本发明涉及用以转化植物的DNA重组技术的用途，其办法是对除莠剂进行解毒以将除莠剂耐性授予植物。更具体地说，本发明涉及DNA重组分子的构建及其用途，此DNA分子包括谷胱甘肽S转移酶（GST）基因，它在植物中表达后增加植物中GST的酶活性。 GST（EC2.5.1.18）是一类在非生物合成有机物解毒中所涉及的酶。这些酶普遍存在于大多数活的生物体中，这些生物体包括微生物、植物、昆虫和动物。这类酶中每种GST酶的性质是不同的，然而这类酶又的确呈现某种重迭的底物专一性，参见I.Arias和W.Jakoby（Raven Press，New York，1976）所编《谷胱甘肽：代谢及功能》中，Jakoby等人“鼠谷胱甘肽S-转移酶：结合及其物理性质;Reddy等人“不同个体羊肝GST的纯化和性质”，Archives of Biochem.and Biophys.，224：87-101，1983。
在GST的这些功能中，人们特别感兴趣的是GST在谷胱甘肽与亲电子化合物的结合中所起的催化作用（Phytochemistry，21：2771-2781，1982，H.Rennenberg“高等植物中谷胱甘肽的代谢及其可能的生物学作用”;Meister和Tate“谷胱甘肽及其相应的ρ-谷氨酰化合物：生物合成和利用”，Ann.Rev.Biochem.，45：560-604，1976）。很多非生物合成有机物（包括除莠剂、杀虫剂和杀菌剂）都是亲电子化合物。在谷胱甘肽与化合物的亲电中心的连接中，谷胱甘肽的巯基与化合物的亲电中心反应。谷胱甘肽是作为一种亲核试剂与亲电化合物连接而起作用的。该连接是靠专一的GST酶催化地（Rennenberg，同上）。
对植物而言，此反应非常重要，因为它提供了非生物合成有机物的解毒机理。这种亲电子的非生物合成有机物的结合作用使它具有水溶性并因此对于植物是无毒的。
因此，最好是利用遗传工程技术增加谷胱甘肽S-转移酶在所说植物中的活性水平来培育一类除莠剂耐性植物。采用此法，即可能将除莠剂耐性授予植物。
本发明涉及DNA重组分子，它通过生产使除莠剂解毒的蛋白质将除莠剂耐性授予植物。已知的解毒作用的机理包括：GST催化的谷胱甘肽与亲电子化合物的结合、D-氨基酸与2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）的结合、磺酰脲的羟基化及其与碳水化合物的结合。更具体地说，本发明涉及用DNA重组分子转化的一类除莠剂耐性植物，该DNA分子编码的酶能使除莠剂解毒。确切地讲，本发明还涉及所说的DNA重组分子，它包括编码谷胱甘肽S-转移酶多肽的基因顺序，还涉及谷胱甘肽S-转移酶活性水平增加的、耐除莠剂的转移基因的植物细胞。本发明中，所说植物细胞是用谷胱甘肽S-转移酶基因转化的，它在表达或超表达后使植物具有除莠剂耐性。
本发明还涉及由此转化的植物细胞和其种子再生的植株，及其由此转移基因的植物细胞再生的植物的后代，包括突变体及变种的后代。
本发明还涉及嵌合基因构建体，该构建体含有谷胱甘肽S-转移酶基因、克隆载体和宿主，以及将除莠剂耐性授予植物的方法。
附图简介：
图1示出了测定Yb200的pGTR200cDNA插段顺序的战略，它是鼠肝谷胱甘肽S-转移酶基因。
图2所示为质粒pCIB710（一种大肠杆菌复制子），它包括CaMV35SDNA的转录启动子、终止子及外加的多聚腺苷酸信号。
图3所示为质粒pCIB12（一种大肠杆菌复制子）的构建，它所含的嵌合基因包括CaMV35S启动子（它与鼠谷胱甘肽S-转移酶cDNA基因相连接）、Yb200及CaMV终止子。
图4A为质粒pCIB14（一种广宿主复制子）的构建，它在T-DNA边界中含有两个嵌合基因，嵌合基因中含有CaMV35S启动子，它与鼠肝谷胱甘肽S-转移酶基因、Yb200、CaMV终止子及卡那霉素抗性基因、nos-neo-nos等相连接。
图4B所示为部分克隆通过活体重组方法的结合。
图4C为部分克隆通过体外连接法的结合。
图5所示为无转移基因的烟草叶片的典型的荧光诱导模型。所示上部曲线为叶片已吸收10-5M莠去津48小时后的情形，下部曲线为仅用缓冲液抑制后的情形。
图6所示为pCIB14转移基因的烟草叶片吸收10-5M莠去津48小时后荧光诱导的模型。该图表明了三类反应：（Ⅰ）对莠去津无解毒作用，顶部曲线;（Ⅱ）对莠去津的解毒作用明显，最下面的曲线;（Ⅲ）有一定程度的解毒作用，中间的曲线。
图7：pCIB5的构建。
图7b：pCIB4的构建。
图7c：pCIB2的构建。
图7d/e：pCIB10的构建。
图7f/g：pCIB10a的构建。
在下面的详细描述中，在DNA重组和植物遗传技术中使用了许多术语。为了对本说明书及权利要求有一个清楚一致的了解，下面将对这些术语予以定义，并给出其涉及的范围。
异源基因或DNA：编码某一特定产物、一类产物或生物功能的DNA顺序，它不是从要将此基因导入其中的种而是从其它的种得到的。也称为外源基因或DNA。
同源基因或DNA：编码某一特定产物、一类产物或生物功能的DNA顺序，它是从要将此基因导入其中的同种中得到的。
植物启动子：DNA表达的控制顺序，它在植物中可使有效地连接在这种启动子上的任何同源或异源DNA基因顺序引起转录。
大量生产的植物启动子（OPP）：一种植物启动子，它在转移基因的植物细胞中能使任何与之有效地连接的一个或多个功能遗传顺序的表达比未用OPP转化的宿主细胞中可自然观察到的水平高得多（由mRNA或多肽数量测定）。
谷胱甘肽S-转移酶：该酶的这种定义是功能性的，包括能在需要的给定植物中催化谷胱甘肽和亲电子化合物结合的所有GST。因此该术语不仅包括基因转化中所涉及的某类特定植物的此种酶，只要它们能在转移基因的植物细胞中起作用，则该术语也可包括来自其它种类植物或微生物或哺乳动物细胞的GST。术语GST包括比天然的GST要长或短的氨基酸顺序，如GST的功能性杂交的或部分的片段，或它们的类似物。
植物：植物界的任何光合成员，其特征是与膜结合的核、组成染色体的遗传物质、结合在膜上的细胞质细胞器及进行减数分裂的能力。
植物细胞：植物的结构和生理功能单位，由原生质体和细胞壁构成。
植物组织：组成某结构和功能单位的一群植物细胞。
植物器官：植物中各种肉眼可见的分化部分，如根、茎、叶或胚。
本发明涉及通过对除莠剂解毒将除莠剂耐性授予植物的DNA重组分子。已知的解毒作用机理包括：磺酰脲的羟基化和与碳水化合物的结合（Hutchison等人，Pesticide Biochem.and Physiol.，22：243-249，1984）、D-氨基酸与2，4-D的结合（Davidonis等人，Plant Physiol.，70：357-360，1982）及谷胱甘肽S-转移酶催化的谷胱甘肽与亲电化合物的结合。
更确切地说，本发明涉及用一种DNA重组分子转化的除莠剂耐性植物，该DNA重组分子编码一种使除莠剂解毒的酶。具体地说，本发明还涉及包含编码谷胱甘肽S-转移酶多肽的基因顺序的DNA重组分子、具有除莠剂耐性的转移基因的植物细胞和谷胱甘肽S-转移酶活性水平有所增加的植物。此类含谷胱甘肽的植物细胞和植物是用谷胱甘肽S-转移酶基因转化的，它在所说植物细胞和植株中表达后增加GST酶活性水平并且将除莠剂耐性授予植物。本发明在改进这些植物时使用遗传工程技术。
本说明书中所用术语“除莠剂耐性植物”定义为在除莠剂的常规的有效剂量下仍活着的植物，而且最好能正常生长。本发明植物的除莠剂耐性是指植物中的解毒作用机理，而除莠剂的结合或施用部位仍然是敏感的。抗性是能获得的最大的耐性。
应将解毒作用与另一种授予除莠剂耐性的机理相区别，另一种机理是指改变除莠剂结合或施用部位使之对除莠剂不再敏感。而在本发明中，虽然除莠剂的结合部位仍是敏感的，但决没有除莠剂结合在上面，因为除莠剂被例如GST酶解毒了。因此，由于通过例如增加GST酶活性水平而对除莠剂的解毒作用，所以本文所用术语“除莠剂耐性”包括除莠剂耐性及抗性两方面的含义。在某些对除莠剂敏感的植物的生长或活力是致死性的或有害的除莠剂存在下，本发明的除莠剂耐性植物能够不受损伤地存活。
本发明涉及的除莠剂包括所有那些能通过如与植物谷胱甘肽或类似物或同源谷胱甘肽（尤其是任何一种亲电化合物）形成结合物被解毒的除莠剂。那些具有氯基的除莠剂是本发明所特别感兴趣的。本发明所涉及的除莠剂包括但并不限于：莠去津（包括氯三嗪）、乙酰胺（包括氯乙腈）、磺酰脲、咪唑啉酮、硫代氨基甲酸酯、氯代硝基苯、二苯醚等。莠去津、草不绿、二苯基硫代氨基甲酸S-乙酯及二苯醚则是其中典型的例子。参见《Herbicide Resistance in Plants》（H.LeBaron and J.Gressel编，1982）。
某些除莠剂对于抑制光合作用特别有效。Frear等人，Phytochemistry，9：2123-2132，1970（氯三嗪）;Frear等人，Pesticide Biochem.and Physiol.，20：299-310（二苯醚）;Lay等人，Pesticide Biochem.and Physiol.，6：422-456，1976（硫代氨基甲酸酯）;Frear等人，Pesticide Biochem.and Physiol.，23：56-65，1985（赛克津）。对于氨基酸的生物合成还需其它的钝化酶。
虽然用“除莠剂”这个术语来描述这些化合物，但这个术语用在这儿不是作为限制的。例如，施用于植物的许多杀虫剂和杀菌剂（如抑制病害、寄生虫及捕食动物）对于植物活力有不利影响。植物通过叶、茎或通过根系从土壤中将这些杀虫剂或杀菌剂吸收入组织内。然而，有很多非生物合成有机物是亲电子化合物，它们通过谷胱甘肽转移酶活性催化的反应与谷胱甘肽结合。这些非生物合成有机物也在本发明的范围之列。
在本发明的一个具体方案中，所涉及的一类除莠剂是致敏物，即为GST酶活性的抑制剂。这些致敏物通过形成GST-致敏物结合物而抑制内源解毒作用机理。将除莠剂及致敏物（如tridiphane）施用于植物则将抑制谷胱甘肽和除莠剂的酶促连接。Ezra等人“Tridipbane as a Synergist for Herbicides in Corn（Zea mays）and Proso Millet（Panicum miliaceum），Weed Science，33：287-290，1985。
这样，在本发明中，采用遗传工程技术将GST酶活性或将增加的GST酶活性水平授予植物则使此转移基因的植物对于诸如tridiphane之类的致敏物更具耐性和抗性。因此，根据本发明，可将致敏物和除莠剂结合起来施用于除莠剂敏感的植物，并同时施用于除莠剂耐性植物。在典型情况下，致敏物和除莠剂合并起来使用对于除莠剂敏感的植物是有毒的，但对于转移基因的耐性植物则是无毒的。
含有谷胱甘肽或其类似物如同源谷胱甘肽的任何植物，以及能用遗传工程技术进行遗传操作的任何植物可用于本发明。转移基因的植物也应当能够表达GST基因。本说明书中所用术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、能通过培养诱导以形成植株、植物愈伤组织、植物团块的植物组织培养物及在植物或植株器官中完整的植物细胞。“植物”也包括可用遗传工程技术转化的花粉。
在典型的情况下，植物的亚细胞室中谷胱甘肽的浓度最高。在植物质体中的谷胱甘肽浓度最高，尤其是在叶绿体中（Rennenberg，H.，Phytochemistry，21：2771-2781，1982）。谷胱甘肽具有γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸结构。在某些植物中得到了谷胱甘肽的同源物（同源谷胱甘肽），它的结构为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-β-丙氨酸（Carnegie，P.，Biochem.J.，89：459-471，1963及Carnegie，P.，Biochem.J.，89：471-478，1963）。植物谷胱甘肽或同源谷胱甘肽的含量不同。例如有几种豆科作物主要含同源谷胱甘肽，而另一些豆科作物则主要含谷胱甘肽。典型的情况是，植物中如果主要含有同源谷胱甘肽或谷胱甘肽中的一种，则另一种的含量减少（Rennenberg，同上）。
本发明采用的谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因编码区可与植物细胞或转化植物是同源或不同源的。然而，在所得到的植物细胞中必须表达编码GST的遗传顺序，产生功能酶或多肽。因此，本发明包括含有表达此GST酶的同源或不同源的GST基因的植物。而且，不同源的GST可来自其它种的植物，或来自不同界的生物，如微生物或哺乳动物。
正如前面所述，GST酶是一类具有多功能的酶。因此，必须选择催化谷胱甘肽和亲核化合物结合的GST基因。由于GST的识别底物是谷胱甘肽，所以在现有技术中，还不知道在转化植物中专一于谷胱甘肽结合的GST酶是否接受同源谷胱甘肽。Frear等人，Phytochemistry，9：2123-2132，1970（指出谷胱甘肽S-转移酶专一于还原型谷胱甘肽）。通过底物专一性的测定，可将专一于谷胱甘肽的必要的GST酶从各种不同的谷胱甘肽S-转移酶中鉴别和选择出来。一种典型的分析方法是，采用亲和层析法鉴别专一于谷胱甘肽的GST（Tu等人，Biochem.and Biophys.Res.Comm.，108：461-467，1982;Tu等人，J.Biol.Chem.，258：4659-4662，1983;Jakoby等人，《谷胱甘肽：代谢及功能》，Raven Press，New York，1976）。
在本发明的一个具体方案中，GST包括与被转化的植物是同源的植物GST。而在本发明的另一实施方案中，GST则包括与被转化的植物是不同源的植物GST。GST含量丰富的植物包括玉米和高粱。在本发明的另一方案中，GST包括哺乳动物的GST。哺乳动物GST为已知的GST，并在下述文献中有记载：Reddy等人，Archives of Biochem.and Biophys.，224：87-101，1983（绵羊肝）;Tu等人，J.Biol.Chem.，258：4659-4662，1983（鼠组织：心、肾、肝、肺、脾和睾丸）。优选的GST基因包括鼠肝GST基因的编码区，尤其是实例IA中所述的Yb200及实例IB中所述的完整的Yb187。本发明的另一具体方案包括有鼠脑GST的编码区，尤其是实例IE中所述的cDNA克隆G1Yb。然而，其它已知的GST基因也可用于本发明。参见Mannervik，B.，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.，57：357-417，1985，此文列在本文中以供参考。
谷胱甘肽S-转移酶的DNA编码顺序可完全由基因组DNA或cDNA构建而成。另外，DNA顺序也可是cDNA和基因组DNA杂交的构建体，在此情形下，此cDNA可由和基因组DNA相同的基因所产生，或者cDNA和基因组DNA来自不同的基因。在上述任一情形中，基因组DNA和/或cDNA可单独由同一基因或不同基因所构建。如果DNA顺序包括来自不止一种基因的片段，则此基因片段可全部来自同一生物;来自同一属的一个以上的菌株、品种或种;或来自相同界或不同界的不止一个属的生物。
可用本技术领域的已知方法将多个DNA顺序片段连接在一起以形成完整的谷胱甘肽S-转移酶编码顺序。一些合适的方法有：在活体内具有同源区的DNA片段的重组，在离体中连接合适的限制性片段。
本发明的上位概念包括多种具体实施方案。在一个具体方案中，本发明所包含的嵌合基因顺序包括：
a）编码谷胱甘肽S-转移酶多肽的第一基因顺序，它在给定的植物细胞中表达后能产生谷胱甘肽S-转移酶活性;
b）有效地连接在GST编码区任一端的一个或多个另外的基因顺序。这些另外的基因顺序包括启动子和/或终止子区。植物调节顺序对其宿主细胞可以是不同源或同源的。
能诱导GST编码区表达的任何启动子和终止子都可用于此嵌合基因顺序。一些合适的例子有来自胭脂碱合成酶（nos）、章鱼碱合成酶（ocs）及花椰菜花叶病毒（CaMV）基因的启动子或终止子。
可使用的一类植物启动子是大量生产的植物启动子。这类启动子与GST基因顺序进行有效的连接后，能够启动所说的GST的表达，这样由于存在有GST酶活性或增加了GST酶活性水平而使转化植物具有除莠剂耐性。在本发明中可使用的大量生产的植物启动子包括大豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基（SS）的启动子（Berry-Lowe等人，J.Molecular and appl.Gen.，1：483-498，1982），和叶绿素a/b结合蛋白的启动子。已知这两种启动子在真核植物细胞中能进行光诱导生成（参见《植物遗传工程：农业前景》，A.Cashmore，Plenum，New York，1983，29-38页;Coruzzi G.等人，The J.Biol.Chem.，258：1399，1983;Dunsmuir，P.等人，J.Molecular and Appl.Gen.，2：285，1983）。
含有与植物启动子相连的谷胱甘肽S-转移酶基因的嵌合基因顺序能连接到合适的克隆载体中。一般而言，使用含有由与宿主细胞相容的种产生的复制和控制顺序的质粒或病毒（噬菌体）载体。典型的情况是，克隆载体应带有复制起点，以及能在转化的宿主细胞中提供表现型选择标记的除莠剂抗性。可在宿主细胞转化后通过这些表现型标记来选择转化载体。
在本发明中可使用的宿主细胞包括原核生物，包括细菌宿主如根癌土壤杆菌（A.tumefaciens）、大肠杆菌、S.typimurium.灵杆菌（Serratia macescens）和氰细菌等。也可使用真核宿主细胞如酵母、丝状真菌和植物细胞等。
本发明中的克隆载体和用此载体转化的宿主细胞一般是用以增加此载体的拷贝数目的。随着拷贝数的增加，可以分离含此GST基因的载体，并用于将嵌合遗传顺序导入植物细胞中。
可用本领域的已知方法将DNA导入宿主细胞中。例如，将细胞用氯化钙处理后，可转化细菌宿主细胞。
可使细胞原生质体与DNA直接接触而将DNA导入植物细胞。另外，也可使细胞与病毒接触或与土壤杆菌接触而将DNA导入植物细胞。与病毒和土壤杆菌接触可通过侵染敏感的植物细胞或将植物细胞原生质体与土壤杆菌一起培养来实现。这些方法下面还将予以更详细的讨论。
将DNA直接导入植物细胞的方法很多，例如，可用微量吸管直接将载体中所含的遗传物质微量注射入植物细胞，从而机械地转移重组DNA。也可用聚乙二醇处理原生质体后将遗传物质转移入植物原生质体中（Paszkowski等人，EMBO J.，3：2717-22，1984）。
在本发明的另一个具体方案中，用电穿孔技术（electroporation）将GST基因导入植物细胞中（Shillito等人，Biotechnology，3：1099-1103，1985;Fromm等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：5824，1985）。在此技术中，在含有GST基因构建体的质粒的存在下对植物原生质体施行电穿孔。高电场强度所形成的电脉冲可逆地使生物膜具有可透性，从而将质粒导入其中。经电穿孔的植物原生质体再形成细胞壁，进行分裂并形成植物愈伤组织。使用上述的表型标记可以选择能够表达GST酶的转移基因的植物细胞。
也可用花椰菜花叶病毒（CaMV）作为载体将GST基因引入本发明的植物细胞中（Hohn等人，《植物肿瘤的分子生物学》，Academic Press，New York，1982，549-560页;Howell，美国专利4，407，956）。将整个CaMV DNA基因组插入亲本细菌质粒中，产生能在细菌中增殖的DNA重组分子。用限制性酶随机地或在重组质粒中病毒区的单个非活力位点将此重组质粒切开，如在蚜虫传递性基因处，用来插入GST基因顺序。也可插入具有单个限制位点的小的寡核苷酸（称为连接子）。使修饰过的重组质粒再进行克隆，并通过将GST遗传顺序导入单个限制位点以进行进一步修饰。将重组质粒中修饰过的病毒片段从亲本细菌质粒上切割下来，用于接种植物细胞或植物。
将GST基因导入细胞的另一方法是用用GST基因转化的根癌土壤杆菌侵染植物细胞。在本技术领域的已知的合适条件下，使此转移基因的植物细胞生长以形成芽和根，并进一步发育成植物。用根癌土壤杆菌Ti质粒可将GST基因顺序导入合适的植物细胞中（Decleene等人，Bot.Rev.，47：147-194，1981;Bot.Rev.，42：389-466，1976）。借助根癌土壤杆菌的侵染，将Ti质粒传递给植物细胞并稳定地整合进植物基因组中（Horsch等人，Science，233：496-498，1984;Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：4803，1983）。
对于那些对根癌土壤杆菌侵染不敏感的植物的细胞，可将根癌土壤杆菌同相应的原生质体进行共培养。
Ti质粒含有两个对于产生转化细胞来说是重要的区域。将其中之一的转移DNA（T-DNA）区转运给植物并诱导形成肿瘤。另一区为侵染区（Vir），它对形成肿瘤很重要，但对肿瘤维持来说并不重要。GST基因顺序的插入使转移DNA区的大小有所增加，但其转运能力并不受到影响。通过除去引起肿瘤的基因使转移基因的植物细胞成为不形成肿瘤的细胞，并加上选择标记，则可用此修饰过的Ti质粒作为载体将本发明的基因构建体转入适当的植物细胞中。
Vir区使T-DNA区从土壤杆菌转入植物基因组中，不管T-DNA区和Vir区是在土壤杆菌的同一载体或不同载体上。染色体上的侵染区也将T-DNA从载体诱导入植物细胞中。
将T-DNA区从土壤杆菌转入植物细胞的优选系统在一个载体上含有侵染区，但它不是含有T-DNA区的载体。这类体系称为双载体系统，含T-DNA的载体称为双载体。
能被转入植物细胞并使转化细胞能被选择的含T-DNA的任何载体均适用于本发明。优先选用的载体由启动子、编码顺序和pCIB10构成。
使T-DNA区从土壤杆菌转运到植物细胞中的任何含有侵染区的载体都可用于本发明。含有侵染区的优选载体是pCIB542。
用本发明的DNA转化的植物细胞或植株都可通过存在于DNA中的GST基因以外的合适的表型标记所选择。这些表型标记包括但不限于：抗菌素抗性标记（如卡那霉素和潮霉素基因）或除莠剂抗性标记。其它的表型标记为本技术领域所公知，这些公知的表型标记也可用于本发明。
可将DNA直接插入细胞或与土壤杆菌接触而转化并再生为完整植株的任何植物都适用于本发明的方法，从而产生含GST基因的转移基因的完整植物。越来越多的证据表明差不多所有植物都可由培养的细胞或组织所再生，这包括但不限于：所有主要的禾谷类作物、甘蔗、糖用甜菜、棉花、水果及其它树木、豆科植物和蔬菜等。
在本发明范围之内所包括的其它作物如下述两组植物，第一组植物有：草莓属、百脉根属、苜蓿属、驴喜豆属、三叶草属、葫芦巴属、豇豆属、柑桔属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜属、芥子属、颠茄属、辣椒属、曼陀罗属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、矮牵牛属、毛地黄属、茉乔栾那属、菊巨属、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天门冬属、金鱼草属、萱草属、龙面花属、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛莨属、千里光属、蛾蝶花属、瓜属、Browallia、大豆属、黑麦草属、玉米属、小麦属和高粱属等;第二组植物有：番薯属、西番莲属、仙客来属、苹果属、李属、蔷薇属、悬钩子属、杨属、檀香属、葱属、百合属、水仙属、梨属、花生属、菜豆属和豌豆属等。
对于所有这些植物能否为土壤杆菌所转化目前了解的知识还有限。即使那些不是土壤杆菌天然宿主的植物也可进行离体转化。例如单子叶植物，尤其是禾谷类作物（Creals和grasses）不是土壤杆菌的天然宿主。越来越多的证据表明土壤杆菌可以转化某些单子叶植物。利用一些目前已经可行的新的实验手段，禾谷类作物是可以转化的（Grimsley，N.等人，Nature，325：177-179，1987）。
从培养原生质体再生植物在下述文献中均有记载：Evans等人“原生质体分离和培养”，见于《植物细胞培养手册》，1：124-176，Macmillan Publishing Co.New York，1983;M.R.Davey，“植物原生质体培养和再生的最新进展”，Protoplasts，1983-Lecture Proceedings，19-29页，Birkhauser，Basel，1983;P.J.Dale“禾谷类和其它抗拒作物的原生质体培养和植株再生”，Protoplasts，1983-Lecture Proceedings，31-41页，Birkhauser，Basel，1983;H.Binding“植株再生”，Plant Protoplasts;21-37，CRC Press，Boca Raton，1985。
不同种类的植物的再生是不同的，但一般是首先产生含多拷贝GST基因的转化的原生质体、细胞或组织的悬浮液，再由此悬浮液诱导胚的形成，并使之象天然胚胎一样发育到成熟期并发芽。培养基中一般含有各种氨基酸和激素，如植物生长激素和细胞激动素。在培养基中加入谷氨酸和脯氨酸也有许多好处，尤其对于如玉米和苜蓿这类作物更是如此。根和芽一般同时发育。高效率的再生由培养基、基因型和培养史所决定。如将这三种可变因素予以控制，则其再生可充分再现和重复。
某些适用于本发明的植物有如：百叶根属、苜蓿属、驴喜豆属、三叶草属、葫芦巴属、柑桔属、亚麻属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥属、芸苔属、萝卜属、芥子属、颠茄属、辣椒属、曼陀罗属、天仙子属、番茄属、烟草属、茄属、矮牵牛属、茉乔栾那属、菊巨属、向日葵属、莴苣属、天门冬属、金鱼草属、黍属、狼尾草属、毛莨属、蛾蝶花属、大豆属、棉属、苹果属、李属、蔷薇属、杨属、葱属、百合属、水仙属、梨属、花生属、菜豆属、豌豆属。
既然发现水稻能由原生质体再生为完整植株，再生其它属于禾本科的植物也应是可能的。因此下面的植物也可用于本发明：黑麦草属、玉米属、小麦属、高粱属及雀麦属。
本发明优选的植物是烟草属植物（如烟草）、大豆属植物（尤其是Glycine max大豆）、棉属植物（棉花）。
使转化的植物细胞生长成熟并进行自花传粉以产生种子，其中一部分含有增加GST酶活性水平的基因，这部分种子的比例完全遵从确立的遗传定律。这些种子能生长成具有除莠剂耐性的植物。可以测定这些种子的除莠剂耐性，例如使这些种子生长在含除莠剂的土壤中。另外，也可通过将除莠剂施用于植物来测定转化植物的除莠剂耐性。
通过重复的自花授粉的除莠剂耐性植物的自交，即可生产纯合株系。可用这些自交系发展除莠剂耐性的杂交体，即将某一除莠剂耐性的自交系与另一自交系杂交则能生产出除莠剂抗性的杂种。
如果从再生植株获得的花、种子、叶、枝及果实等器官含有除莠剂耐性细胞的话，则本发明也包括这些器官。再生植物的后代（包括杂种后代）、变种及突变型也在本发明的范围之内。
如前所述，GST基因构建体在制备具有除莠剂耐性的植物细胞、器官、组织及植株的过程中可作为中间体用在载体中。
本发明植物的除莠剂耐性的重要性是明显的。这样的植物可使农民在种植除莠剂耐性作物并处理田地杂草时不对作物产生有害的影响。而且，除莠剂耐性植物使农民可以在已经用除莠剂处理过的田地上种植作物，如使天然具有除莠剂耐性的作物与天然具有除莠剂敏感性的作物进行轮作时就是这种情况。这些用除莠剂处理过的田地的土壤中含有一定量的除莠剂残存物。对于除莠剂天然敏感的轮作作物可能为这些除莠剂残存物所损伤，除非使它们具有除莠剂耐性（Sheets，T.，Residue Reviews，32：287-310，1970;Burnside等人，Weed Seience，19：290-293，1971）。
例如，农民一般交替地种植玉米和大豆作物。玉米对于某些除莠剂具有天然耐性，如某些三嗪除莠剂（例如莠去津），用除莠剂处理这些玉米地后，再在这些地上种植比较敏感的大豆则会使其受到损害。利用本发明的除莠剂耐性植物则可避免除莠剂残存物的损害。Fink等人，Weed Science，17：35-36，1969（大豆）;Khan等人，Weed Research，21：9-12，1981（燕麦和梯牧草植物）;Brinkman等人，Crop Science，20：185-189，1980（燕麦）;Eckert等人，J.Range Mgmt.，25：219-224，1972（葡匐冰草）。
本发明还包括一种控制植物的方法，该方法包括使如杂草等对除莠剂敏感的植物和本发明的除莠剂耐性植物组成的混合群体与抑制植物量（足以抑制对除莠剂敏感的植物）的除莠剂接触。这样，在既有除莠剂耐性植物又有对除莠剂敏感的杂草的田地里用除莠剂处理植物叶片是属于本发明的一种方法，在处理时，这两个类型的植物同时与除莠剂接触。
如前所述，本发明也包括抑制植物的方法，该方法包括将除莠剂和致敏物同时施用于耐除莠剂的植物和对除莠剂敏感的植物。
术语“抑制植物的除莠剂量”就其功能而言包括，所说除莠剂的量是指能影响给定植物的生长或发育的量。所以这个量可以足够小，小到仅仅是阻止或抑制其生长或发育，或也可以足够大，大到足以不可逆地破坏敏感性植物。
除莠剂的实际用量既取决于除莠剂，又取决于要被抑制的植物。例如，常常采用浓度在0.5和1.5Kg/公顷之间的除莠剂抑制双子叶植物和杂草。对于单子叶植物，除莠剂的典型浓度在0.5Kg/公顷和约2.0Kg/公顷之间。已知某些除莠剂如磺酰脲抑制植物的用量比例是十分低的。
当然，可用众所周知的喷雾、撒布方法使除莠剂与适当的植物接触。例如，现有技术中用莠去津抑制杂草所采用的叶片处理法可用来处理属于本发明范围之内的莠去津耐性植物。
至此，对本发明已作了总的介绍，参考具体的实例对本发明将会有更好地了解，但是这些实例仅仅是为了说明而决非作限制之用，除非另有说明。
实例
下述各实例的步骤一般可在Maniatis等人《分子克隆》（冷泉港实验室，1982）这一文献中查到。除非另有说明，所有的酶都能从New England生物实验室获得。并且，除非另有说明，都按制造厂商的介绍进行使用。
实例IA GST cDNA克隆Yb200的分离
抗体
按Tu等人Nucleic Acids Res.，10：5407-5419，1982所述的方法产生抗同源的鼠肝谷胱甘肽S-转移酶（GST）的抗血清（亲和层析组分）。此IgG组分经蛋白质A-Sepharose（Pharmacia）柱纯化并用超滤（Amicon，XM-50膜）浓缩，所用方法如Kraus和Rosenberg所述（Krausand Rosenberg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：4015-4019，1982）。于-18℃下将其贮存于50%甘油和0.2mg肝素/ml中。
多核糖体的分离
将两只雄性Sprague-Dawley鼠（体重约300g）的肝（约26克）用Potter-Elvehiem匀浆器匀浆，匀浆液为50mM Tris-Hcl，pH7.5、25mM Mgcl2、0.25M蔗糖、并含有膨润土1mg/ml、肝素（0.2mg/ml）和放线菌酮（1μg/ml）（最终体积为150ml），等分成几份使之匀浆成15%的溶液（重量/体积）。完全按上述Kraus和Rosenberg介绍的步骤分离多核糖体。此产品在透析前后分别为1389A260单位和1208A260单位。
多核糖体-抗体复合物的固定及特异mRNA的洗脱
用抗GST IgG（7.1mg）进行免疫吸附来回收1130A260单位的多核糖体。按上述Kraus和Rosenberg所述方法进行蛋白质A-Sepharose亲和层析并洗脱结合的RNA。将洗脱的RNA立即调节至0.5M Nacl及0.5%十二烷基磺酸钠，并用多聚（dT）-纤维素柱进一步纯化（Aviv和Leder，Proc.Natl.Acal.Sci.USA，69：1048-1412，1972;Bantle等人，Anal.Biochem.，72：413-417，1976）。进行cDNA合成前对纯化的多聚（A+）RNA用离体转译和免疫沉淀法进行测定（Tu等人，Nucleic Acids Res.，10：5407-5419，1982;Pelham和Jackson，Eur.J.Biochem.，67：247-256，1976）。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离此免疫沉淀物质，并通过荧光谱法进行观察（Laemmli，Nature，227：680-684，1970;Swanstrom和Shenk，Anal.Biochem.，86：184-192，1978）。
GST cDNA克隆的分离
按文献中报道的方法合成cDNA（Okayama和Berg，Mol.Cell Biol.，2：161-170，1982），该方法被Gubler和Hoffman（Gene，25：263-269，1983）作了一些小的改动。从免疫沉淀的多聚核糖体得到的约100-500ng多聚（A+）用于cDNA的合成。于下述物质组成的40微升溶液中将mRNA逆转录成cDNA：50mM Tris-Hcl pH8.3、100mM Nacl、10mM Mgcl2、10mM DTT、4mM焦磷酸钠、1.25mM四种dNTP、1800U/ml RNA sin（Promega Biotec）、100μg/ml寡聚（dT）12-18（Pharmacia/PL）、3000U/ml逆转录酶（Molecular Genetics产品）。
将此反应于43℃下保温25分钟，再加入2μl 0.5M EDTA终止反应。反应产物用1体积由苯酚：氯仿组成的溶液进行萃取，水相用1/2体积的氯仿反萃，有机相用TE缓冲液反萃。
于合并的水相中加入1体积的4M醋酸铵，再加入2体积乙醇以沉淀核酸，在干冰上冷却20-30分钟。然后，使溶液加热到室温保持5分钟，再于4℃下用Eppendrof微离心机离心15分钟，所得沉淀溶解在25μl TE缓冲液中。加入乙酸铵（25μl，4M）和乙醇100μl，按上述方法沉淀并回收核酸。用70%乙醇洗涤沉淀物，干燥后溶于20μl水中。
于50μl含下述物质的溶液中置换mRNA：cDNA杂交体中的mRNA链：20mM Tris-Hcl pH7.5、5mM氯化镁、10mM硫酸铵、100mM Kcl、0.15mMβ-NAD、0.04mM四种dNTP、20μl第一链产品、10-20微居32P-dATP、10U/ml大肠杆菌DNA连接酶（New England生物实验室）、230U/ml DNA多聚酶（Boehringer Mannheim）和8.5U/ml大肠杆菌RNAse H（Pharmacia/PL）。于12-14℃下将此反应保温90分钟，然后于室温下保温1小时。双股cDNA用苯酚∶氯仿进行萃取而纯化，然后完全按如第一股产品的方法用乙醇沉淀进行回收。最后的干的沉淀物溶解在20μl水中。
在总体积为20μl含下述物质的溶液中对10μl的双股cDNA用dCTP接尾：100mM卡可酸钾（pH7.0）、1mM CoCl2、0.2mM DTT、0.1mM dCTP和500U/ml末端脱氧核苷酸转移酶（Pharmacia/PL）。于37℃保温1-2分钟后，向其中加入20μl4mM EDTA，然后于65℃下保温10分钟使酶失活。
将PstI降解的加有dG尾的pBR322（Bethesda Research Labs，Inc.）按约1∶1摩尔的比例加到具dc尾的双股cDNA中（按载体的分子量计，约超过cDNA估计量的5-10倍）。于10mM Tris-Hcl pH7.5、1mM EDTA和150mM NaCl存在下，将此DNA溶液（cDNA+载体）稀释到最终总DNA浓度为0.5-2.0ng/μl（最佳为0.5）。于65℃下将此混合物保温5分钟，然后于55-58℃下将此DNA退火90分钟。
按每200μl转化感受态细胞用5μl DNA的比例将此退火的cDNA：载体转化到大肠杆菌菌株MM294中（Hanahan J.Mol.Biol.，155：557-580，1983）;控制的转化频率为1-2×108转化株/μg共价闭环pBR322DNA。转化的细胞在含17μg/ml四环素（无镁）的LM平板上培养（Hanahan，同上）。测试所得菌落对于氨必西林的敏感性。将抗四环素而对氨必西林敏感（约50%）的菌落挑出来以供进一步分析。
pGTR200的体外的杂交体选择转译
质粒DNA用碱性溶胞步骤从354个氨必西林敏感转化株中纯化（Birnboim和Doly，Nucleic Acids Res.，7：1513-1523，1979），用Pstl消化这些DNA来测定cDNA插段的大小。用琼脂凝胶电泳分析，其中，134个含有可见的cDNA插段。插段大于800核苷酸的再用Southern印迹法杂交（Southern，J.Mol.Biol.，98：503-517，1975），用Ya（pGTR261）和Yc（pGTR262）作探针（Lai等人，J.Biol.Chem.，359：5536-5542，1984;Tu等人，J.Biol.Chem.，259：9434-9439，1984），以进行进一步分析。
用体外杂交体选择转译进一步确定未与这些探针杂交的12个克隆的特征（Cleveland等人，Cell，20：95-105，1980）。其中之一的阴性克隆被命名为pGTR200。于75℃和100℃下，洗脱由固定于活化的氨基苯基硫醚纤维素（ATP纸）上的pGTR200DNA选择的鼠肝多聚（A+）RNA，并用于在兔网组织红细胞溶菌体系中进行的体外转译。此体外转译产物用抗所有鼠肝GST的抗血清进行免疫沉淀，然后进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。此免疫沉淀产物具有Yb的迁移率，没有其它类型的GST亚基为pGIR200所选择出来。前面用Ya和Yc克隆进行的体外杂交选择转译实验中没有表现出任何Yb亚基产物（Lai等人，同上;Tu等人，同上）。
pGTR200cDNA插段的核苷酸顺序
按图1的战略，用Maxam和Gilbere介绍的化学法测定pGTR200中的cDNA的DNA顺序（Maxam和Gilbert，Methods Enzymol.，65：499-560，1980）。由各种限制性内切酶的作用而生成的DNA片段在3′端进行标记。每一测定至少重复一次。
此核苷酸顺序列于下面。用氨基酸的单字母符号表示218个残基的开放式阅读框（Old和Primrose，《基因操作原理》，1985，Blackwell′s Publications，London，P.346）。附加的多聚腺苷酸信号AATAAA下面用线条标出。
实例IB 部分GST cDNA克隆Yb187的分离
按照基本上相同的操作步骤，得到了cDNA克隆Yb187。
Yb187是在编码顺序的5′端缺少96个核苷酸的部分cDNA克隆。这种核苷酸和96个缺失核苷酸及Yb187的相应氨基酸顺序给出如下。
10 30
ATG CCT ATG ACA CTG GGT TAC TGG GAC ATC CGT GGG CTG GCT CAC
Met Pro Met Thr Leu Gly Tyr Trp Asp Ile Arg Gly Leu Ala His
50 70 90
GCC ATT CGC CTG TTC CTG GAG TAT ACA GAC ACA AGC TAT GAG GAC
Ala Ile Arg Leu Phe Leu Glu Tyr Thr Asp Thr Ser Tyr Glu Asp
1 10 13 0
AAG AAG TAC AGC ATG GGG GAT GCT CCC GAC TAT GAC AGA AGC CAG
Lys Lys Tyr Ser Met Gly Asp Ala Pro Asp Tyr Asp Arg Ser Gln
150 1 70
TGG CTG AGT GAG AAG TTC AAA CTG GGC CTG GAC TTC CCC AAT CTG
Trp Leu Ser Glu Lys Phe Lys Leu Gly Leu Asp Phe Pro Asn Leu
19 0 210
CCC TAC TTA ATT GAT GGG TCA CAC AAG ATC ACC CAG AGC AAT GCC
Pro Tyr Leu Ile Asp Gly Ser His Lys Ile Thr Gln Ser Asn Ala
2 30 25 0 270
ATC CTG CGC TAC CTT GGC CGG AAG CAC AAC CTT TGT GGG GAG ACA
Ile Leu Arg Tyr Leu Gly Arg Lys His Asn Leu Cys Gly Glu Thr
2 90 31 0
GAG GAG GAG AGG ATT CGT GTG GAC GTT TTG GAG AAC CAG GCT ATG
Glu Glu Glu Arg Ile Arg Val Asp Val Leu Glu Asn Gln Ala Met
330 3 50
GAC ACC CGC CTA CAG TTG GCC ATG GTC TGC TAC AGC CCT GAC TTT
Asp Thr Arg Leu Gln Leu Ala Met Val Cys Tyr Ser Pro Asp Phe
37 0 390
GAG AGA AAG AAG CCA GAG TAC TTA GAG GGT CTC CCT GAG AAG ATG
Glu Arg Lys Lys Pro Glu Tyr Leu Glu Gly Leu Pro Glu Lys Met
4 10 43 0 450
AAG CTT TAC TCC GAA TTC CTG GGC AAG CAG CCA TGG TTT GCA GGG
Lys Leu Tyr Ser Glu Phe Leu Gly Lys Gln Pro Trp Phe Ala Gly
4 70 49 0
AAC AAG ATT ACG TAT GTG GAT TTT CTT GTT TAC GAT GTC CTT GAT
Asn Lys Ile Thr Tyr Val Asp Phe Leu Val Tyr Asp Val Leu Asp
510 5 30
CAA CAC CGT ATA TTT GAA CCC AAG TGC CTG GAC GCC TTC CCA AAC
Gln His Arg Ile Phe Glu Pro Lys Cys Leu Asp Ala Phe Pro Asn
55 0 570
CTG AAG GAC TTC GTG GCT CGG TTT GAG GGC CTG AAG AAG ATA TCT
Leu Lys Asp Phe Val Ala Arg Phe Glu Gly Leu Lys Lys Ile Ser
5 90 61 0 630
GAC TAC ATG AAG AGC GGC CGC TTC CTC TCC AAG CCA ATC TTT GCA
Asp Tyr Met Lys Ser Gly Arg Phe Leu Ser Lys Pro Ile Phe Ala
6 50
AAG ATG GCC TTT TGG AAC CCA AAG TAG
Lys Met Ala Phe Trp Asn Pro Lys End
实例IC 相当于Yb187的完全克隆
利用体内重组或离体连接适当的限制性片段的方法，将缺失的核苷酸加到Yb187上。这些方法分别在图4B和4C中得到详细说明。
利用在大肠杆菌SR43菌株（ATCC67217，1986年9月22日寄存）中导入携带在ColEl质粒（如pUC8或pBR322）上的基因组DNA克隆和携带在incPl质粒（如pRK290）上的cDNA克隆，可以进行重组。菌株SR34带有polAl supF183突变（Tacon，W.，和Sherratt，D.，Mol.Gen.Genet.，147：331-335，1976），以致于ColEl质粒的复制在限制性温度下（42℃）被抑制。将含有这两种质粒的SR34细菌由许可温度（28℃）转向42℃，并对由ColEl质粒带有的抗菌素抗性（如pBR322的Ap抗性）进行选择，则可以选择出含有两种质粒之整合形式的细菌。这种整合质粒是在DNA同源区通过重组形成的。分离整合质粒，可以以单个PstⅠ或BamHⅠ片段的形式克隆全长度的cDNA顺序和上游基因组DNA。用Bal31切除上游DNA，然后加入BamHⅠ连接子，可以分离出含有全长度编码区的克隆（经DNA顺序分析证明）。
如同实例IA中所述，为了转移到植物细胞，将全长度编码区以BamHⅠ片段的形式克隆到pCIB710中。按照以下实例Ⅳ中所述的那样，为了在大肠杆菌中表达，把这种相同的片段克隆到pDR540中。
或者通过把cDNA的适当的限制性片段和基因组克隆连接起来，可以构建相当于Yb187的完整克隆（图1）。含有以PstⅠ-HindⅢ片段插入的基因组克隆之5′端的质粒pUC19，大约含有最初400碱基的编码顺序。cDNA编码顺序的3′端可以630碱基的HinfⅠ片段从pBR325中的部分cDNA克隆中分离出来。将pUC质粒在其单个的HinfⅠ位点切开，并使之与含有基因3′端的HinfⅠ片段连在一起，则可重建GST基因的完全的编码顺序。将此完整基因以BglⅠ-PstⅠ片段分离出来。用Bal31切除上游DNA，然后加入BamHⅠ连接子，可以分离全长度编码区而无上游顺序。按上述方法，把这种BamHⅠ片段插入pCIB710中和pDR540中。
实例ID 杂交克隆
按照与上面使用异源基因作为两种DNA片段的来源结合部分cDNA克隆Yb187和缺失核苷酸（实例IC）基本相同的方法，构建由不同基因的编码顺序衍生出来的杂交克隆。
实例IE GST-cDNA克隆GlYb的分离
按照前述的方法（见实例IA），在噬菌体表达载体λgtll（Young，R.A.和Davis，R.W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：1194，1980）中用从鼠脑中分离的多聚（A）RNA建立cDNA文库。借助于抗体筛选法，用抗鼠脑GST的抗体分离cDNA。按照已有技术中介绍的方法，例如Young和Davis所述的方法（Young，R.A.和Davis，R.W.，Science，222：778-782，1983），完成RNA的分离和相应的cDNA的构建和分离。
所得到的cDNA克隆GlYb的核苷酸和相应的氨基酸顺序给出如下。
10 30
A GAC CCC AGC ACC ATG CCC ATG ACA CTG GGT TAC TGG GAC ATC
Met Pro Met Thr Leu Gly Tyr Trp Asp Ile
50 70
CGT GGG CTA GCG CAT GCC ATC CGC CTG CTC CTG GAA TAC ACA GAC
Arg Gly Leu Ala His Ala Ile Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Thr Asp
90 11 0 130
TCG AGC TAT GAG GAG AAG AGA TAC ACC ATG GGA GAC GCT CCC GAC
Ser Ser Tyr Glu Glu Lys Arg Tyr Thr Met Gly Asp Ala Pro Asp
1 50 17 0
TTT GAC AGA AGC CAG TGG CTG AAT GAG AAG TTC AAA CTG GGC CTG
Phe Asp Arg Ser Gln Trp Leu Asn Glu Lys Phe Lys Leu Gly Leu
190 2 10
GAC TTC CCC AAT CTG CCC TAC TTA ATT GAT GGA TCA CAC AAG ATC
Asp Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Leu Ile Asp Gly Ser His Lys Ile
23 0 250 2
ACC CAG AGC AAT GCC ATC CTG CGC TAT CTT GGC CGC AAG CAC AAC
Thr Gln Ser Asn Ala Ile Leu Arg Tyr Leu Gly Arg Lys His Asn
70 29 0 310
CTG TGT GGG GAG ACA GAA GAG GAG AGG ATT CGT GTG GAC ATT CTG
Leu Cys Gly Glu Thr Glu Glu Glu Arg Ile Arg Val Asp Ile Leu
3 30 35 0
GAG AAT CAG CTC ATG GAC AAC CGC ATG GTG CTG GCG AGA CTT TGC
Glu Asn Gln Leu Met Asp Asn Arg Met Val Leu Ala Arg Leu Cys
370 3 90
TAT AAC CCT GAC TTT GAG AAG CTG AAG CCA GGG TAC CTG GAG CAA
Tyr Asn Pro Asp Phe Glu Lys Leu Lys Pro Gly Tyr Leu Glu Gln
41 0 430 4
CTG CCT GGA ATG ATG CGG CTT TAC TCC GAG TTC CTG GGC AAG CGG
Leu Pro Gly Met Met Arg Leu Tyr Ser Glu Phe Leu Gly Lys Arg
50 47 0 490
CCA TGG TTT GCA GGG GAC AAG ATC ACC TTT GTG GAT TTC ATT GCT
Pro Trp Phe Ala Gly Asp Lys Ile Thr Phe Val Asp Phe Ile Ala
5 10 53 0
TAC GAT GTT CTT GAG AGG AAC CAA GTG TTT GAG GCC ACG TGC CTG
Tyr Asp Val Leu Glu Arg Asn Gln Val Phe Glu Ala Thr Cys Leu
550 5 70
GAC GCG TTC CCA AAC CTG AAG GAT TTC ATA GCG CGC TTT GAG GGC
Asp Ala Phe Pro Asn Leu Lys Asp Phe Ile Ala Arg Phe Glu Gly
59 0 610 6
CTG AAG AAG ATC TCC GAC TAC ATG AAG TCC AGC CGC TTC CTC CCA
Leu Lys Lys Ile Ser Asp Tyr Met Lys Ser Ser Arg Phe Leu Pro
30 65 0 670
AGA CCT CTG TTC ACA AAG ATG GCT ATT TGG GGC AGC AAG TAG GAC
Arg Pro Leu Phe Thr Lys Met Ala Ile Trp Gly Ser Lys End Asp
6 90 71 0
CCT GAC AGG TGG GCT TTA GGA GAA AGA TAC CAA ATC TCC TGG GTT
Pro Asp Arg Trp Ala Leu Gly Glu Arg Tyr Gln Ile Ser Trp Val
730 7 50
TGC CAA GAG CCC TAA GGA GCG GGC AGG ATT CCT GAG CCC CAG AGC
Cys Gln Glu Pro End Gly Ala Gly Arg Ile Pro Glu Pro Gln Ser
77 0 790 8
CAT GTT TTC TTC CTT CCT TCC ATT CCA GTC CCC AAG CCT TAC CAG
His Val Phe Phe Leu Pro Ser Ile Pro Val Pro Lys Pro Tyr Gln
10 83 0 850
CTC TCA TTT TTT GGT CAT CAA ATT CCT GCC AAA CAC AGG CTC TTA
Leu Ser Phe Phe Gly His Gln Ile Pro Ala Lys His Arg Leu Leu
8 70 89 0
AAA GCC CTA GCA ACT CCT TTC CAT TAG CAA AAT AGC CTT CTA AAG
Lys Ala Leu Ala Thr Pro Phe His End Gln Asn Ser Leu Leu Lys
910 9 30
TTA AAG TGC CCC GCC CCC ACC CCT CGA GCT CAT GTG ATT GGA TAG
Leu Lys Cys Pro Ala Pro Thr Pro Arg Ala His Val Ile Gly End
95 0 970 9
TTG GCT CCC AAC ATG TGA TTA TTT TGG GCA GGT CAG GCT CCC CGG
Leu Ala Pro Asn Met End Leu Phe Trp Ala Gly Gln Ala Pro Arg
90 101 0 1 030
CAG ATG GGG TCT ATC TGG AGA CAG TAG ATT GCT AGC AGC TTT GAC
Gln Met Gly Ser Ile Trp Arg Gln End Ile Ala Ser Ser Phe Asp
10 50 107 0
CAC CGT AGC CAA GCC CCT CTT CTT GCT GTT TCC CGA GAC TAG CTA
His Arg Ser Gln Ala Pro Leu Leu Ala Val Ser Arg Asp End Leu
1 090 11 10
TGA GCA AGG TGT GCT GTG TCC CCA GCA CTT GTC ACT GCC TCT GTA
End Ala Arg Cys Ala Val Ser Pro Ala Leu Val Thr Ala Ser Val
113 0 1 150 11
ACC CGC TCC TAC CGC TCT TTC TTC CTG CTG CTG TGA GCT GTA CCT
Thr Arg Ser Tyr Arg Ser Phe Phe Leu Leu Leu End Ala Val Pro
70 119 0 1 210
CCT GAC CAC AAA CCA GAA TAA ATC ATT CTC CCC TTA AAA AAA AAA
Pro Asp His Lys Pro Glu End Ile Ile Leu Pro Leu Lys Lys Lys
AAA AAA AAA A
Lys Lys Lys
实例Ⅱ
质粒pCIB710的构建
质粒pLW111（ATCC40235）由花椰菜花叶病毒（CaMV）的BJI菌株之三种较小的EcoRⅠ片段构成（Franck等，Cell，21：285-294，1980），将它克隆到pMB9中。用BglⅡ消化pLM111，分离1149bp片段（碱基对6494-7643）。将这种片段连接到pUC19的BamHⅠ位点上。这种限制性片段编码了CaMV35SRNA的启动子和多聚A的附加信号（即终止子）的转录。
离体诱变
通过离体诱变，把单个BamHⅠ位点插入这种启动子和终止子之间。合成一种与CaMV顺序相同的36碱基寡核苷酸，只是在该区域的顺序中，在碱基对7464处插入了BamHⅠ限制性位点。
将由上面得到的1149bp BglⅡ片段克隆到M13mp19中，并分离出单链噬菌体DNA。用合成的寡核苷酸使此单链DNA退火，使用该寡核苷酸作为引物合成一种新链;把这种DNA转染到大肠杆菌JM101菌株中（Zoller和Smith，DNA，3：479-488，1980）。按照Zoller和Smith（同上）所述方法，分离具有插入之BamHⅠ位点的M13噬菌体。
所需的突变型噬菌体的选择
通过激酶用32P-ATP标记36碱基寡核苷酸。在硝化纤维素滤器上定位一组转染的M13噬菌体的噬菌斑。使此滤器与标记的36聚合体杂交，并在增高的温度下洗涤此滤器。在较高的洗涤温度下，连接在突变型噬菌体上的标记的36聚合体保持稳定。分离在较高温度下稳定的这些噬菌体之一，然后进行序列测定以证实BamHⅠ位点的存在。
pCIB710的构建
用HindⅢ和EcoRⅠ消化由这种噬菌体中分离出来的双链DNA。用HindⅢ和EcoRⅠ切开pUC19。连接这两种消化过的DNA。通过氨苄青霉素抗性选择转化体。由这种连接得到的一种转化体是pCIB710。这种质粒示于图2中。
实例Ⅲ
质粒pCIB11、pCIB12、pCIB13和pCIB14的构建
1.用HaeⅡ、PstⅠ和PvuⅡ消化质粒pGTR200，自琼脂糖胶中分离包含GST编码顺序的678bp的HaeⅡ/PstⅠ片段。
2.通过用T4DNA聚合酶处理，使这种HaeⅡ/PstⅠ片段具有平整末端，并且用T4DNA连接酶把BamHⅠ连接子（dCGGATCCG-New England生物实验室）连接在所说的平整末端上。
3.质粒pCIB710用BamHⅠ切开并用小牛肠碱性磷酯酶（Boehringer Mannheim）处理。
4.使自上述得到的BamHⅠ连接的GST片段连接在用BamHⅠ消化的pCIB710上，使这种连接混合物转移到大肠杆菌HB101菌株中，根据氨苄青霉素抗性选择出所需的转化体。鉴别出对于CaMV启动子转录具有适当取向（pCIB12）和相反取向（pCIB11）GST的编码顺序的转化体。
5.用XbaⅠ和EcoRⅠ消化质粒pCIB10（见实例Ⅳ）。
6.用XbaⅠ和EcoRⅠ消化质粒pCIB12，自琼脂糖凝胶分离小片段。
7.把分出的XbaⅠ/EcoRⅠ片段（带有嵌合基因）连接在消化过的pCIB10上，将这种连接体转化到大肠杆菌HB101中，按卡那霉素抗性选择出转化体。这些转化体的GST编码顺序在CaMV启动子转录的适当取向上，它们被称为pCIB14（图3）。
8.按类似方法处理质粒pCIB11以构建pCIB13，这种质粒的GST编码顺序在适于CaMV启动子转录的相反取向上。pCIB13和pCIB14导入土壤杆菌中
利用转化作用，把pCIB13或pCIB14已纯化的质粒DNA导入带pCIB52（见下面的实例Ⅶ）的根癌土壤杆菌A136中（Watson等，J.Bacteriol.，123：255-264，1975）。在卡那霉素（50μg/ml）和壮观霉素（25μg/ml）上选择转化体。
实例Ⅳ 在trp-lac表达载体中插入Yb200GST基因
用BamHⅠ消化质粒pCIB12，分离具有Bam连接子的708bp的GST基因片段。用BamHⅠ消化质粒pDR540（Pharmacia P-LBiochemicals产品）（一种trp-lac表达载体）（Russel，D.R.和Bennet，G.N.，Gene，20：231-243，1982），并将GST片段连接进去。把形成的重组质粒转化到大肠杆菌JM103中。在合适的时间加入1.0mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），以诱导所得到的菌株培养物。
用IPTG诱导并在GST Yb200基因表达之后，通过离心沉淀细菌宿主细胞。把形成的沉淀重新悬浮于59ml0.2M Tris-Hcl（pH8.0）和1mM EDTA中。在此悬浮液中，加入0.5ml100mM苯甲磺酰氟（PMSF）的乙醇液和5ml 10mg/ml溶菌酶缓冲液。37℃下培养此悬浮液约15分钟，直到细菌细胞溶胞为止。使溶胞后的细菌细胞悬浮液离心沉淀并收集上清液。使上清液相对于含1/100体积PMSF的25mM Tris-Hcl（pH8.0）透析。
分析透析过的上清液中的GST酶活性。然后，把透析过的上清液以0.5ml/分的流速加到S-己基谷胱甘肽琼脂糖亲和柱中。用25mM Tris-Hcl，0.2M Kcl洗涤柱，直至280nm处吸收小于0.005为止。未结合的全部物质从柱中洗出之后，用25mM Tris-Hcl、含5mMS-己基谷胱甘肽的0.2M Kcl（pH8.0）以及2.5mM谷胱甘肽洗脱结合的物质。在280nm处监测洗脱组分的吸收值。使可能含有纯化酶的那些组分单独对含PEG的0.1M Na3PO4（pH6.5）透析，以浓缩所说的组分，然后在不含PEG的同样缓冲液中透析。
记下每个透析过的组分的体积。计算每个组分的浓缩程度和样品量，然后进行稀释，使每个组分中相对于起始组分含有同样的量。分析每个组分的酶活性。
使用1-氯-2，4-二硝基苯（CIDNB）作为底物分析GST活性。对于每种反应来说，在5mM还原型谷胱甘肽（30.8mg/ml，在0.1M磷酸钠缓冲液中，pH6.5）和GST酶中加入1mM CIDNB（20.2mg/ml的乙醇液）。CIDNB和还原型谷胱甘肽是每天新制备的。反应的最终总体积为1ml。反应在室温下进行，以CIDNB的加入作为起始。用Gilford分光光度计在340nm处监测此反应。典型的反应包含10-50单位的GST，这里1个单位相当于在每毫升中每分钟内有1个毫微摩尔的底物被转化。
测定起始物质中酶活性组分的蛋白质浓度（Biorad，BSA标准）。在15%Laemmli凝胶上，用稀释的标准酶（1.0、0.3和0.1μg）作为定量标准，分别每一个酶活性组分。使用专一性抗体通过免疫印迹法检测纯化的酶。
实例Ⅴ pCIB10和pCIB10a的构建
在1985年7月19日提交的题为“质体和线粒体的转化”的、通常叫作待批申请的757098号申请中，描述了质粒pCIB10和pCIB10a的构建，此申请被列为本文的参考文献。采用上面引用的专利申请中描述和编号如下的下列步骤构建这些质粒（图7a至7g）。
pCIB10的构建
15.从pBR325（EcoRⅠ29）中分离含有pTiT37左边界的T-DNA片段（Yadav等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：6322，1982）。用EcoRⅠ切断pBR325并用HindⅢ连接子（New England Biolabs）连接所说的1.1Kb片段。
16.用HindⅢ切开质粒pBR322（Bolivar等，Gene，2：75）。
17.把含有步骤15中所述片段的左边界连接到HindⅢ消化过的pBR322中。
18.用ClaⅠ和HindⅢ消化步骤17中含有左边界的pBR322质粒，分离1.1Kb HindⅢ/ClaⅠ片段（Hepburn等，J.Mol.Appl.Genet.，2：211，1983）。
19.用HindⅢ和EcoRⅠ切开质粒pUC18（Norrander等，Gene，26：101，1983）;用T4多核苷酸激酶和r32P-dATP标记60bp多聚连接子的末端，并在丙烯酰胺凝胶中进行分离。
20.用EcoRⅠ和ClaⅠ切开质粒pBR322，分离大片段。
21.将60bp HindⅢ/EcoRⅠ多聚连接子和EcoRⅠ29的1.1Kb HindⅢ/ClaⅠ片段连接在用ClaⅠ和EcoRⅠ切开的pBR322中，从而构建成pCIB5（见图7a步骤15-21）。
22.赋予卡那霉素抗性的嵌合基因（nos-neo-nos）由Bin6中以SalⅠ/EcoRⅠ片段的形式取出（Bevan，NucleicAcids Res.，12：8711，1984）。
23.用EcoRⅠ和SalⅠ切开质粒pUC18。
24.将由步骤22得到的含有嵌合基因的SalⅠ/EcoRⅠ片段连接到用EcoRⅠ/SalⅠ切开的pUC18中。
25.借助于用BamHⅠ切开，用T4 DNA聚合酶充填和连接等步骤，破坏此嵌合基因终止顺序中的BamHⅠ识别位点。
26.用SstⅡ（Bethesda研究室）和HindⅢ切开得到的质粒。
27.通过用HindⅢ和SstⅡ切开pBR325（Hind23）及分离1.0Kb片段，来分离含有nos启动子5′部分和pTiT37右边界的片段。
28.把这种1.0Kb HindⅢ/SstⅡ片段连接到步骤26中限制性酶解的pUC18上，从而构建成pCIB4（见图7b步骤22-28）。
29.用AatⅡ切开含有T-DNA左边界的pCIB5，用T4 DNA聚合酶处理使之有平整末端，然后用EcoRⅠ切开。
30.pCIB4用HindⅢ切开，通过用大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段处理使之平整，并且用EcoRⅠ切开。
31.使步骤29中受限制性酶解的pCIB5与受限制性酶解的pCIB4（步骤30）连接，以构建pCIB2，一种含有位于嵌合的卡那霉素抗性基因和多聚连接子侧面的T-DNA左右边界的ColEl复制子（见图7C步骤29-31）。
32.质粒pRZ102（Jorgensen等，Mol.Gen.Genet.，177：65，1979）用BamHⅠ消化，用Klenow填平。
33.用AluⅠ使质粒pA03（Oka，J.Mol.Biol.，174：217，1981）进行部分消化。
34.把AluⅠ消化物连接到上面步骤32的受限制性酶解的pRZ102上，按照卡那霉素抗性选择所需的转化体。
35.所得到的质粒含有存在于1.05Kb BamHⅠ片段中的Tn903的编码顺序，用BamHⅠ消化后将它分离出来。用Klenow DNA聚合酶处理这种片段。
36.从圣地亚哥市加里福尼亚大学的Don Helinski博士那里，可以得到质粒pRK252（广宿主质粒pK2的一种衍生物）。这种质粒缺少存在于亲本质粒pRK290中的BglⅡ位点（Ditta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：7347，1980）。pRK252用SmaⅠ和SalⅠ消化，用Klenow填平，分离从这种消化液中得到的大片段。
37.把在步骤35中分离的含Tn903的片段连接到来自pRK252的大片段上，以构建成pRK252Km（步骤32-37，图7d）。
38.质粒pRK252Km用EcoRⅠ切断，用Klenow使末端平整，并用BglⅡ连接子连接（New England Biolabs）。
39.质粒pCIB2用EcoRⅤ切开，分离含有右边界和nos-neo-nos的小片段。这种片段用Klenow聚合酶填平并用BglⅡ连接子连接（New England Biolabs）。
40.由步骤39中得到的BglⅡ片段用步骤38的加有连接子的pRK 252Km连接，以产生pCIB10（见图7e，步骤38-40）。
pCIB10a的构建
41.质粒pRZ102（Jorgensen等，1979）用BamHⅠ消化，并用Klenow填平。
42.使质粒pA03（Oka等，1978）用AluⅠ进行部分消化。
43.把AluⅠ消化物连接到步骤32中的限制性酶解的pRZ102上，按卡那霉素抗性选择所需的转化体。
44.得到的质粒具有存在于1.05Kb片段上的Tn903的编码顺序;这种片段用BamHⅠ消化并用Klenow填平后加以分离。
45.自圣地亚哥市加里福尼亚大学的Don Helinski博士那里可以得到质粒pRK290，它是广宿主质粒pK2的衍生物。pRK290用SmaⅠ和SalⅠ消化，用Klenow填平，并且分离由消化得到的大片段。
46.把步骤35中分离的含有Tn903的片段连接到来自pRK290的大片段上，以构建pRK290Km。
47.用BglⅡ消化步骤46的质粒，用Klenow填平并连接以破坏其BglⅡ位点，从而构建pRK290Km（见图7f，步骤41-47）。
48.质粒pRK290Km用EcoRⅠ切开，用Klenow使末端平整，并且用BglⅡ连接子连接（New England Biolabs）。
49.质粒pCIB2用EcoRⅤ切开，用BglⅡ连接子（New England Biolabs）连接。
50.将步骤39中用BglⅡ连接子连接的pCIB2连接到步骤47的载体上，以构建pCIB10a（见图7g，步骤48-50）。
用质粒pRK252代替pRK290，可以重复步骤41-50。
实例Ⅵ pCIB23和pCIB24（以转化植物的叶绿体之GST酶为目标的载体）的构建
由佐治亚州雅典的乔治大学遗传学系的Richard Meagher博士那里，获得了质粒pSRS2.1，它含有大豆双磷酸核酮糖羧化酶（RuBPC）小亚基（SSU）的5′顺序（Berrglowe等，J.Mol.Appl.Genet.，1：483-498，1982）。用EcoRⅠ消化这种质粒。用琼脂糖凝胶分离含有大豆SSU5′区域的2.1Kb片段。用DdeⅠ消化此2.1Kb EcoRⅠ片段。分离471bp DdeⅠ片段。此片段包含转移肽和第二外显子的一部分。
此471bp片段用Klenow（New England Biolabs）DNA聚合酶处理。把激活的BglⅡ连接子（d（CA GATCTG），New England Biolabs）连接在这个片段上。用TaqⅠ消化此BglⅡ片段。用Klenow DNA聚合酶（Bethesda研究室）处理得到的TaqⅠ片段。把得到的平端片段连接在激活的BamHⅠ连接子（d（CGCGGATCCGCG），New England Biolabs）上并进行纯化。用BglⅡ和BamHⅠ/BglⅡ消化这些BamHⅠ片段。纯化约400bp BamHⅠ/BglⅡ片段，这个片段含SSU5′区域。
pCIB710用BamHⅠ切开并用小牛肠碱性磷酯酶处理。把400bp BamHⅠ/BglⅡ片段连接在此pCIB710中。把这种连接物转化到大肠杆菌HB101中，在氨苄青霉素上选择转化体。
找到了在两个取向上带有BamHⅠ/BglⅡ片段的转化体。pSCR2在邻接35S启动子处具有转移肽的5′区域。pSCR1在相反取向上具有BamHⅠ/BglⅡ片段。
用BamHⅠ消化pCIB12，分离带有GST基因的708bp BamHⅠ片段。质粒pSCR2用BamHⅠ切开，并用小牛肠碱性磷酯酶处理。把自pCIB12中得到的708bp BamHⅠ片段连接到BamHⅠ处理过的pSCR2中。把这种连接物转化到HB101中，并在氨苄青霉素上选择转化体。
找到了在5′调节区的两个取向上带GST基因的转化体。pCIB22克隆在自CaMV启动子转录的适当取向上有GST基因。pCIB21克隆在相反取向上有GST基因。用XbaⅠ和EcoRⅠ消化pCIB22。从凝胶中纯化带有嵌合基因的片段。
用XbaⅠ和EcoRⅠ消化质粒pCIB10。把带有嵌合基因的XbaⅠ/EcoRⅠ片段连接到消化过的pCIB10中，并且根据卡那霉素抗性选择转化体。所得到的质粒pCIB24是一种广宿主质粒，它带有附在叶绿体转移肽顺序上的嵌合GST基因。
采用类似操作法，自克隆pCIB21（代替pCIB22）开始构建质粒pCIB23。这种质粒在相对于pCIB24的GST基因之相反取向上带有GST基因。
按照与上面pCIB13和pCIB14类似的方式，把这些质粒导入土壤杆菌菌株之中。
实例Ⅶ pCIB542（一种在T-DNA上带有壮观霉素抗性基因的杆菌碱侵入促进因子（Agropine vir Helper）质粒）的构建
Ti质粒和pTiBo542（Sciaky，D.，Montoya，A.L.和Chilton，M-D，Plasmid，1：238-253，1978）是有价值的，因为带有这种Ti质粒的土壤杆菌能够感染农艺学上重要的豆科作物、苜蓿和大豆（Hood，E.E.等，Bio/Technology，2：702-708，1984）。构建一种T-DNA缺失的pTiBo542衍生物已经有人介绍过（Hood，Elizabeth E.，1985，博士论文，密苏里州圣路易斯市华盛顿大学）。构建这种称为EHA101的质粒时，用卡那霉素抗性基因代替T-DNA。EHA101的亲代（A281）寄存在ATCC，寄存号为53487。构建了一种EHA101的衍生物，此衍生物用壮观霉素抗性基因代替了EHA101中的卡那霉素抗性基因。质粒ppiδ307（E.Hood，华盛顿大学，论文，1985）具有与pTiBo542（Hood等，1984）的Bama左侧同源的1.7Kb区域和与pTiBo542的Bam 2a右侧同源的8Kb区域，这两个同源区被单一EcoRⅠ位点隔开。质粒pMON30（ATCC67 113）带有来自Tn7（Hollingshead，S.和Vapnek，D.，Plasmid，13：17-30，1985）的壮观霉素/链霉素抗性基因。用EcoRⅠ消化pMON30，自琼脂糖凝胶中分离含壮观霉素/链霉素基因的5.5Kb片段，并将其连接到EcoRⅠ酶解的质粒ppiδ307中。用壮观霉素抗性（50μg/ml）和四环素抗性（10μg/ml）选择所需的转化体。把这种质粒转化到土壤杆菌A136/EHA101中，并且根据链霉素抗性、四环素抗性和卡那霉素抗性的表型加以选择。导入逐出质粒R751-pMG2（Jacoby，G.等，J.Bacteriol.，127：1278-1285，1976）以及用庆大霉素（50μg/ml）和壮观霉素选择之后，选择EHA101和壮观霉素质粒的同质基因结合子（Matzke，A.J.M.和Chilton，M-D，J.Mol.Appl.Genet.，1：39-49，1981）。所需的这种同质基因结合子具有庆大霉素抗性和壮观霉素抗性、四环素敏感性和卡那霉素敏感性的表型。通过Southern探针杂交证实了所得质粒的结构。
实例Ⅷ 植物对莠去津的耐性试验
通过以下几种方法测定，发现带有GST基因构建体pCIB14的再生烟草植株对莠去津具有耐性：
1.荧光诱导法，以及
2.在对对照或野生型植物具有毒性的莠去津水平下，籽苗的生长能力。
荧光诱导分析法在于表明植物光化学机构的状况（Voss等，Weed Science，32：675-680，1984）。在这种分析中，用特征波长的光照射叶组织，记录所产生的第二波长的荧光。图5说明了通过叶柄（叶）切口吸取渗入缓冲液的离体烟草（未转化的）叶片具有典型的荧光诱导图型（下曲线）。人们看到，用光照射时荧光突然上升，然后是一个峰，接着随着时间延长信号逐渐衰减。这种图型表明叶绿体被入射光所激发，并以该体系的特征波长发射荧光。在这种状态下，能量随着电子通过光系统Ⅱ和Ⅰ的电子传递途径流动而从光系统释放出来-荧光信号的光滑衰减曲线表明了这一点。但是，如果叶中渗入10-5M莠去津溶液，则可以看到如同图5中上曲线那样一种图案。此时光能被吸收，叶绿体受激而且产生荧光，但没有能量释放出来，因为电子流在光系统Ⅱ的苯醌结合步骤被阻塞。情况好象是光系统在受激状态下被冻结。因此，人们看到荧光突然上升后根本不衰减。
对于按照本发明用遗传工程构建的烟草植物在10-5M莠去津存在下进行这种测量时，全部对照植物均显示出与未转移基因的烟草相同的荧光诱导图型。对实验植物进行测量时，按照其荧光诱导图型的不同把它们分为三类（图6）。
某些转移基因的植物未显示出莠去津解毒作用的任何迹象（上曲线），某些显示出中等解毒作用（中曲线），而另一些显示出明显的莠去津解毒作用（下曲线），如同由通过光系统的通常电子渠道所证明的那样。在以这种方式为特征的27种植物中，有5种植物表明了有能力使莠去津解毒的明显证据。
实例Ⅸ
植物材料的土壤杆菌侵染
在AB基本培养基（Watson，B.等，J.Bacteriol.，123：252-264，1975）和甘露醇中，使不同基因型的根癌土壤杆菌在28℃下生长48小时。把细菌离心沉淀，悬浮于稀释两倍的MSBN介质中，在25℃保持3小时（MSBN介质是用预包装的混合物以提供符合Murashige和Skoog要求的主要盐和次要盐（KC Biologicals产品）制成的，而且加有（最终浓度）：苄基腺嘌呤（1mg/ml）、萘乙酸（0.1mg/ml）、肌醇（1mg/l）、烟酸（1mg/l）、吡啶醇（1mg/l）、硫胺素盐酸（10mg）和蔗糖（30mg/l））。调节pH至5.7-5.8。按照Horsch，R.等人方法（Science，227：1229-1231，1985）之改进方法，把离体培养的烟草（Nicotiana tabacum cv.petite Havana SRL）植物的叶圆片悬浮在细菌悬浮液中10分钟。然后，把这些叶圆片转移到有MSBN而无抗菌素的滤纸上。48小时后，把叶圆片浸于含有500mg/l羧苄青霉素的滤纸上。48小时后，把叶圆片浸于含有500mg/l羧苄青霉素的液体MSBN中，然后转移到含100mg/l卡那霉素和500mg/l羧苄青霉素的固体选择介质中。
植物成熟及自花授粉
从选择介质上的愈伤组织中取出出现的嫩芽，将其转移到含100mg/l卡那霉素和250mg/l羧苄青霉素的OMS上，使其继续发育三周。然后将其种入土壤中并移入温室。移入温室后4-8周形成花。当开花及其花药开裂时，用镊子除去花药，用在柱头上擦拭花药的方法给每朵花自花授粉。40天后，种子荚膜成熟。对照植物、对照的基因转移植物及实验转化植物的种子后代试验
首先从成熟荚膜中无菌地取出种子，贮存在无菌培养皿中。然后，把种子放在含有全浓度的Murashige和Skoog主要和次要盐（KC Biologicals产品）、1mg/l硫胺素盐酸和0.6%纯化琼脂（Difco）之半固体种籽发芽介质（SGM）中。在此介质中加入浓度为10-7M、3×10-7M、5×10-7M、8×10-7M和10-6M的分析纯莠去津。14天后，在这些浓度或零浓度莠去津上，评定籽苗的生长和存活情况，结果列于下面表1中。全部对照植物和对照的转移基因植物均发芽，但是在莠去津浓度为10-7M或更高的情况下生长未能超过子叶生长阶段。在由每一株自花授粉的pCIB14植物种子长出的籽苗中，大约75%在5×10-7M浓度下保持绿色，并且生出了初生叶，而在莠去津浓度为8×10-7M或更高的情况下长出的籽苗，在黄花和死亡之前只长出了子叶。虽然有耐性的籽苗在莠去津介质中的生长不如在无莠去津介质中那样好，但是这种籽苗与在同样介质中的敏感性籽苗之间可以容易地分别出来。
莠去津浓度
籽苗基因型 10-7M 3×10-7M 5×10-7M 8×10-7M 10-6M
对照 + + 0 0 0
LBA4404 + + 0 0 0
Bin6 + + 0 0 0
pCIB13 + + 0 0 0
pCIB14 + + + 0 0
表的说明：表明了pCIB14转移基因植物的后代和全部对照植物后代之间，在生长和存活方面的差别。“+”表明一种正生长反应，而“0”表明未生长。
虽然为了清楚和便于理解而通过图解和举例在某些细节上描述了本发明，但是显然可以在本发明范围内做某些变化和更改，因为本发明只受所附的权利要求的限制。
在本发明范围内，不仅具有给定的具体核苷酸顺序并编码谷胱甘肽S-转移酶多肽的DNA分子是本发明的具体方案，而且编码具有谷胱甘肽S-转移酶活性的多肽的其变异体和突变体也是本发明的具体方案。