-(C1-C6)烷基、-S-(C1-C6)烷基、-S-苯基-(X1)q、-O-(CH2)p-苯基-(X1)q、-(CH2)p-C(O)-O-(C1-C6)烷基、-(CH2)p-C(O)-(C1-C6)烷基、-O-(CH2)p-NH2、-O-(CH2)p-NH-(C1-C6)烷基、-O-(CH2)p-N-二-((C1-C6)烷基)和-(C0-C12)烷基-(X1)q；X1在每次出现时独立地选自H、Cl、F、Br、I、CF3、NO2、OH、NH2、CN、N3、-OCF3、(C1-C12)烷基、(C1-C12)烷氧基、-S-(C1-C6)烷基、-(CH2)p-氨基、-(CH2)p-NH-(C1-C6)烷基、-(CH2)p-N-二-((C1-C6)烷基)、-(CH2)p苯基和-(CH2)p-NH-(C3-C6)环烷基；p在每次出现时独立地为0或1-6的整数；q在每次出现时独立地为1-5的整数；X代表O或S；n代表0或1；且最后当n代表0时，m代表1、2或3，而当n代表1时，m代表0或1。
更优选地，通式(I)的化合物是如下化合物，其中：R1代表被卤素原子或(C1-C12)烷基、(C1-C12)烷氧基或硝基任选取代的苯基；R2和R5代表H或烷基；R3代表(CH2)p-Z3；Z3代表(C3-C8)环烷基或选自苯基、萘基、呋喃基、噻吩、吲哚基、吡咯基和苯并噻吩基的任选取代的基团；R4代表(CH2)p-Z4；Z4代表氨基、(C1-C12)烷基氨基、N，N-二(C1-C12)烷基氨基或氨基(C1-C6)烷基(C3-C6)环烷基(C1-C6)烷基；X代表S；p在每次出现时独立地为0或1-6的整数；m代表0，1或2；且最后n代表0或1。
进一步优选的是，本发明化合物是：—如下亚通式(I)a所示的化合物：其中：R’3代表如下所示的基团之一：且R’4代表如下所示的基团之一：—如下亚通式(I)b所示的化合物：其中：R’3代表如下所示的基团之一：且R’4代表如下所示的基团之一：—如下亚通式(I)c所示的化合物：其中：R’3代表如下所示的基团之一：且R’4代表如下所示的基团之一：
本发明还涉及前述通式(I)化合物的制备方法(也可应用于亚通式(I)a、(I)b和(I)c的对应化合物)。
其中n代表0且X代表O或S的前述通式(I)化合物可以通过如下通式(II)所示的化合物：其中m、R1、R2、R3和R5具有与通式(I)中相同的含义，且O-GP基团为衍生于醇的隔离(parting)保护性基团且尤其是苄氧基、甲氧基或叔丁氧基，在非质子溶剂中与通式(III)的异氰酸酯或异硫氰酸酯反应而制备：
R4-N＝C＝X，
(III)其中R4和X具有与通式(I)中相同的含义，优选在叔碱存在下反应约1-24小时且反应温度优选为20-60℃。
其中n代表1且X代表O或S的前述通式(I)化合物可以通过如下通式(IV)所示的化合物：其中m、R1、R2、R3和R5具有与通式(I)中相同的含义，且O-GP基团为衍生于醇的隔离保护性基团且尤其是苄氧基、甲氧基或叔丁氧基，在非质子溶剂中与通式(III)的异氰酸酯或异硫氰酸酯反应而制备：
R4-N＝C＝X，
(III)其中R4和X具有与通式(I)中相同的含义，优选在叔碱存在下反应约1-48小时且反应温度优选为20-70℃。
对于上述方法，非质子溶剂优选是极性的且尤其可以是THF或二氯甲烷。叔碱例如是三乙胺或N，N-二异丙基乙基胺。
此外，本发明提供了可以用于制备通式(I)化合物的新型合成中间体。这些化合物为通式(II)和(IV)化合物的前体，对应于通式(V)：其中：R1，R2，R5、m和n具有与通式(I)中相同的含义；且O-GP基团为衍生于醇的隔离保护性基团且尤其是苄氧基、甲氧基或叔丁氧基。
下列对应于通式(V)的化合物是优选的中间体：
—(2S)-2-氨基-3-[(4-苯基)-1H-咪唑-2-基]丙酸苄基酯；
—(2R)-2-氨基-3-[(4-苯基)-1H-咪唑-2-基]丙酸苄基酯；
—(2S)-2-氨基-4-[(4-苯基)-1H-咪唑-2-基]丁酸苄基酯；
—(2R)-2-氨基-4-[(4-苯基)-1H-咪唑-2-基]丁酸苄基酯；
—(3R)-3-氨基-4-[(4-苯基)-1H-咪唑-2-基]丙酸苄基酯；
—(3S)-3-氨基-4-[(4-苯基)-1H-咪唑-2-基]丙酸苄基酯。
本发明的主题还有作为药物的前述通式(I)、(I)a、(I)b和(I)c的化合物或它们的可药用盐。本发明还涉及包含所述化合物或它们的可药用盐的药物组合物以及它们在制备药物中的用途，该药物意欲用于治疗其中涉及一种(或多种)生长激素释放抑制因子受体的病理状态或疾病。
具体而言，前述通式(I)、(I)a、(I)b和(I)c的化合物或它们的可药用盐可用于药物的制备，该药物意欲用于治疗选自下组的病理状态或疾病：肢端肥大症、垂体腺瘤、库兴氏病、促性腺素瘤与催乳素瘤、糖皮质激素的分解代谢副作用、胰岛素依赖性糖尿病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病、X综合征、黎明现象、血管病、血管成形术、甲状腺机能亢进、巨人症、内分泌性胃肠胰肿瘤(包括类癌综合征、血管活性肠多肽瘤、胰岛素瘤、成胰岛细胞瘤、高胰岛素血症、胰升糖素瘤、胃泌素瘤和佐-埃综合征)、食管静脉曲张的生长激素释放因子瘤以及急性出血、溃疡、胃食管反流、胃十二指肠反流、胰腺炎、肠皮与胰腺瘘伴有腹泻、获得性免疫缺陷综合征的顽固性腹泻、慢性分泌性腹泻、与肠易激综合征有关的腹泻、由化疗诱发的腹泻、与胃泌素释放肽有关的障碍、肠移植的继发病变、肝硬化患者肝门高血压以及静脉曲张出血、胃肠出血、胃十二指肠溃疡出血、移植血管出血、局限性回肠炎、系统性硬化病、倾倒综合征、小肠综合征、低血压、硬皮病与髓样甲状腺癌、与细胞过度增殖有关的疾病(例如癌症，更确切为乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌以及胰腺癌和结肠直肠癌)、纤维样变性(更确切为肾纤维样变性、肝纤维样变性、肺纤维样变性、皮肤纤维样变性、中枢神经系统纤维样变性以及鼻纤维样变性和由化疗诱发的纤维样变性)和其他治疗领域，例如头痛(包括与垂体肿瘤有关的头痛)、疼痛、炎症(例如关节炎)、恐慌发作、化疗、伤口结瘢、由发育迟缓引起的肾机能不全、高脂血症、肥胖和与肥胖有关的发育迟缓、子宫发育迟缓、骨骼发育异常、努南综合征、睡眠呼吸暂停综合征、格雷夫斯氏病、卵巢多囊病、胰腺假性囊肿与腹水、白血病、脑膜瘤、癌性恶病质、幽门螺杆菌的抑制、牛皮癣、慢性同种异体移植物排斥以及阿耳茨海默氏病和骨质疏松。
优选地，前述通式(I)、(I)a、(I)b和(I)c的化合物或它们的可药用盐可用于药物的制备，该药物意欲用于治疗选自下组的病理状态或疾病：肢端肥大症、垂体腺瘤或内分泌性胃肠胰肿瘤(包括类癌综合征)和胃肠出血。
可药用盐尤其表示无机酸的加成盐，例如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐(diphosphate)、氢溴酸盐和硝酸盐，或有机酸的加成盐，例如乙酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(pamoate)、草酸盐和硬脂酸盐。在能够使用时，由碱所生成的盐也落在本发明的范围内，碱例如氢氧化钠或氢氧化钾。关于其他可药用盐的实例，可以参考“药用盐”《药物科学杂志》66：1(1977)。
药物组合物可以是固体剂型，例如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、脂质体或栓剂。适宜的固体载体例如可以是磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、糊精、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和蜡。
含有本发明化合物的药物组合物还可以是液体剂型，例如溶液、乳剂、悬浮液或糖浆剂。适宜的液体载体例如可以是水，有机溶剂如甘油或二元醇类，以及它们按不同比例在水中的混合物。悬浮液尤其含有载有活性成分的缓释微粒悬浮液(尤其是聚丙交酯-共-乙交酯或PLGA的微粒；例如参见专利US 3,773,919、EP 52 510或EP 58 481，或专利申请PCT WO 98/47489)，其可以实现预定每日剂量历经数天至数周给药。
本发明药物的给药可以通过局部、口服、肠胃外途径或肌内注射等途径进行。
根据本发明的药物的给药剂量从0.1mg至10g，因所用活性化合物的类型而异。
这些化合物可以按照下述方法制备。
本发明化合物的制备
咪唑基衍生物的制备
通用方法：
i)环化以得到咪唑基团
使用碳酸铯在极性溶剂如DMF/H2O(1∶1)或EtOH/H2O(1∶1)混合物中将氨基酸转化为其铯盐。然后使用合适的溴代酮在非质子极性溶剂如无水DMF中得到酯。通过过滤除去形成的溴化铯并在具有高沸腾温度的非质子溶剂如二甲苯或甲苯中或在酸性非质子溶剂如乙酸中加入乙酸铵。使用迪安-斯达克分水器将混合物回流30分钟到1小时。在下列反应方案中，PG1为保护性基团，优选氨基甲酸酯，如t-Boc或氨基甲酸苄基酯，且PG2也为保护性基团，优选苄基。
或
如果合适，在咪唑基团上的N-取代通过下面对其中R5不代表H的通式(I)化合物所述的反应进行。
将在前一步骤得到的中间体、烷基化试剂如溴代酮、溴代酯、烷基溴或芳基溴的溶液在有机或无机碱(任选载负在树脂如聚苯乙烯树脂上)的存在下在非质子溶剂如THF、乙腈或DMF中加热至20-80℃的温度并保持2-48小时。
(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)丙酸苄基酯的制备
在约20℃下在EtOH/H2O(1∶1，7ml)中将Boc-L-Asp-OBn(12g；37.1mmol)和碳酸铯(6.05g；0.5eq.)的溶液搅拌约30分钟，然后在约40℃下减压浓缩。将25ml2-溴苯乙酮(7.38g；1eq.)在无水DMF中的溶液加入所得盐溶于130ml无水DMF中的溶液中。在氩气氛下于约20℃搅拌该混合物约1小时，然后减压浓缩。加入乙酸乙酯(100ml)并过滤混合物，用乙酸乙酯洗涤CsBr盐。然后减压浓缩滤液。将所得残余物和乙酸铵(58g；20eq.)在二甲苯(280ml)中的溶液在约140℃下保持回流约30分钟。使用迪安-斯达克分水器除去过量的NH4OAc和水。反应进程由薄层色谱(TLC；洗脱剂：乙酸乙酯/庚烷1∶1)监测。然后使混合物温度为约20℃，然后依次用水、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤到碱性pH，再用盐水洗涤到中性pH。然后用硫酸钠干燥有机相并减压浓缩。
通过在硅胶上的快速色谱(洗脱剂：乙酸乙酯/庚烷1∶1)提纯所得残余物得到预期化合物(8.2g；52％)。NMR(1H，400MHz，CDCl3)：7.64-7.14(m，11H，芳族H)；5.95(d，1H，NHBoc)；5.21-5.13(AB，2H，OCH2Ph，JAB＝12Hz)；4.73(m，1H，CH)；3.30(m，2H，CH2)；1.42(s，9H，(CH3)3C)。MS/LC：计算的MM＝421.2；m/z＝422.2(M+H)。
以类似于对(2S)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)丙酸苄基酯所述的方式制备下列化合物：解保护步骤
通用方法：用有机酸或无机酸如三氟乙酸或氯化氢(含水形式或气体形式)在非质子溶剂如二氯甲烷或乙酸乙酯中于0-25℃的温度下处理被N-Boc保护的咪唑基衍生物0.5-5小时。
(3S)-3-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)-3-氨基丙酸苄基酯的二盐酸盐的制备
在0℃下将无水HCl气流通入(3S)-3-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸苄基酯(5g)在乙酸乙酯(120ml)中的溶液中，直到TLC(洗脱剂：100％乙酸乙酯)显示原料已完全消失。所得混合物然后在减压下蒸发。将二乙醚加入所得固体中并过滤混合物。先用二氯甲烷然后用二乙醚洗涤该盐酸盐几次，减压干燥得到4.6g预期化合物(98％产率)。NMR(1H，400MHz，DMSOd6)：9.21(宽s，2H，NH)；8.03-7.28(m，芳族H，11H)；5.10(s，1H，OCH2Ph)；5.04(m，1H，CH)；3.61(dd，1H，CH2，3J＝9Hz，2J＝17.0Hz)；3.39(dd，1H，CH2’，3J＝5.5Hz，2J＝17.0Hz)。MS/LC：计算的MM＝321.2；m/z＝322.1(M+H)。
以类似于对(3S)-3-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)-3-氨基丙酸苄基酯的二盐酸盐所述的方式制备下列化合物：N-烷基化反应
通用方法：在质子性溶剂或非质子性溶剂，优选二氯甲烷或四氢呋喃中于20-50℃下用醛处理式(a)或(b)的游离胺1-15小时。所得亚胺然后用还原剂，优选三乙酰氧基硼氢化钠或氰基硼氢化钠，在有或没有酸如乙酸存在下于20-50℃的温度下还原0.2-5小时。通过加入水并萃取，然后在硅胶上进行快速色谱分离或通过结晶而分离N-烷基化的化合物。
(2S)-4-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2-[(3-噻吩基甲基)氨基]丁酸苄基酯的制备
将噻吩-3-甲醛(1ml；1eq.)加入游离碱形式的(2S)-2-氨基-4-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)丁酸苄基酯(3.6g；1eq.)在四氢呋喃(下文称为THF，40ml)中的溶液中。将混合物在约20℃下搅拌15小时并通过加入50ml四氢呋喃而稀释。然后加入NaBH(OAc)3(4.73g；2eq.)。在约20℃下搅拌1小时后，通过加入水(40ml)来停止反应，然后加入乙酸乙酯(100ml)。滗析并萃取后，用盐水洗涤合并的有机相，用硫酸钠干燥，然后在40℃下减压蒸发。在硅胶上进行快速色谱提纯(洗脱剂：乙酸乙酯/庚烷9∶1)得到黄色油状预期化合物(3.08g；66％产率)。NMR(1H，400MHz，CDCl3)：7.62-7.04(m，15H，芳族H，NH)；5.18(s，2H，OCH2)；3.87-3.69(AB，2H，CH2NH，2JAB＝13Hz)；3.38(dd，1H，CHNH，3J＝4.5Hz，2J＝8.5Hz)；2.98(m，1H，CH2CH)；2.88(m，1H，CH2CH)；2.17(m，1H，CH2)；1.97(m，1H，CH2)。MS/LC：计算的MM＝431.2；m/z＝432.2(M+H)；m/z＝430.8(M-H)。
以类似于对(2S)-4-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2-[(3-噻吩基甲基)氨基]丁酸苄基酯所述的方式制备下列化合物(呈两种对映体形式)：
在上式中，R3代表下列基团之一：乙内酰脲和乙内酰硫脲的制备
X＝O或S；n＝0
通用方法：
在有或没有叔碱如三乙胺或N，N-二异丙基乙胺存在下在非质子溶剂，优选四氢呋喃或二氯甲烷中于约20-60℃的温度下用通式R4-NCX(其中R4具有与通式(I)中相同的含义)的异氰酸酯或异硫氰酸酯处理其中m、R1、R2、R3和R5具有与通式(I)中相同的含义且O-GP基团为衍生于醇的隔离保护性基团且特别是苄氧基、甲氧基或叔丁氧基的式(II)胺1-24小时。所得乙内酰脲或乙内酰硫脲可以通过在硅胶上的快速色谱或通过向反应混合物中加入被聚合物如氨甲基聚苯乙烯树脂(购自Novabiochem)携带的亲核试剂，然后过滤并蒸发滤液而以60-95％的产率分离。
当R4代表包含伯氨基端基的基团(例如R4代表氨基乙基、氨基丙基等)时，该试剂不是R4-NCX而是其氨基被合适保护性基团如叔丁氧基羰基保护的对应化合物。因此必须进行随后的解保护步骤(在标准条件下进行，即酸处理)以得到通式(I)的化合物。
某些通式(III)的非市售异硫氰酸酯的制备：
这些化合物按如下制备：在非质子溶剂，优选四氢呋喃或二氯甲烷中于20-50℃用二硫化碳和N-环己基碳化二亚胺N-甲基聚苯乙烯树脂的混合物处理通式R4-NH2的伯胺1-18小时。在玻璃料上过滤并蒸发滤液后分离得到所得异硫氰酸酯。
6-异硫氰酸酯基-N，N-二甲基-1-己胺的制备
将二硫化碳(8.3ml；10eq)和N，N-二甲基-1，6-己二胺(2g；1eq)在THF(10ml)中的溶液依次滴加入N-环己基碳化二亚胺N-甲基聚苯乙烯树脂(7.8g；1.1eq；购自Novabiochem，负载量1.95mmol/g)在无水THF(120ml)中的悬浮液中。将该悬浮液在约20℃下搅拌2小时，然后在玻璃料上过滤。然后在40℃下减压浓缩滤液至干，以生产预期的异硫氰酸酯衍生物(2.6g；93％产率)。NMR(1H，400MHz，CDCl3)：3.50(t，2H)；2.24(t，2H)；2.20(s，6H)；1.68(q，2H)；1.50-1.31(m，6H)。
以类似于对6-异硫氰酸酯基-N，N-二甲基-1-己胺所述的方式制备下列化合物：
(5S)-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-(4-硝基苯基)-5-[2-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基]-2-硫代-4-咪唑啉酮的制备
将异硫氰酸4-硝基苯基酯(43mg；1.2eq.)加入(2S)-2-[(1H-吲哚-3-基甲基)氨基]-4-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)丁酸苄基酯(93mg；1eq.)在THF(2ml)中的溶液中。将该混合物在约20℃下搅拌2小时，然后用4mlTHF稀释。加入氨甲基聚苯乙烯树脂(购自Novabiochem，负载量3.2mmol/g，125mg，2eq.)，然后加入三乙胺(200微升)。将该混合物在约20℃下搅拌15小时，然后在玻璃料上过滤。在40℃下减压浓缩滤液至干(用二氯甲烷共蒸发对除去过量三乙胺是必要的)。通过在硅胶上进行快速色谱分离(洗脱剂：乙酸乙酯/庚烷9∶1)而提纯得到预期化合物(90mg；84％产率)。NMR(1H，400MHz，CDCl3)：8.24-7.09(m，17H，芳族H，NH)；5.88，4.64(AB，2H，CH2N，2JAB＝15Hz)；3.38(dd，1H，CH，3J＝3.0Hz，2J＝8.5Hz)；2.92(m，2H，CH2CH)；2.74(m，1H，CH2)；2.24(m，1H，CH2)。MS/LC：计算的MM＝536.2；m/z＝537.1(M+H)。
以类似于对(5S)-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-(4-硝基苯基)-5-[2-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基]-2-硫代-4-咪唑啉酮所述的方式(不同的是通过在硅胶上的快速色谱的最终提纯是任选的)制备下列化合物(呈
在上式中，R3代表下列基团之一：且R4代表下列基团之一：
(5S)-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-5-[2-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基]-3-[3-(三氟甲基)苯基]-2，4-咪唑烷二酮的制备
将异氰酸3-三氟甲基-苯基酯(11mg，1.2eq.)加入(2S)-2-[(1H-吲哚-3-基甲基)氨基]-4-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)丁酸苄基酯(23mg，1eq.)在2mlTHF中的溶液中。将该混合物在约20℃下搅拌2小时，然后用2mlTHF稀释。加入氨甲基聚苯乙烯树脂(购自Novabiochem，负载量3.2mmol/g，125mg，2eq.)，然后加入三乙胺(200微升)。将该混合物在约20℃下搅拌15小时，然后在玻璃料上过滤。在40℃下减压浓缩滤液至干(用二氯甲烷共蒸发对除去过量三乙胺是必要的)以生产出预期化合物(25mg；92％产率)。NMR(1H，400MHz，CDCl3)：7.75-6.99(m，17H，芳族H，NH)；5.25，4.44(AB，2H，CH2N，2JAB＝15Hz)；3.77(m，1H，CH)；2.92(m，2H，CH2CH)；2.88(m，1H，CH2CH)；2.72(m，1H，CH2)；2.17(m，1H，CH2)。MS/LC：计算的MM＝543.2；m/z＝544.2(M+H)。
以类似于对(5S)-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-5-[2-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)乙基]-3-[3-(三氟甲基)苯基]-2，4-咪唑烷二酮所述的方式制备下列化合物(呈两种对映体形式)：
在上式中，R3代表下列基团之一：且R4代表下列基团之一：二氢嘧啶-2，4-二酮和2-硫代-四氢-4嘧啶酮的制备X＝O或S；n＝1
通用方法：
在叔碱如三乙胺或N，N-二异丙基乙胺存在下在非质子溶剂，优选THF或二氯甲烷中于约20-70℃的温度下用异氰酸酯或异硫氰酸酯R4-NCX处理其中m、R1、R2、R3和R5具有与通式(I)中相同的含义且O-GP基团为衍生于醇的隔离保护性基团且特别是苄氧基、甲氧基或叔丁氧基的通式(IV)胺1-48小时。所得化合物可以通过在硅胶上的快速色谱或通过向反应混合物中加入被聚合物如氨甲基聚苯乙烯树脂(购自Novabiochem)携带的亲核试剂，然后过滤并蒸发滤液而以40-90％的产率分离。
当R4代表包含伯氨基端基的基团(例如R4代表氨基乙基、氨基丙基等)时，该试剂不是R4-NCX而是其氨基被合适保护性基团如叔丁氧基羰基保护的对应化合物。因此必须进行随后的解保护步骤(在标准条件下进行，即酸处理)以得到通式(I)的化合物。
(6S)-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-丙基-6-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2-硫代四氢-4(1H)-嘧啶酮的制备
将异硫氰酸丙基酯(25微升，1.2eq.)加入(3S)-3-[(1H-吲哚-3-基甲基)氨基]-3-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)丙酸苄基酯(90mg，1eq.)在2mlTHF中的溶液中。将该混合物在约40℃的温度下搅拌15小时，然后用2mlTHF稀释。加入氨甲基聚苯乙烯树脂(购自Novabiochem，负载量3.2mmol/g，125mg，2eq.)。将该混合物在约20℃下搅拌5小时，然后在玻璃料上过滤。在40℃下减压浓缩滤液。向残余物中加入1mlTHF和1ml三乙胺。然后在约40℃的温度下搅拌该混合物15小时，再在减压下浓缩。通过在硅胶上的快速色谱提纯(洗脱剂：乙酸乙酯/庚烷8∶2)得到预期化合物(72mg；82％产率)。NMR(1H，400MHz，CDCl3)：两种阻转异构体的混合物：8.69-6.45(m，12H，芳族H，NH)；6.42，4.89(AB，1H，CH2，JAB＝14.5Hz)；5.78，5.42(AB，1H，CH2，JAB＝14.5Hz)；4.99(m，1H，CH)；4.41-4.36(m，1H，CH2)；4.20-4.11(m，1H，CH2)；3.49，2.94(AB，1H，CH2CO，JAB＝16Hz)；3.28，2.80(AB，1H，CH2CO，JAB＝16Hz)；1.52(m，1H，CH2)；1.40(m，1H，CH2)；0.76，0.62(2m，3H，CH3)。MS/LC：计算的MM＝443.2；m/z＝444.2(M+H)。
以类似于对(6S)-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-丙基-6-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)-2-硫代四氢-4(1H)-嘧啶酮所述的方式(不同的是通过在硅胶上的快速色谱的最终提纯是任选的)制备下列化合物(呈两种对映体形式)：
在上式中，R3代表下列基团之一：且R4代表下列基团之一：
(6S)-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-6-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)二氢-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮的制备
将异氰酸4-甲氧基苯基酯(40微升，1.2eq.)加入(3S)-3-[(1H-吲哚-3-基甲基)氨基]-3-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)丙酸苄基酯(100mg，1eq.)在THF(2ml)中的溶液中。将该混合物在约20℃的温度下搅拌5小时，然后用2mlTHF稀释。加入氨甲基聚苯乙烯树脂(购自Novabiochem，负载量3.2mmol/g，138mg，2eq.)。将该混合物在约20℃下搅拌3小时，然后在玻璃料上过滤。在40℃下减压浓缩滤液。向残余物中加入2mlTHF和2ml三乙胺。将该混合物回流24小时，然后减压浓缩。通过在硅胶上的快速色谱提纯残余物(洗脱剂：乙酸乙酯/庚烷8∶2)得到预期化合物(80mg；74％产率)。NMR(1H，400MHz，CDCl3)：两种阻转异构体的混合物：9.67-8.96(2s，1H，NH)；8.49(s，1H，NH)；5.15，4.36(AB，1H，CH2，JAB＝15Hz)；5.08，4.69(AB，1H，CH2，JAB＝15Hz)；4.67，4.57(2m，1H，CH)；3.72(s，3H，OCH3)；3.29-2.79(m，2H，CH2CO)。MS/LC：计算的MM＝491.2；m/z＝492.3(M+H)。
以类似于对(6S)-1-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-(4-甲氧基苯基)-6-(4-苯基-1H-咪唑-2-基)二氢-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮所述的方式(不同的是通过在硅胶上的快速色谱的最终提纯是任选的)制备下列化合物(呈两种对映体形式)：
在上式中，R3代表下列基团之一：且R4代表下列基团之一：
实施例
根据上述合成方法制备的实施例示于下表中。这些实施例用于说明上述方法且决不应被认为是对本发明范围的限制。
用于化合物表征的分析方法
所得化合物根据其保留时间(rt)和质谱(MH+)来表征。
质谱
对于质谱，使用装备有电雾化源的单四极质谱仪(Micromass，平台模型)，在50％波谷下分辨率为0.8Da。
在质量80和1000Da之间每月用呈在异丙醇/水混合物(1/1Vol.)中的溶液形式的碘化钠和碘化铷的校准混合物进行校准。
高效液相色谱法(HPLC)
对于液相色谱，使用包括在线脱气装置、四元泵、柱加热炉和二极管阵列UV检测器的HPLC HP1100系统(Hewlett-Packard)。
根据实施例使用不同的洗脱条件：
—条件(i)：
洗脱剂： A 水+0.04％三氟乙酸
B 乙腈 T(min) A％ B％ 0 100 0 1 100 0 8 30 70 10 30 70
流速： 1.1ml/min
注射： 5微升
柱子： Uptisphere ODS 3微米33*4.6mmi.d.
温度： 40℃
—条件(ii)
洗脱剂： A 水+0.04％三氟乙酸
B 乙腈 T(min) A％ B％ 0 90 10 6 15 85 10 15 85
流速： 1ml/min
注射： 5微升
柱子： Uptisphere ODS 3微米50*4.6mmi.d.
温度： 40℃
洗脱条件(i)用于实施例1-479、560-572和733-1040的表征。条件(ii)用于实施例480-559、573-732和1041-1234。对于所有实施例在220nm波长下进行UV检测。
本发明化合物的药理性质
按照下述操作，能够并且已经测试了本发明化合物对不同亚型的生长激素释放抑制因子受体的亲和性。
对人生长激素释放抑制因子受体亚型的亲和性研究：
通过测量对[125I-Tyr11]SRIF-14与转染CHO-K1细胞结合的抑制作用，测定本发明化合物对生长激素释放抑制因子受体1至5亚型(分别为sst1、sst2、sst3、sst4和sst5)的亲和性。
已经克隆了人生长激素释放抑制因子sst1受体基因的基因组片段。加入接头Bg1II，修饰含有100bp非转录的5’区、完整的1.17Kb编码区和230bp非转录的3’区的1.5Kb PstI-XmnI区段。将所得DNA片段亚克隆在pCMV-81的BamHI位点，目的是制得哺乳动物中的表达质粒(由Dr.Graeme Bell，Univ.Chicago提供)。利用磷酸钙共沉淀法，通过在CHO-K1细胞(ATCC)中转染，得到以稳定方式表达sst1受体的克隆细胞系。包括质粒pRSV-neo(ATCC)作为选择标记物。在含有0.5mg/ml G418(Gibco)的RPMI1640培养基中选择克隆细胞系，然后在培养物中进行循环克隆和增殖。
人生长激素释放抑制因子sst2受体基因是由Dr.G.Bell(Univ.ofChicago)提供的，以1.7Kb BamHI-HindIII的DNA基因组片段的形式分离并亚克隆在质粒载体pGEM3Z(Promega)中。在适合质粒pCMV5的内切核酸酶限制位点中插入1.7Kb BamH1-HindII片段，构建哺乳动物细胞的表达载体。利用磷酸钙共沉淀法，通过在CHO-K1细胞中转染，得到克隆细胞系。包括质粒pRSV-neo作为选择标记物。
分离sst3受体的基因组片段，在2.4Kb BamHI/HindIII片段中含有完整的编码序列。在末端修饰和加入EcoR1接头之后，在载体pCMV的EcoR1位点插入2.0Kb NcoI-HindIII片段，构建哺乳动物中的表达质粒pCMV-h3。利用磷酸钙共沉淀法，通过在CHO-K1细胞(ATCC)中转染，得到以稳定方式表达sst3受体的克隆细胞系。包括质粒pRSV-neo(ATCC)作为选择标记物。在含有0.5mg/ml G418(Gibco)的RPMI 1640培养基中选择克隆细胞系，然后在培养物中进行循环克隆和增殖。
人sst4受体的表达质粒pCMV-HX是由Dr.Graeme Bell(Univ.Chicago)提供的。该载体含有编码1.4Kb NheI-NheI、456pb非转录的5’区和200pb非转录的3’区的人sst4受体的基因组片段，将其克隆在PCMV-HX的XbaI/EcoR1位点中。利用磷酸钙共沉淀法，通过在CHO-K1细胞(ATCC)中转染，得到以稳定方式表达sst4受体的克隆细胞系。包括质粒pRSV-neo(ATCC)作为选择标记物。在含有0.5mg/mlG418(Gibco)的RPMI 1640培养基中选择克隆细胞系，然后在培养物中进行循环克隆和增殖。
使用基因组λ克隆作为探针，通过PCR法得到相当于人sst5受体的基因，它是由Dr.Graeme Bell(Univ.Chicago)提供的。所得1.2Kb PCR片段含有21个碱基对非转录的5’区、完整的编码区和55pb非转录的3’区。在质粒pBSSK(+)的EcoR1位点插入克隆。回收插入物的1.2KbHindIII-XbaI片段形式，用于亚克隆在哺乳动物中的表达载体pCVM5中。利用磷酸钙共沉淀法，通过在CHO-K1细胞(ATCC)中转染，得到以稳定方式表达sst5受体的克隆细胞系。包括质粒pRSV-neo(ATCC)作为选择标记物。在含有0.5mg/ml G418(Gibco)的RPMI 1640培养基中选择克隆细胞系，然后在培养物中进行循环克隆和增殖。
将以稳定方式表达人sst受体的CHO-K1细胞培养在含有10％胎牛血清和0.4mg/ml遗传霉素的RPMI 1640培养基中。用0.5mM EDTA收集细胞，在大约4℃下以500g离心大约5分钟。将沉积物再次悬浮在pH 7.4的Tris 50mM中，在大约4℃下以500g二次离心大约5分钟。通过超声处理使细胞溶解，然后在4℃下以39000g离心大约10分钟。将沉积物再次悬浮在相同的缓冲液中，在大约4℃下以50000g离心大约10分钟，将所得沉积物中的膜贮存在-80℃下。
在96-孔聚丙烯板中进行与[125I-Tyr11]SRIF-14结合的竞争性抑制实验，一式二份。在含有BSA 0.2％、MgCl2 5mM、抑肽酶(Trasylol)200KIU/ml、杆菌肽(bacitricin)0.02mg/ml、苯甲基磺酰氟0.02mg/ml的HEPES 50mM缓冲液(pH 7.4)中，在大约37℃下，将细胞膜(10μg蛋白质/孔)与[125I-Tyr11]SRIF-14(0.05nM)一起温育大约60分钟。
利用Filtermate 196(Packard)，立即通过预先浸渍有0.1％聚乙烯亚胺(P.E.I.)的GF/C玻璃纤维滤板(Unifilter，Packard)过滤，将游离[125I-Tyr11]SRIF-14与结合的[125I-Tyr11]SRIF-14分离。将滤板用大约0-4℃的50mM HEPES缓冲液洗涤大约4秒钟，利用计数器(Packard TopCount)测定它们的放射性。
从总的结合中减去非特异性结合(在0.1μM SRIF-14的存在下测定)，得到特异性结合。用计算机辅助非线性回归分析(MDL)分析有关结合的数据，测定抑制常数(Ki)的值。
利用下述试验进行本发明化合物的激动剂或拮抗剂特性测定。
功能试验：对细胞内cAMP产生的抑制作用
在24-孔平板中，将表达人生长激素释放抑制因子受体亚型的CHO-K1细胞(SRIF-14)培养在含有10％胎牛血清和0.4mg/ml遗传霉素的RPMI 1640培养基中。在实验前一天改变培养基。
将比率为105个细胞/孔的细胞用0.5ml新的包含0.2％BSA的RPMI培养基洗涤两次，用0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)结束反应，在大约37℃下培养大约5分钟。
在大约37℃下加入1mM福斯高林(FSK)达15-30分钟，刺激环状AMP的产生。
同时加入FSK(1μM)、SRIF-14(10-12M至10-6M)和供试化合物(10-10M至10-5M)，测量激动剂化合物对生长激素释放抑制因子的抑制效果。
同时加入FSK(1μM)、SRIF-14(1至10nM)和供试化合物(10-10M至10-5M)，测量化合物的拮抗效果。
排除反应介质，加入200ml 0.1N HCl。通过放射免疫试验(FlashPlateSMP001A试剂盒，New England Nuclear)测量cAMP的量。
结果：
按照上述方案所进行的试验已经证明，在本申请中所定义的通式(I)化合物对至少一种亚型的生长激素释放抑制因子受体具有良好的亲和性，对于某些示例性化合物，具体为下表I和II所示化合物，抑制常数Ki低于微摩尔。
表I
表II