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抗LAG-3结合蛋白
发明领域
本发明涉及结合淋巴细胞活化基因(LAG-3)且引起表达LAG-3的活化的T细胞的耗竭的抗原结合蛋白，特别是抗体，编码此类抗原结合蛋白的多核苷酸，含有所述抗原结合蛋白的药物组合物，和所述抗原结合蛋白在治疗和/或预防与致病性T细胞的参与相关的疾病中的用途。
发明背景
淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)是调节T细胞稳态、增殖和活化的负共刺激受体(SierroS等人;ExpertOpin.Ther.Targets(2010)15:91-101)。免疫球蛋白超家族成员，LAG-3是CD4样蛋白，其，像CD4，结合至MHCII类分子，但与CD4相比亲和力高两倍且位点不同(HuardB等人,(1997)ProcNatlAcadSciUSA94:5744-9)。除了施加非常不同的功能(CD4是正共刺激分子)以外，两种受体也被差异调节。CD4在所有成熟CD4+T细胞的表面上组成型表达，其中仅小部分驻留于细胞内，而大部分LAG-3分子保留于细胞中接近于微管组织中心，且仅诱导随后抗原特异性T细胞活化(WooSR等人,(2010)EurJImmunol40:1768-77)。LAG-3作为T-细胞应答的负调节剂的作用基于用LAG-3敲除小鼠的研究和在体外和体内系统模型中使用阻断性抗LAG-3抗体(SierroS等人,ExpertOpin.Ther.Targets(2010)15:91-101;HannierS等人(1998),JImmunol161:4058-65;Macon-LemaitreL等人(2005),Immunology115:170-8;WorkmanCJ等人(2003),EurJImmunol33:970-9)。
在细胞表面，LAG-3被表达为二聚体，这对于形成稳定的MHCII类结合位点是需要的(HuardB等人(1997)ProcNatlAcadSciUSA94:5744-9)。可溶形式的LAG-3也存在于健康供体和结核病和癌症患者的血清中(LienhardtC等人(2002),EurJImmunol32:1605-13;TriebelF等人(2006).CancerLett235:147-53)，且该形式可以与LAG-3+T细胞的数目相关(SiawayaJ等人(2008).JofInfection56:340-7)。LAG-3作为增强的淋巴细胞耗竭剂的目标抗原的关键属性是其当与目前在临床上的其他药剂(即，Campath^TM(T/B细胞)、Amevive(最多CD45RO+T-细胞)或Rituxan(B-细胞))相比时的相对选择性表达概况。很少分子已经被鉴定为人中的体内T细胞活化的持续标志物。这些包括LAG-3、OX40、MHCII类、CD69、CD38、ICOS和CD40L。然而，除了LAG-3和OX40以外，这些分子中的大多数也在人天然Tregs或其他细胞类型上组成型表达。LAG-3表达于健康人中的小比例的T细胞(约1-4％)和类似比例的NK细胞中(BaixerasE等人(1992),JExpMed176:327-37;HuardB等人(1994),Immunogenetics39:213-7)。用抗CD3活化后，约30-80%的CD4+和CD8+T细胞在24至48小时之内表达LAG-3；该百分比在IL2、IL7和IL12存在的情况下增加(SierroS等人,ExpertOpin.Ther.Targets(2010)15:91-101;BruniquelD等人(1998),Immunogenetics48:116-24)。用回忆抗原(即，CMV或破伤风类毒素)抗原特异性刺激之后，大多数活化的T细胞是LAG-3+。此外，在人中，LAG-3表达于健康人血液中的CD4+CD25+FoxP3+Tregs的亚群(1-10％)上。该群体似乎在体外通过细胞接触和IL10依赖性机制是功能抑制的，因此，可以代表最近活化的天然或诱导的Tregs的群体[CamisaschiC,CasatiC,RiniF等人(2010).LAG-3expressiondefinesasubsetofCD4+CD25highFox3P+regulatoryTcellsthatareexpandedattumoursites.J.Immunol184:6545-51)。LAG-3已经在造血谱系的其他细胞类型(诸如浆细胞样树突细胞、B细胞和NKT细胞)上，但仅在小鼠中，且主要在活化之后，被检测到(SierroS,RomeroP&SpeiserD;ExpertOpin.Ther.Targets(2010)15:91-101)。
LAG-3+T细胞的耗竭可用于治疗或预防T细胞驱动的免疫炎性病症。在其中大多数自体反应细胞在疾病部位被自身抗原长期活化和/或在外周重新循环的自身免疫疾病中，耗竭性抗原结合蛋白的短时程可以选择性耗竭该自身免疫性T细胞库，提供长期缓解。该方法的优先性已经用泛淋巴细胞耗竭性抗体Campath^TM得到证明，其中在多发性硬化症试验中，单一12mg注射与标准治疗相比使复发率降低74％(TheCAMMS223TrialInvestigators(2008),NEnglJMed.359:1786-801)。由于LAG-3与CD52(Campath^TM的目标)相比更选择性的表达，所以对幼稚和静息记忆性T细胞和自然Tregs库的影响应当减少。预计这导致改善的治疗指数、维持效力，但感染和恶性肿瘤以及与Campath^TM相关的自身免疫的发生的风险降低。此外，在狒狒结核菌素皮肤攻击模型中，LAG-3靶向嵌合抗体IMP731在外周中和皮肤攻击部位处均介导LAG-3+T-细胞的??耗竭，导致结核菌素皮肤攻击响应的降低(PoirierN等人(2011),ClinExpImmunol164:265-74)。在进一步研究中，LAG-3多克隆抗体从大鼠心脏同种异体移植物中耗竭LAG-3+浸润性T细胞且延长这些移植物的存活(HaudebourgT等人(2007),Transplantation84:1500-1506)。
本领域需要结合LAG-3且引起LAG-3+活化的T细胞的耗竭的抗原结合蛋白，特别是人源化抗体，其可用于治疗自身免疫疾病，诸如银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、Sj?gren氏综合征、多发性硬化、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎；感染性疾病、过敏性疾病和癌症。
发明概述
本发明广泛涉及抗原结合蛋白，诸如人源化的抗体，其结合淋巴细胞活化基因3(LAG-3)，且能够引起LAG-3+活化的T细胞的耗竭。更具体地，本发明的抗原结合蛋白可以包含SEQIDNo.5的CDRL1、CDRL2和CDRL3。
本文描述的抗原结合蛋白可以用于治疗或预防与致病性T细胞的参与相关的疾病，例如自身免疫疾病，诸如银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、Sj?gren氏综合征、多发性硬化、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎；感染性疾病、过敏性疾病和癌症。因此，本发明进一步涉及包含根据本发明的抗原结合蛋白和任选一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物。
附图说明
图1：抗体与表达LAG-3的EL4(A)和活化的人CD3+T细胞(B)的结合。Synagis，针对无关目标的单克隆抗体，用作阴性对照。
图2：腹膜内施用的无岩藻糖基化的抗体H5L7BW对注射后24小时从腹膜腔取回的共同施用的活化的人PBMC的影响。A)共同施用1x10⁷个活化的人PBMC和5mg/kg对照抗体(H5L7BW或Campath^TM)之后24小时的人CD4⁺LAG-3⁺和CD8⁺LAG-3⁺T细胞的定量(供体A：对照n=2；H5L7BWn=2，MabCampathn=1；供体B：对照n=2；H5L7BWn=3，Campath^TMn=2)。B)总CD4⁺和CD8⁺T细胞的定量。(*p<0.001)。
图3：无岩藻糖基化的抗体H5L7BW及其非ADCC增强的变体H5L7对腹膜内共同施用且在注射后5小时从腹膜腔取回的活化的人PBMC的影响。A)共同施用1x10⁷个活化的人PBMC和5mg/kg对照抗体(H5L7BW或H5L7)之后5小时的人CD4⁺LAG-3⁺和CD8⁺LAG-3⁺T细胞的定量(n=3/组)。B)总CD4⁺和CD8⁺T细胞的定量。(*p<0.001)。
图4：将人活化的PBMC施用于SCID小鼠的腹膜中之前18小时静脉内施用的无岩藻糖基化的抗体H5L7BW的影响。A)i.p.注射5x10⁶个(n=1/组)或1x10⁷个O/N(n=4/组)活化的人PBMC之后5小时的人CD4⁺LAG-3⁺和CD8⁺LAG-3⁺T细胞的定量。B)总CD4⁺和CD8⁺T细胞的定量。注射活化的人PBMC之前18小时静脉内注射5mg/kgH5L7BW或对照抗体。(*p<0.001,#p=0.0052)。
图5：将活化的人PBMC施用于SCID小鼠的腹膜中之前18小时静脉内施用的H5L7BW、H5L7或IMP731(5mg/kg)的影响。A)i.p.注射1x10⁷个(n=4/组)活化的人PBMC之后5小时的人CD4⁺LAG-3⁺和CD8⁺LAG-3⁺T细胞的定量。注射人PBMC之前18小时静脉内注射5mg/kgH5L7BW、H5L7、IMP731或对照抗体。B)总CD4⁺和CD8⁺T细胞的定量。注射活化的人PBMC之前18小时静脉内注射5mg/kgLAG-3耗竭性抗体或对照抗体。(*p<0.001)。
发明详述
本发明广泛涉及结合淋巴细胞活化基因3(LAG-3)的抗原结合蛋白，且更具体地，可以引起LAG-3+活化的T细胞的耗竭的抗原结合蛋白。
如本文所使用的术语“抗原结合蛋白”是指能够结合LAG-3的抗体及其片段。除非另外指明，如本文所使用的术语“LAG-3”是指淋巴细胞活化基因3。术语“LAG-3”在其范围内包括，但不限于作为例如活化的T细胞、NK细胞和B细胞的表面上的二聚物表达的LAG-3(在本领域中也已知为，例如，CD223)，和例如人血清中发现的LAG-3的可溶形式，在本文中称为“sLAG-3”。除非另外指明，本文提及“sLAG-3”和“LAG-3”是人多肽。在一个具体实施方案中，本发明提供了能够结合作为例如活化的T细胞、NK细胞和B细胞的表面上的二聚物表达的LAG-3的形式(在本领域中也已知为，例如，CD223)的抗原结合蛋白。更具体地，本发明涉及能够结合活化的T细胞上表达的LAG-3且能够引起所述活化的T细胞的耗竭的抗原结合蛋白。
在一个方面，本发明提供了能够结合LAG-3且包含来自SEQIDNo.5的CDRL1(其中位置27E是脯氨酸)的抗原结合蛋白。
在一个进一步方面，本发明提供了包含SEQIDNO.1的CDRL1的抗原结合蛋白。
在一个进一步方面，本发明提供了能够结合LAG-3且包含来自SEQIDNo.5的CDRL1的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白进一步包含来自SEQIDNO.5的CDRL2和/或CDRL3或其CDR变体。
在一个进一步方面，本发明提供了进一步包含SEQIDNO.2的CDRL2和/或SEQIDNO.3的CDRL3或其CDR变体的抗原结合蛋白。
在一个进一步方面，本发明提供了能够结合LAG-3且包含来自SEQIDNo.5的CDRL1、CDRL2和CDRL3的抗原结合蛋白。
在一个进一步方面，本发明提供了包含来自SEQIDNO10的CDRH1、CDRH2和CDRH3或其CDR变体中的一种或多种的抗原结合蛋白。
在另一个方面，本发明提供了包含来自SEQIDNO.5的CDRL1、CDRL2和CDRL3和来自SEQIDNO:10的CDRH1、CDRH2和CDRH3的抗原结合蛋白。
在一个进一步方面，本发明提供了包含选自SEQIDNO.6的CDRH1、SEQIDNO.7的CDRH2和SEQIDNO.8的CDRH3的一个或多个CDR或其CDR变体的抗原结合蛋白。
在一个进一步方面，本发明提供了包含以下CDR的抗原结合蛋白：
CDRL1:SEQIDNO.1
CDRL2:SEQIDNO.2
CDRL3:SEQIDNO.3
CDRH1:SEQIDNO.6
CDRH2:SEQIDNO.7
CDRH3:SEQIDNO.8。
在另一个方面，本发明提供了抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含来自SEQIDNO.5的CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变轻链，和包含来自SEQIDNO:10的CDRH1、CDRH2和CDRH3的可变重链。
在一个具体方面，所述抗原结合蛋白是人源化抗体，任选为IgG。
如本文所使用，术语“CDR”是指抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链和三个轻链CDRs(或CDR区)。
对于本领域技术人员显而易见的是，存在CDR序列的多种编号常规；Chothia(Chothia等人(1989)Nature342:877-883)、Kabat(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,4thEd.,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NationalInstitutesofHealth(1987))、AbM(UniversityofBath)和Contact(UniversityCollegeLondon)。用Kabat、Chothia、AbM和接触方法中的至少两种可以测定最小重叠区，以提供"最小结合单元"。最小结合单元可以是CDR的亚部分。抗体的结构和蛋白折叠可以意指其他残基是CDR序列的考虑部分，并且将由技术人员理解为这样。
除非另有说明和/或不存在具体鉴定的序列，本文提及“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”是指根据表1中鉴定的任何已知规则编号的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，利用的编号规则是Kabat规则。本文提及“位置27E”是指使用Kabat编号规则定义的轻链可变结构域中的位置27E存在的氨基酸。技术人员将理解，该位置具有根据其他已知规则(诸如，例如，Chothia)的等效物，其中位置27E等效于位置30B。
下表1代表使用每种编号规则对每个CDR或结合单元的一种定义。应该注意，一些CDR定义可以根据所用的单独出版物而变化。
表1

如本文使用的术语“CDR变体”是指已经修饰至少一个，例如1、2或3个氨基酸取代、缺失或添加的CDR，其中修饰的包含CDR变体的抗原结合蛋白基本上保留了抗原结合蛋白修饰前的生物学特性。应当理解的是，可以单独或与另一个CDR组合修饰可以修饰的每个CDR。在一个方面，所述修饰是取代，特别是保守取代，例如如表2中显示。
表2

侧链成员疏水的Met, Ala, Val, Leu, Ile中性亲水的Cys, Ser, Thr酸性的Asp, Glu碱性的Asn, Gln, His, Lys, Arg影响链取向的残基Gly, Pro芳香族的Trp, Tyr, Phe
例如，在变体CDR中，最小结合单位的氨基酸残基可以维持相同，但包含CDR作为Kabat或Chothia定义的部分的侧翼残基可以被保守的氨基酸残基取代。
包含如上所述的修饰的CDR或最小结合单位的此类抗原结合蛋白在本文中可以被称为“功能性CDR变体”或“功能性结合单位变体”。
本发明的抗原结合蛋白能够结合sLAG-3。在一个方面，抗原结合蛋白-sLAG-3相互作用的平衡解离常数(KD)为10nM或更小，诸如1nM或更小，例如1pM至300、400、500pM或500pM至1nM。技术人员将理解KD数值越小，结合就越强。KD的倒数(即，1/KD)是具有单位M^-1的平衡结合常数(KA)。技术人员将理解，KA数值越大，则结合越强。
在一个方面，本发明提供了能够以小于1nM、例如1pM至300pM的KD(当分别使用SEQIDNO:51和52的重组人或食蟹猴LAG-3细胞外结构域(ECD)通过Biacore^TM表面等离子共振分析来测定时)结合重组LAG-3的抗原结合蛋白。
此外，本发明的抗原结合蛋白还能够结合例如EL4细胞或活化的人CD3+T细胞上表达的LAG-3。
本发明的抗原结合蛋白也能够耗竭LAG-3+活化的T细胞，特别是CD4+LAG-3+和CD8+LAG-3+T细胞。LAG-3+T细胞的耗竭可以通过，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒活性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒活性(CDC)而发生。
在一个方面，本发明提供了能够在使用原代人T细胞的体外测定中通过ADCC引起抗原特异性CD4和/或CD8LAG-3⁺人T细胞的大于40％耗竭的抗原结合蛋白。
在一个进一步方面，本发明提供了在0.1μg/mL的浓度能够在使用铕标记的表达LAG-3的EL4细胞作为目标细胞和人PBMC作为效应物细胞的体外ADCC测定中引起大于50％耗竭的抗原结合蛋白，其中效应物:目标比率不大于50:1且测定运行2小时的期间。％细胞裂解基于从表达LAG-3的EL4细胞的铕释放来计算。
在抗原结合蛋白的恒定区和多种Fc受体(FcR)(包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))之间的相互作用被认为介导抗原结合蛋白的效应子功能诸如ADCC和CDC。显著的生物学效应可以是效应子功能性的结果。通常，介导效应子功能的能力要求抗原结合蛋白与抗原的结合，并且并非所有抗原结合蛋白都介导每种效应子功能。
效应子功能可以以许多方法进行测量，包括例如经由本发明的抗原结合蛋白例如抗体经由FcγRIII与天然杀伤细胞的结合或经由FcγRI与单核细胞/巨噬细胞的结合，以测量ADCC效应子功能。例如，本发明的抗原结合蛋白可以在天然杀伤细胞测定中针对ADCC效应子功能进行评价。此类测定的实例可见于Shields等人，2001TheJournalofBiologicalChemistry，第276卷，第6591-6604页；Chappel等人，1993TheJournalofBiologicalChemistry，第268卷，第25124-25131页；Lazar等人，2006PNAS,103;4005-4010。
测定CDC功能的测定的实例包括在1995JImmMeth184:29-38中所述的那些。
在本发明的一个方面，所述抗原结合蛋白是抗体。
如本文所使用的术语“抗体”是指具有免疫球蛋白样结构域的分子且包括单克隆(例如，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)、重组、多克隆、嵌合、人源化、双特异性和异源缀合物抗体；单一可变结构域(例如，VL)、结构域抗体(dAb?)、抗原结合片段、免疫学有效片段、Fab、F(ab’)₂、Fv、二硫键(disulphide)连接的Fv、单链Fv、闭合构象多特异性抗体、二硫键连接的scFv、双体、TANDABS?等和任何前述的修饰版本(关于替代“抗体”形式的概述，参见Holliger和Hudson,NatureBiotechnology,2005,Vol23,No.9,1126-1136)。替代抗体形式包括替代支架，其中根据本公开的任何分子的一个或多个CDR可以被布置至合适的非免疫球蛋白蛋白支架或骨架(诸如亲和体(affibody)、SpA支架、LDL受体A类结构域、亲合体(avimer))上(参见，例如，美国专利申请公开号2005/0053973、2005/0089932、2005/0164301)或EGF结构域。
在一个进一步方面，所述抗原结合蛋白是人源化抗体。
"人源化抗体"是指工程改造的抗体类型，其具有源自非人供体免疫球蛋白的CDR，所述分子剩余的源自免疫球蛋白的部分源自一个(或多个)人免疫球蛋白。此外，可改变构架支持残基以保留结合亲和力(参见例如，Queen等人，Proc.NatlAcadSciUSA,86:10029-10032(1989),Hodgson等人，Bio/Technology,9:421(1991))。合适的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性选自以下常规数据库的抗体：例如KABAT?数据库、LosAlamos数据库和SwissProtein数据库。特征为与供体抗体构架区的同源性(基于氨基酸)的人抗体，可适于提供重链恒定区和/或重链可变构架区用于插入供体CDR。可以相似的方式选择能够贡献轻链恒定区或可变构架区的合适的受体抗体。应该注意，受体抗体重链和轻链不必源自相同受体抗体。现有技术描述了产生所述人源化抗体的几种方式，参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951。
在又一个进一步方面，人源化抗体具有人抗体恒定区，其是IgG1，例如，SEQIDNo.46的重链恒定区。
应当理解的是，本发明进一步提供了人源化抗体，其包含a)SEQIDNO.5的轻链序列或与任何SEQIDNO.5具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链序列，和b)SEQIDNO.10的重链序列或与任何SEQIDNO.10具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链序列。
在一个进一步方面，本发明提供了人源化抗体，其包含a)与SEQIDNO.5具有至少90％同一性的轻链序列，和b)与SEQIDNO.10具有至少90％同一性的重链序列。
在一个进一步方面，本发明提供了人源化抗体，其包含a)与SEQIDNO.5具有至少95％同一性的轻链序列，和b)与SEQIDNO.10具有至少95％同一性的重链序列。
在又一个进一步方面，本发明提供了人源化抗体，其包含a)与SEQIDNO.5具有至少97％同一性的轻链序列，和b)与SEQIDNO.10具有至少97％同一性的重链序列。
在又一个进一步方面，本发明提供了人源化抗体，其包含a)SEQIDNO.5的轻链序列，和b)SEQIDNO.10的重链序列。
应当理解的是，本发明进一步提供了人源化抗体，其包含a)SEQIDNO.35的轻链序列或与任何SEQIDNO.35具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链序列，和b)SEQIDNO.36的重链序列或与任何SEQIDNO.36具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链序列。
在一个进一步方面，本发明提供了包含分别SEQIDNO:35和36的CDRL1-L3和CDRH1-H3的抗原结合蛋白。
对于核苷酸和氨基酸序列，术语“相同的”或“同一性”表明当具有适当的插入或缺失的情况下最佳比对和比较时两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。
两条序列之间的同一性百分比是由序列共享的相同位置数目的函数(即%同一性=相同位置数目/位置总数目乘以100)，考虑到缺口数目和每个缺口的长度，其需要被引入用于两条序列的最佳比对。在两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以使用如下文描述的数学算法完成。
查询核酸序列和主题核酸序列之间的百分比同一性是表示为百分比的“同一性”值，当主题核酸序列在进行成对BLASTN比对之后与查询核酸序列具有100％查询覆盖率时，所述百分比通过BLASTN算法来计算。此类查询核酸序列和主题核酸序列之间的成对BLASTN比对通过使用低复杂度区域的过滤器关闭的NationalCenterforBiotechnologyInstitute网站上可得的BLASTN算法的默认设置来进行。重要地，查询核酸序列可以通过本文的一个或多个权利要求中鉴定的核酸序列来描述。
查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的百分比同一性是表示为百分比的“同一性”值，当主题氨基酸序列在进行成对BLASTP比对之后与查询氨基酸序列具有100％查询覆盖率时，所述百分比通过BLASTP算法来计算。此类查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的成对BLASTP比对通过使用低复杂度区域的过滤器关闭的NationalCenterforBiotechnologyInstitute网站上可得的BLASTP算法的默认设置来进行。重要地，查询氨基酸序列可以通过本文的一个或多个权利要求中鉴定的氨基酸序列来描述。
产生
通过用包含本发明的抗原结合蛋白的编码序列的表达载体转染宿主细胞，可以产生本发明的抗原结合蛋白，例如抗体，诸如人源化抗体。通过将抗原结合蛋白的这些编码序列置于与常规的调节控制序列的可操作关联下，产生表达载体或重组质粒，所述调节控制序列能够控制在宿主细胞中的复制和表达和/或从宿主细胞的分泌。调节序列包括启动子序列，例如CMV启动子和可以源自其他已知的抗体的信号序列。类似地，可以产生具有DNA序列的第二表达载体，所述DNA序列编码互补的抗原结合蛋白轻链或重链。在某些实施方案中，除了所涉及的编码序列和选择标记之外，这种第二表达载体与第一表达载体相同，以确保尽可能地有功能地表达每条多肽链。或者，抗原结合蛋白的重链和轻链编码序列可以存在于单一载体上。
通过常规技术，用第一载体和第二载体共转染选定的宿主细胞(或仅用单一载体转染)，以生成包含重组的或合成的轻链和重链的本发明的转染的宿主细胞。然后通过常规技术，培养转染的细胞，以产生本发明的工程改造的抗原结合蛋白。通过合适的测定，诸如ELISA或RIA，从培养物筛选包括重组重链和/或轻链的结合体的抗原结合蛋白。可以采用相似的常规技术，构建其他抗原结合蛋白。
本领域技术人员可以选择适用于在本发明的方法和组合物构建中采用的克隆和亚克隆步骤的载体。例如，可以使用常规的pUC克隆载体系列。一种载体pUC19可从供应点商业获得，诸如Amersham(Buckinghamshire,UnitedKingdom)或Pharmacia(Uppsala,Sweden)。另外，能够容易地复制的、具有丰富的克隆位点和选择基因(例如，抗生素抗性)并且易于操作的任何载体，可以用于克隆。因而，克隆载体的选择不是本发明的限制因素。
通过适用于扩增异源DNA序列的表达的基因，例如，哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR)，也可以表征表达载体。其他优选载体序列包括：聚腺苷酸(polyA)信号序列，诸如来自牛生长激素(BGH)以及β珠蛋白启动子序列(betaglopro)。通过本领域技术人员众所周知的技术，可以合成在本文中有用的表达载体。
这些载体的组件，例如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等，可以从商业来源或天然来源获得，或通过已知程序合成，用于指导重组DNA的产物在选定的宿主中的表达和/或分泌。为了这个目的，也可以选择其他合适的表达载体，其中许多类型在本领域已知用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达。
本发明还涵盖用含有本发明的抗原结合蛋白的编码序列的重组质粒转染的细胞系。对于这些克隆载体的克隆和其他操作而言有用的宿主细胞也是常规的。然而，来自各种大肠杆菌菌株的细胞可以用于克隆载体的复制和本发明的抗原结合蛋白的构建中的其他步骤。
适用于表达本发明的抗原结合蛋白的宿主细胞或细胞系包括：哺乳动物细胞诸如NS0、Sp2/0、CHO(例如DG44)、COS、HEK、成纤维细胞(例如，3T3)和骨髓瘤细胞，例如它可以在CHO或骨髓瘤细胞中表达。可以使用人细胞，因而允许分子用人糖基化模式来修饰。或者，可以采用其他真核细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞的选择，以及用于转化、培养、扩增、筛选和产物产生和纯化的方法，是本领域已知的。参见，例如，以上引述的Sambrook等人。
可以证明，细菌细胞可用作宿主细胞，其适合表达本发明的重组Fab或其他实施方案(参见，例如，Plückthun,A.,Immunol.Rev.,130:151-188(1992))。但是，由于在细菌细胞中表达的蛋白倾向于未折叠的形式或不正确地折叠的形式或非糖基化形式，必须筛选在细菌细胞中产生的任何重组Fab，以保留抗原结合能力。如果细菌细胞表达的分子以适当地折叠的形式产生，该细菌细胞将是期望的宿主，或者，在可替代的实施方案中，可以在细菌宿主中表达分子，然后随后进行重新折叠。例如，用于表达的各种大肠杆菌菌株，是生物技术领域中众所周知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、链霉菌属、其他芽孢杆菌属等的各种菌株，也可以用于该方法中。
如果需要，本领域技术人员已知的酵母细胞菌株以及昆虫细胞，例如果蝇和鳞翅目昆虫和病毒表达系统，也可用作宿主细胞。参见例如，Miller等人，GeneticEngineering,8:277-298,PlenumPress(1986)和其中引用的参考文献。
可通过其构建载体的一般方法、产生本发明宿主细胞所需要的转染方法和从所述宿主细胞产生本发明抗原结合蛋白必需的培养方法，可以全部是常规技术。本发明培养方法通常是无血清培养方法，通常通过无血清悬浮培养细胞。同样地，一旦产生本发明抗原结合蛋白，可将其根据本领域标准程序从细胞培养内容物纯化出，所述标准程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。这类技术在本领域技术范围内，不限定本发明。例如，在WO99/58679和WO96/16990中描述了改变的抗体的制备。
表达抗原结合蛋白的又另一种方法可以利用在转基因动物中的表达，诸如美国专利号4,873,316中所述。这涉及利用动物酪蛋白启动子的表达系统，当其被转基因地并入哺乳动物中时，允许雌性动物在其奶中产生希望的重组蛋白。
在本发明的进一步方面，提供了产生本发明的抗原结合蛋白(例如人源化抗体)的方法，所述方法包括培养用编码本发明抗体的轻链和/或重链的载体转化或转染的宿主细胞和回收由此产生的抗原结合蛋白的步骤。
根据本发明，提供了产生本发明的抗LAG-3抗原结合蛋白(例如人源化抗体)的方法，所述抗LAG-3抗原结合蛋白与人LAG-3结合，所述方法包括以下步骤；
(a)提供编码抗体的重链的第一载体；
(b)提供编码抗体的轻链的第二载体；
(c)用所述第一载体和第二载体转化哺乳动物宿主细胞(例如CHO)；
(d)在有助于所述抗体从所述宿主细胞分泌进所述培养基中的条件下，培养步骤(c)的宿主细胞；
(e)回收步骤(d)的分泌的抗体。
抗原结合蛋白一旦通过所需方法表达，就可以通过利用适当的测定检查其体外活性，诸如Biacore^TM表面等离子共振分析，以评价抗原结合蛋白与LAG-3的结合。此外，其他体外和体内测定也可以用于测定抗原结合蛋白引起表达LAG-3的细胞(诸如活化的人T细胞群体)的耗竭的能力。
技术人员将理解，在产生抗原结合蛋白诸如抗体(特别是根据使用的细胞系和抗原结合蛋白的具体氨基酸序列)之后，翻译后修饰可发生。例如，这可以包括某些前导序列的切割、在多种糖基化和磷酸化模式中的多种糖部分的添加、脱酰胺、氧化、二硫键混杂(disulfidebondscrambling)、异构化、C末端赖氨酸剪切和N末端谷氨酰胺环化。本发明涵盖已实施或已经历一种或多种翻译后修饰的抗原结合蛋白的用途。因此，本发明的“抗原结合蛋白”或“抗体”分别包括“抗原结合蛋白”或“抗体”，如先前所定义，其已经经历翻译后修饰，诸如如本文所述。
在其恒定区中的保守位置处的抗体糖基化已知对抗体功能特别是效应子功能具有深远作用，参见例如Boyd等人(1996)Mol.Immunol.32：1311-1318。考虑了本发明的抗原结合蛋白的糖基化变体，其中添加、取代、缺失或修饰一个或多个碳水化合物部分。天冬酰胺-X-丝氨酸或天冬酰胺-X-苏氨酸基序的引入产生用于碳水化合物部分的酶促连接的潜在位点，并且因此可以用于操纵抗体的糖基化。在Raju等人(2001)Biochemistry40：8868-8876中，通过使用β-1,4-半乳糖转移酶(galactosyltransferace)和/或α,2,3唾液酸转移酶的再半乳糖化(regalactosylation)和/或再唾液酸化(resialylation)处理，增加TNFR-IgG免疫粘附的末端唾液酸化。增加末端唾液酸化被认为增加免疫球蛋白的半衰期。抗体和大多数糖蛋白一样，通常作为糖形混合物产生。当抗体在真核细胞、特别是哺乳动物细胞中生产时，这种混合物是特别明显的。已开发了制造确定糖形的多种方法，参见Zhang等人(2004)Science303：371：Sears等人(2001)Science291：2344；Wacker等人(2002)Science298：1790；Davis等人(2002)Chem.Rev.102：579；Hang等人(2001)Acc.Chem.Res34：727。如本文描述的抗体(例如IgG同种型，例如IgG1)可以包含确定数目(例如7种或更少，例如5种或更少，例如两种或单一)的糖形。
脱酰胺是主要将天冬酰胺(N)转换为以约3:1比的异天冬氨酸和天冬氨酸(D)的酶促反应。在小得多的程度上，脱酰胺可以以类似方式对谷氨酰胺残基发生。CDR中的脱酰胺导致分子电荷中的改变，但通常不导致抗原结合中的改变，它也不影响PK/PD。
氧化可以在产生和贮存过程中(即在氧化条件的存在下)发生，并且导致通过活性氧簇直接诱导或通过与氧化性应激的次级副产物反应间接诱导的蛋白共价修饰。氧化主要对甲硫氨酸残基发生，但偶然地可以在色氨酸和游离半胱氨酸残基处发生。
二硫键混杂可以在产生和碱性贮存条件过程中发生。在某些环境下，二硫键可以不正确地破坏或形成，导致不配对的半胱氨酸残基(-SH)。这些游离的(不配对的)巯基(-SH)可以促进混乱。
异构化通常在产生、纯化和贮存(在酸性pH下)过程中发生，并且通常在天冬氨酸通过化学处理转换为异天冬氨酸时发生。
重链和/或轻链中的N末端谷氨酰胺可能形成焦谷氨酸(pGlu)。大多数pGlu形成在生产生物反应器中发生，但它可以非酶促形成，这取决于加工和贮存条件的pH和温度。pGlu形成视为关于重组mAb的首要降解途径之一。
C末端赖氨酸剪切是由羧肽酶催化的酶促反应，并且通常在重组mAb中被观察到。该处理的变体包括赖氨酸从一条或两条重链中的去除。赖氨酸剪切看起来不影响生物活性，并且对mAb效应子功能没有作用。
效应子功能增强
抗原结合蛋白的恒定区和各种Fc受体(FcR)包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)之间的相互作用据信介导抗原结合蛋白的效应子功能，诸如ADCC和CDC。
本文所使用的术语“效应子功能”意指抗体依赖性细胞介导的细胞毒性活性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性活性(CDC)介导的应答、Fc介导的吞噬作用或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和经由FcRn受体的抗体再循环中的一种或多种。
本发明的抗原结合蛋白的ADCC或CDC特性可以以多种方式来增强。
已经显示了含有特定突变或在残基Asn297上具有改变的糖基化的人IgG1恒定区以增强与Fc受体的结合。也已经显示，在一些情况下，这些突变增强ADCC和CDC(Lazar等人PNAS2006,103;4005-4010；Shields等人JBiolChem2001,276;6591-6604；Nechansky等人MolImmunol,2007,44;1815-1817)。
在本发明的一个实施方案中，这种突变在选自239、332和330(IgG1)的一个或多个位置处或其他IgG同种型中的等效位置处。合适突变的实例是S239D和I332E和A330L。在一个实施方案中，本文所述的本发明的抗原结合蛋白在239和332位处突变，例如S239D和I332E，或在进一步实施方案中，其在选自239和332和330的三个或更多个位置处突变，例如S239D和I332E和A330L。(EU索引编号)。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区的抗原结合蛋白，例如包含具有至少一个来自IgG3的CH2结构域的嵌合重链恒定区以使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能的抗原结合蛋白，例如其中其具有增强的ADCC或增强的CDC，或增强的ADCC和CDC功能。在一个此类实施方案中，抗原结合蛋白可以包含一个来自IgG3的CH2结构域或两个CH2结构域都可以来自IgG3。
还提供了产生本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a)培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含如本文所述的分离核酸，其中所述表达载体包含编码含有源自人种系IgG1和IgG3序列的结构域的Fc区的核酸序列；和
b)回收抗原结合蛋白。
此类产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa,Inc.(LaJolla,CA,USA)和KyowaHakkoKogyo(now,KyowaHakkoKirinCo.,Ltd.)Co.,Ltd.获得的COMPLEGENT?技术系统进行，其中重组宿主细胞包含表达载体，其中表达编码含有源自人种系IgG1和IgG3序列的结构域的Fc区的核酸序列以产生具有增强的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的抗原结合蛋白，该活性相对于缺乏此类嵌合Fc结构域但其他方面都相同的抗原结合蛋白增加。COMPLEGENT?技术系统的方面描述于WO2007011041和US20070148165中，其都通过引用并入本文。在可替代的实施方案中，可以通过在IgG链的Fc区中引入序列特异性突变来增加CDC活性。本领域普通技术人员也将认识到其他合适系统。
在本发明的可替代实施方案中，提供了抗原结合蛋白，其包含具有改变的糖基化概况的重链恒定区，使得该抗原结合蛋白具有增强的效应子功能。例如，其中抗原结合蛋白具有增强的ADCC或增强的CDC或其中其具有增强的ADCC和CDC效应子功能。产生具有改变的糖基化概况的抗原结合蛋白的合适的方法的实例描述于WO2003011878、WO2006014679和EP1229125，所有这些都可以被应用到本发明的抗原结合蛋白。
本发明还提供了用于产生本发明的抗原结合蛋白的方法，其包含以下步骤：
a)在适合于表达抗原结合蛋白的条件下培养包含表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体包含如本文所述的分离核酸，其中在所述重组宿主细胞中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因已经失活；和
b)分离由重组宿主细胞产生的抗原结合蛋白。
本发明还提供了用于产生根据本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a)在重组宿主细胞中表达根据本发明的抗原结合蛋白，其中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因在重组宿主细胞中是失活的；和
b)分离由重组宿主细胞产生的抗原结合蛋白。
此类产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa,Inc.(LaJolla,CA,USA)获得的POTELLIGENT?技术系统进行，其中缺乏FUT8基因的功能性拷贝的CHOK1SV细胞产生具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性的单克隆抗体，该活性相对于具有功能性FUT8基因的细胞中产生的相同单克隆抗体增加。POTELLIGENT?技术系统的方面描述于US7214775、US6946292、WO0061739和WO0231240中，其都通过引用并入本文。本领域普通技术人员也将认识到其他合适系统。
在一个进一步方面，本发明提供了非岩藻糖基化的抗体。本文提及“非岩藻糖基化的”或“无岩藻糖基化的”抗体是指具有Fc的复杂型N-聚糖的三-甘露糖基核心结构而不具有岩藻糖残基的抗体。非岩藻糖基化的或无岩藻糖基化的本发明的抗体在连接至Asn297的核心碳水化合物结构上不包含岩藻糖。缺乏来自FcN-聚糖的核心岩藻糖残基的这些糖工程改造的抗体，由于FcγRIIIa结合能力的增强，可以表现出比岩藻糖基化的等效物更强的ADCC。
本领域技术人员将显而易见的是，此类修饰不仅可以单独使用，而且可以彼此组合使用以进一步增强效应子功能。
在本发明的一个此类实施方案中，提供了包含重链恒定区的抗原结合蛋白，所述重链恒定区包含突变和嵌合的重链恒定区。例如其中抗原结合蛋白包含至少一个来自人IgG3的CH2结构域和一个来自人IgG1的CH2结构域，其中IgG1CH2结构域在选自239和332和330的位置处具有一个或多个突变(例如突变可以选自S239D和I332E和A330L)以使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能。在该背景下，增强的效应子功能可以等于，例如，具有增强的ADCC或增强的CDC，例如其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。在一个实施方案中，IgG1CH2结构域具有突变S239D和I332E。
在本发明的可替代实施方案中，提供了包含嵌合重链恒定区且具有改变的糖基化概况的抗原结合蛋白。在一个这种实施方案中，重链恒定区包含至少一个来自IgG3的CH2结构域和一个来自IgG1的CH2结构域且具有改变的糖基化概况以使得岩藻糖与甘露糖的比率为0.8：3或更低，例如其中抗原结合蛋白经去岩藻糖基化以使得所述抗原结合蛋白与具有缺乏所述突变和改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区的等效抗原结合蛋白相比具有增强的效应子功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC，例如其中其具有增强的ADCC和增强的CDC。
在可替代的实施方案中，抗原结合蛋白具有至少一个人IgG3CH2结构域和至少一个来自人IgG1的重链恒定结构域，其中两个IgGCH2结构域都根据本文所述的限制进行突变。
在本发明的一个方面，提供了产生本文所述的本发明的抗原结合蛋白的方法，其包括以下步骤：
a)培养含有表达载体的重组宿主细胞，所述表达载体含有如本文所述的分离核酸，所述表达载体进一步包含编码含有源自人种系IgG1和IgG3序列的结构域的Fc区的Fc核酸序列，且其中在该重组宿主细胞中编码α-1,6-岩藻糖基转移酶的FUT8基因已经失活；和
b)回收抗原结合蛋白。
此类产生抗原结合蛋白的方法可以例如使用可以从BioWa,Inc.(LaJolla,CA,USA)获得的AccretaMab?技术系统进行，所述系统组合POTELLIGENT?和COMPLEGENT?技术系统以产生具有增强的ADCC和CDC活性的抗原结合蛋白，所述活性相对于缺乏嵌合Fc结构域且在寡糖上具有岩藻糖但其他方面相同的单克隆抗体增加。
在本发明的又另一个实施方案中，提供了包含突变和嵌合的重链恒定区的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白具有改变的糖基化概况以使得抗原结合蛋白具有增强的效应子功能，例如其中其具有一种或多种下列功能：增强的ADCC或增强的CDC。在一个实施方案中，突变选自239和332和330位，例如突变选自S239D和I332E和A330L。在进一步实施方案中，重链恒定区包含至少一个来自人IgG3的CH2结构域和一个来自人IgG1的CH2结构域。在一个实施方案中，重链恒定区具有改变的糖基化概况使得岩藻糖和甘露糖的比率为0.8:3或更低，例如抗原结合蛋白是去岩藻糖基化的，使得所述抗原结合蛋白与等效非嵌合抗原结合蛋白或缺乏所述突变和具有改变的糖基化概况的免疫球蛋白重链恒定区相比具有增强的效应子功能。
半衰期延长
增加的半衰期，或半衰期延长，可用于体内应用抗原结合蛋白，特别是抗体，最特别是小尺寸的抗体片段。此类片段(Fvs，二硫键键合的Fvs、Fabs、scFvs、dAbs)通常从体内迅速清除。可以改变或修饰根据本公开的抗原结合蛋白，以提供体内抗原结合蛋白的功能活性的增加的体内血清半衰期，因此更长的持久性、或停留时间。合适地，此类修饰的分子与未改变的分子相比具有降低的清除率和增加的平均停留时间。增加的半衰期可以改善治疗分子的药代动力学和药效动力学特性，也可以对于改善的患者顺应性是重要的。
短语“半衰期”(“t_1/2”)和“血清半衰期”是指根据本公开的抗原结合蛋白的血清(或血浆)浓度在体内减少50％(例如，由于抗原结合蛋白的降解和/或抗原结合蛋白通过天然机制清除或遮蔽)而花费的时间。
本公开的抗原结合蛋白可以通过结合至抵抗降解和/或清除或遮蔽的分子(“半衰期延长部分”或“延长半衰期的分子”)而在体内稳定化且增加它们的半衰期。半衰期延长策略综述于，例如，“TherapeuticProteins:StrategiestoModulateTheirPlasmaHalf-Lives”，由RolandKontermann编辑,Wiley-Blackwell,2012,ISBN:978-3-527-32849-9。合适的半衰期延长策略包括：PEG化、多唾液酸化、HES化、重组PEG模拟物、N-糖基化、O-糖基化、Fc融合、工程改造的Fc、IgG结合、白蛋白融合、白蛋白结合、白蛋白偶联和纳米颗粒。
在一个实施方案中，所述半衰期延长部分或分子是聚乙二醇部分或PEG模拟物。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含(任选由其组成)连接至聚乙二醇部分的本公开的单一可变结构域(任选地，其中所述部分具有大小为约20至约50kDa，任选地约40kDa直链或分枝PEG)。关于结构域抗体和结合部分的PEG化的更多细节，参考WO04081026。在一个实施方案中，拮抗剂由连接至PEG的结构域抗体单体组成，其中所述结构域抗体单体是根据本公开的单一可变结构域。合适的PEG模拟物综述于，例如，第4章，第63-80页，“TherapeuticProteins:StrategiestoModulateTheirPlasmaHalf-Lives”，由RolandKontermann编辑,Wiley-Blackwell,2012,ISBN:978-3-527-32849-9。
抗体的Fc区和各种Fc受体(FcγR)之间的相互作用据信介导抗体或抗体片段的吞噬作用和半衰期/清除。新生儿FcRn受体被认为涉及抗体清除和跨越组织的转胞吞作用(参见Junghans(1997)Immunol.Res16：29-57；和Ghetie等人(2000)Annu.Rev.Immunol.18：739-766)。在一个实施方案中，半衰期延长部分可以是来自抗体的Fc区。此类Fc区可以根据期望特性并入各种修饰。例如，可以将补救受体结合表位掺入抗体内，以增加血清半衰期，参见US5,739,277。
被确定与人FcRn直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。因此，在本节中描述的任何位置的取代可以实现抗体的增加的血清半衰期和/或改变的效应物特性。
通过融合至Fc区的半衰期延长综述于，例如，第9章，第157-188页，“TherapeuticProteins:StrategiestoModulateTheirPlasmaHalf-Lives”，由RolandKontermann编辑,Wiley-Blackwell,2012,ISBN:978-3-527-32849-9。
通常，增强体内血清半衰期的多肽，即延长半衰期的分子，是体内天然存在且抵抗内源机制的降解或去除(其从生物体(例如，人)去除不需要的物质)的多肽。通常，此类分子是天然存在的蛋白，其本身具有长体内半衰期。
例如，增强体内血清半衰期的多肽可以选自来自细胞外基质的蛋白，血液中发现的蛋白，在血脑屏障或神经组织中发现的蛋白，定位于肾脏、肝脏、肌肉、肺、心脏、皮肤或骨骼的蛋白，应激蛋白，疾病特异性蛋白或参与Fc转运的蛋白。合适的多肽描述于，例如，WO2008/096158。
此类方法也可用于将根据本公开的抗原结合蛋白(例如，单一可变结构域)靶向递送至目标组织。在一个实施方案中，提供了根据本公开的高亲和力单一可变结构域的靶向递送。
在一个实施方案中，根据本公开的抗原结合蛋白，例如，单一可变结构域，可以连接，即缀合或结合至血清白蛋白、其片段和类似物。通过融合至白蛋白的半衰期延长综述于，例如，第12章，第223-247页，“TherapeuticProteins:StrategiestoModulateTheirPlasmaHalf-Lives”，由RolandKontermann编辑,Wiley-Blackwell,2012,ISBN:978-3-527-32849-9。
合适的白蛋白、白蛋白片段或白蛋白变体的实例描述于，例如，WO2005077042和WO2003076567。
在另一个实施方案中，根据本公开的单一可变结构域、多肽或配体，可以连接，即缀合或结合至转铁蛋白、其片段和类似物。
在一个实施方案中，半衰期延长可以通过靶向增加体内半衰期的抗原或表位来实现。抗原结合蛋白的流体动力学大小及其血清半衰期可以通过将本公开的抗原结合蛋白缀合或结合至结合天然存在的分子且增加体内半衰期的结合结构域而增加。
例如，根据本发明的抗原结合蛋白可以缀合或连接至抗血清白蛋白或抗新生儿Fc受体抗体或抗体片段，例如抗SA或抗新生儿Fc受体dAb、Fab、Fab'或scFv，或抗SA亲和体或抗新生儿Fc受体亲和体或抗SA亲合体(avimer)，或抗SA结合结构域，其包含选自，但不限于，CTLA-4、脂质运载蛋白、SpA、亲和体、亲合体、GroEL和纤连蛋白的支架(对于这些结合结构域的公开内容，参见WO2008096158)。缀合是指包含本公开的多肽、dAb或拮抗剂的组合物，所述本公开的多肽、dAb或拮抗剂键合(共价或非共价)至结合结构域诸如结合血清白蛋白的结合结构域。
在另一个实施方案中，所述结合结构域可以是多肽结构域诸如白蛋白结合结构域(ABD)或结合白蛋白的小分子(综述于，例如第14章，第269-283页和第15页，第285-296页，“TherapeuticProteins:StrategiestoModulateTheirPlasmaHalf-Lives”，由RolandKontermann编辑,Wiley-Blackwell,2012,ISBN:978-3-527-32849-9)。
在一个实施方案中，提供了包含根据本发明的抗原结合蛋白和抗血清白蛋白或抗新生儿Fc受体抗体或抗体片段的融合蛋白。
IgG抗体的长半衰期据报道取决于其与FcRn的结合。因此，已经广泛研究了通过工程改造恒定区在pH6.0增加IgG与FcRn的结合亲和力、同时维持相互作用的pH依赖性的取代(Ghetie等人,NatureBiotech.15:637-640,1997;Hinton等人,JBC279:6213-6216,2004;Dall'Acqua等人,10JImmunol117:1129-1138,2006)。另一种修饰本发明的抗原结合蛋白的方式涉及通过修饰免疫球蛋白恒定结构域或FcRn(新生Fc受体)结合结构域来延长此类蛋白的体内半衰期。
在成年哺乳动物中，FcRn也称为新生Fc受体，通过充当结合且补救IgG同种型的抗体不受降解的保护性受体，在维持血清抗体水平中起关键作用。IgG分子被内皮细胞内吞，如果它们与FcRn结合，那么再循环进入循环内。相比之下，不与FcRn结合的IgG分子进入细胞，靶向溶酶体途径，在其中它们被降解。
据信新生FcRn受体既参与抗体清除又参与组织间的胞转作用(参见JunghansR.P(1997)Immunol.Res16.29-57和Ghetie等人(2000)Annu.Rev.Immunol.18,739-766)。确定与人FcRn直接相互作用的人IgG1残基包括Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435。在此部分所述的任何这些位置处的改变可能允许提高本发明抗原结合蛋白的血清半衰期和/或改变其效应性质。
本发明的抗原结合蛋白可以具有增加恒定结构域或其片段对FcRn的亲和力的氨基酸修饰。延长治疗性和诊断性IgG和其他生物活性分子的半衰期可以具有多种益处，包括降低这些分子的给药的量和/或频率。因此，在一个实施方案中，提供了本文提供的本发明的抗原结合蛋白或融合蛋白，其包含具有一个或多个这些氨基酸修饰的IgG恒定结构域的全部或部分(FcRn结合部分)和缀合于这种修饰的IgG恒定结构域的非IgG蛋白或非蛋白分子，其中存在修饰的IgG恒定结构域延长抗原结合蛋白的体内半衰期。
PCT公开号WO00/42072公开了包含具有改变的FcRn结合亲和力的变体Fc区的多肽，所述多肽包含在Fc区的下列氨基酸位置的任一个或多个处的氨基酸修饰：238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和447，其中Fc区中残基的编号是EU索引的编号(Kabat等人)。
PCT公开号WO02/060919A2公开了包含IgG恒定结构域的修饰IgG，相对于野生型IgG恒定结构域，所述IgG恒定结构域包含一个或多个氨基酸修饰，其中，与具有野生型IgG恒定结构域的IgG的半衰期相比，所述修饰IgG具有增加的半衰期，且其中一个或多个氨基酸修饰是在位置251、253、255、285-290、308-314、385-389和428-435中的一个或多个处。
Shields等人(2001,JBiolChem;276:6591-604)使用丙氨酸扫描诱变来改变人IgG1抗体的Fc区中的残基，然后评价与人FcRn的结合。在改变为丙氨酸时有效废除与FcRn的结合的位置包括I253、S254、H435和Y436。在结合中显示较不显著的减少的其他位置如下：E233-G236、R255、K288、L309、S415和H433。几个氨基酸位置在改变为丙氨酸时显示FcRn结合的改善；这些位置中尤其是P238、T256、E272、V305、T307、Q311、D312、K317、D376、E380、E382、S424和N434。许多其他氨基酸位置显示FcRn结合的轻微改善(D265、N286、V303、K360、Q362和A378)或无变化(S239、K246、K248、D249、M252、E258、T260、S267、H268、S269、D270、K274、N276、Y278、D280、V282、E283、H285、T289、K290、R292、E293、E294、Q295、Y296、N297、S298、R301、N315、E318、K320、K322、S324、K326、A327、P329、P331、E333、K334、T335、S337、K338、K340、Q342、R344、E345、Q345、Q347、R356、M358、T359、K360、N361、Y373、S375、S383、N384、Q386、E388、N389、N390、K392、L398、S400、D401、K414、R416、Q418、Q419、N421、V422、E430、T437、K439、S440、S442、S444和K447)。
针对具有改善的与FcRn的结合的组合变体发现了最显著的效果。在pH6.0下，相对于天然IgG1，与E380A好2倍和N434A好3.5倍相比，E380A/N434A变体显示与FcRn的结合好超过8倍。向其中加入T307A导致结合相对于天然IgG1改善12倍。在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含E380A/N434A突变且增强了与FcRn的结合。
Dall'Acqua等人(2002,JImmunol.;169:5171-80)描述了针对小鼠FcRn的人IgG1铰链-Fc片段噬菌体展示文库的随机诱变和筛选。他们公开了251、252、254-256、308、309、311、312、314、385-387、389、428、433、434和436位的随机诱变。IgG1-人FcRn复合体稳定性的主要改善存在于定位在横跨Fc-FcRn界面的带中的取代残基中(M252、S254、T256、H433、N434和Y436)，且以较小的程度存在于外周残基如V308、L309、Q311、G385、Q386、P387和N389的取代。通过组合M252Y/S254T/T256E和H433K/N434F/Y436H突变获得了对人FcRn具有最高亲和力的变体，且相对于野生型IgG1显示亲和力增加57倍。与野生型IgG1相比，这种突变的人IgG1的体内行为显示在食蟹猴中的血清半衰期增加近4倍。
因此本发明提供了与FcRn优化结合的抗原结合蛋白的变体。在优选的实施方案中，抗原结合蛋白的所述变体包含在所述抗原结合蛋白的Fc区中的至少一个氨基酸修饰，其中与所述亲本多肽相比，所述修饰选自Fc区的226、227、228、230、231、233、234、239、241、243、246、250、252、256、259、264、265、267、269、270、276、284、285、288、289、290、291、292、294、297、298、299、301、302、303、305、307、308、309、311、315、317、320、322、325、327、330、332、334、335、338、340、342、343、345、347、350、352、354、355、356、359、360、361、362、369、370、371、375、378、380、382、384、385、386、387、389、390、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401403、404、408、411、412、414、415、416、418、419、420、421、422、424、426、428、433、434、438、439、440、443、444、445、446和447，其中Fc区中的氨基酸的编号是Kabat的EU索引的编号。
在本发明的进一步方面，修饰是M252Y/S254T/T256E。
此外，各种出版物描述了用于获得通过以下改变其半衰期的生理活性分子的方法：通过将FcRn结合多肽引入分子中(WO97/43316；美国专利号5,869,046；美国专利号5,747,035；WO96/32478；WO91/14438)；或通过使分子与保留FcRn结合亲和力但对其他Fc受体的亲和力已经大大降低的抗体融合(WO99/43713)或与抗体的FcRn结合结构域融合(WO00/09560；美国专利号4,703,039)。
尽管恒定区中的取代能够显著改善治疗性IgG抗体的功能，但严格保守的恒定区中的取代在人中具有免疫原性的风险(Presta,同上,2008;DeGroot和Martin,ClinImmunol131:189-201,2009)且高度多样化可变区序列中的取代可能免疫原性更低。涉及可变区的报道包括工程改造CDR残基以改善与抗原的结合亲和力(Rothe等人,ExpertOpinBiolTher6:177-187,2006;Bostrom等人,MethodsMolBioi525:353-376,2009;Thie等人,MethodsMolBiol525:309-322,2009)，和工程改造CDR和框架残基以改善稳定性(Worn和Pluckthun,JMolBiol305:989-1010,2001;Ewert等人,Methods34:184-199,2004)，且降低免疫原性风险(DeGroot和Martin,同上,2009;Jones等人,MethodsMolBiol525:405-423,xiv,2009)。如报道，与抗原的改善亲和力可以通过使用随机化文库的噬菌体或核糖体展示的亲和力成熟来实现。
改善的稳定性可以合理地获得自基于序列和结构的合理设计。降低的免疫原性风险(去免疫化)可以通过各种人源化方法和去除T细胞表位来实现，其可以使用计算机芯片上的技术来预测或通过体外测定法来测定。此外，已经工程改造可变区以降低pI。观察到这些抗体与野生型抗体相比较长的半衰期，尽管FcRn结合相当。如果抗原介导的清除机制当抗体结合至抗原时通常降解抗体，则可以缩短工程改造或选择具有pH依赖的抗原结合的抗体以改变抗体和/或抗原半衰期，例如IgG2抗体半衰期。类似地，抗原：抗体复合物可以影响抗原的半衰期，或者通过保护抗原免于典型的降解过程而延长半衰期，或者经由抗体介导的降解而缩短半衰期。一个实施方案涉及与内体pH(即，pH5.5-6.0)相比在pH7.4具有对于抗原的更高亲和力的抗体，使得在pH5.5/pH7.4或在pH6.0/pH7.4的KD比率为2或更高。例如，为了增强抗体的药代动力学(PK)和药效动力学(PD)特性，可能通过将组氨酸引入CDR残基而工程改造pH敏感的与抗体的结合。
药物组合物
本发明的抗原结合蛋白将通常，但不必，在施用于患者之前配制为药物组合物。因此，在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，其包含根据本发明的抗原结合蛋白和一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或载体。
用于制备此类药物组合物的方法是本领域技术人员众所周知的(例如，RemingtonsPharmaceuticalSciences,第16版(1980)MackPublishingCoandPharmaceuticalBiotechnology;Plenumpublishingcorporation;第2、5和9卷)。
本发明的抗原结合蛋白可以以任何方便的方式配制用于施用。药物组合物可以，例如，通过注射或连续输注而施用(例如包括，但不限于，静脉内、腹膜内、皮内、皮下、肌内和静脉内)。在一个实施方案中，所述组合物适合于皮下注射。
药物组合物可以适合于局部施用(包括，但不限于，表皮、吸入、鼻内或眼部施用)或经肠施用(其包括，但不限于，口服或直肠施用)。
药物组合物可以包含0.0001mg/kg至10mg/kg的抗原结合蛋白，例如0.1mg/kg至5mg/kg的抗原结合蛋白。或者，所述组合物可以包含1.0mg/kg至3.0mg/kg。
除了本发明的抗原结合蛋白以外，药物组合物可以包含一种或多种其他治疗剂。可以与本发明的抗原结合蛋白组合的额外治疗剂包括，但不限于，抗CTLA-4(例如，伊匹单抗(ipilimumab)和tremelimumab)、抗TIM-3、抗OX40、抗OX40L、抗PD1(例如，nivolumab、lambrolizumab)、抗PD1L、抗GITR、抗IL-5(例如，美泊利单抗(mepolizumab)、抗B淋巴细胞细胞活化(BLyS)因子(例如，贝利单抗(belimumab))、抗GITRL、抗IL-7、抗IL-7R、抗CD20、抗CCL20、抗TNFα、抗OSM和抗IL-6抗体，以及JAK、CCR9、RIP激酶、BET蛋白、RORγ1和巯基嘌呤的抑制剂。
本发明的抗原结合蛋白和用于组合治疗的一种或多种其他治疗剂可以被一起配制在相同组合物中或呈现于分开的组合物中。可以同时或相继施用分开呈现的组合物。
使用方法
本文所述的抗原结合蛋白可用于治疗中。本发明的结合淋巴细胞活化基因3(LAG-3)且引起LAG-3+活化的T细胞的耗竭的抗原结合蛋白可用于治疗或预防与致病性T细胞的参与相关的疾病，诸如自身免疫疾病、感染性疾病、过敏性疾病和癌症。
其中抗原结合蛋白具有潜在有益效果的疾病状态的实例包括自身免疫疾病，包括但不限于银屑病、炎性肠病(例如，克罗恩病和/或溃疡性结肠炎)、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、Sj?gren氏综合征、多发性硬化症、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、I型糖尿病强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、格雷夫斯氏病、移植物抗宿主病、治疗和/或预防器官移植物排斥，例如肾或肝移植物排斥、原发性硬化性胆管炎、结节病、血管炎、肾炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、系统性硬化、乳糜泻、抗磷脂抗体综合征、斑秃和重症肌无力；传染病，包括，但不限于丙型肝炎、乙型肝炎、HIV、结核病和疟疾；和过敏性疾病，包括，但不限于，哮喘、特应性皮炎和COPD。
本发明的抗原结合蛋白还可用于治疗癌症，包括，但不限于卵巢癌、黑色素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、前列腺癌、肠癌(例如，结肠癌和小肠的癌症)、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、肾癌(例如，透明细胞癌)、胰腺癌、子宫癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、口腔癌、脑癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌以及血液学恶性肿瘤包括骨髓瘤和慢性和急性白血病。
本领域技术人员将理解，除了确立状况的治疗以外，本文提及“治疗”或“疗法”可以，根据状况，延伸至确立状况的预防。
因此，作为本发明的进一步方面，提供了本发明的抗原结合蛋白，其用于治疗中。
因此还提供了本发明的抗原结合蛋白，其用于治疗银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、SLE、Sj?gren氏综合征、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎。
在一个进一步实施方案中，提供了本发明的抗原结合蛋白，其用于治疗银屑病。
在一个进一步实施方案中，提供了本发明的抗原结合蛋白，其用于治疗克罗恩病。
在一个进一步实施方案中，提供了本发明的抗原结合蛋白，其用于治疗溃疡性结肠炎。
进一步提供了本发明的抗原结合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、Sj?gren氏综合征、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎。
在一个进一步实施方案中，提供了本发明的抗原结合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗银屑病。
在一个进一步实施方案中，提供了本发明的抗原结合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗克罗恩病。
在一个进一步实施方案中，提供了本发明的抗原结合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗溃疡性结肠炎。
进一步提供了治疗人或动物主体的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明的抗原结合蛋白。
进一步提供了治疗人或动物主体中的与致病性T细胞的参与相关的疾病的方法，其包括施用治疗有效量的本发明的抗原结合蛋白。
进一步提供了治疗银屑病、克罗恩病、类风湿性关节炎、原发性胆汁性肝硬化、系统性红斑狼疮(SLE)、Sj?gren氏综合征、多发性硬化症、溃疡性结肠炎和自身免疫性肝炎的方法，所述方法包括向有需要的人主体施用治疗有效量的本发明的抗原结合蛋白。
在一个进一步实施方案中，提供了治疗银屑病的方法，所述方法包括向有需要的人主体施用治疗有效量的本发明的抗原结合蛋白。
在一个进一步实施方案中，提供了治疗克罗恩病的方法，所述方法包括向有需要的人主体施用治疗有效量的本发明的抗原结合蛋白。
在一个进一步实施方案中，提供了治疗溃疡性结肠炎的方法，所述方法包括向有需要的人主体施用治疗有效量的本发明的抗原结合蛋白。
如本文所使用的短语“治疗有效量”是本发明的抗原结合蛋白改善或减少疾病的一种或多种症状或预防或治愈所述疾病所需的量。
实施例
以下实施例说明、但不限制本发明。
实施例1：纯化的抗LAG-3人源化抗体的Biacore^TMSPR分析
如WO2008/132601中公开的A9H12(IMP731)通过将鼠CDR嫁接至两个重链和两个轻链人受体构架上而进行人源化。制备许多重链和轻链人源化抗LAG-3变体，其含有人至鼠回复突变和CDR修饰。重链变体被编号为H0至H8，和J0、J7至J13，且轻链变体被编号为L0至L10和M0至M1。分析含有重链和轻链人源化抗LAG-3变体的所有组合的组织培养上清液与Fc标记的重组可溶性LAG-3(IMP321)的结合。使用Biacore^TM4000软件固有的1:1模型分析数据。基于计算的亲和力且还通过与嵌合抗体IMP731的结合传感图的目视比较选择抗体。鉴定表现出等效或改进的与IMP321结合的总共54个构建体，用于使用Biacore^TM3000重新分析。将数据拟合至BiaCore3000分析软件固有的1:1和二价模型两者，且通过将结合曲线在最大结合处均一化且目视比较针对IMP731的解离速率而比较结合数据。这使得能够辨别表明与IMP731相比改善的解离速率的抗体。基于与IMP731相比与重组sLAG-3的等效或改进的结合动力学选择总共18种人源化抗LAG-3抗体用于进一步分析。如下重新表达和分析这18种人源化抗体：
抗LAG-3人源化抗体在HEK2936E细胞中表达且通过亲和层析纯化，如下：
100ml规模HEK2936E表达
将编码表3中鉴定的人源化抗体的重链和轻链的表达质粒瞬时共转染至HEK2936E细胞中，且以100ml规模表达以产生抗体。
人源化抗体的纯化
表达的抗体分子通过亲和层析纯化。将蛋白A琼脂糖珠粒(GEHealthcare目录号17-5280-04)添加至细胞培养物上清液，且在室温混合30-60分钟。蛋白A琼脂糖珠粒然后离心，且在PBS中洗涤。然后将混合物添加至10ml一次性柱(Pierce目录号:29924)中，且使PBS排出。用10mlPBS洗涤柱3次，然后用IgG洗脱缓冲液(Pierce目录号:21009)洗脱抗体。洗脱的抗体立即使用1MTrizma?盐酸缓冲液(T2819)中和，然后使用Vivaspin6mwco5000柱(目录号:FDP-875-105D)缓冲液交换至PBS中。通过测量280nm的吸光度测定产率。通过大小排阻色谱测定纯化样品中的聚集蛋白的水平。
结合动力学
通过SPR使用Biacore^TM3000评价纯化抗体对于sLAG-3分子的的结合动力学。通过伯胺偶联将山羊抗人κ抗体(SouthernBiotech,目录号2060-01)固定在CM5芯片上。将人源化抗LAG3抗体捕获在该表面上，且LAG3-Ig分子IMP321(ChrystelleBrignone,CarolineGrygar,ManonMarcu,KnutSchakel,FredericTriebel,TheJournalofImmunology,2007,179:4202-4211)以64nM用作分析物，缓冲注射(即，0nM)用于双重参考结合曲线。用10mM甘氨酸，pH1.5再生。使用HBS-EP作为运行缓冲液且在25℃在Biacore^TM3000上实施运行。针对在最大结合的结合将传感图进行均一化，且通过目视检查传感图概况而比较针对IMP731的解离速率。
结果显示，纯化的人源化抗LAG-3抗体可以分为3组；具有似乎在与IMP321的结合中比嵌合IMP731更好的人源化变体的组1，具有似乎以非常类似的方式与IMP731结合的变体的组2，和具有表明比IMP731更差结合的变体的组3。
10种人源化变体落入组1，且表明当通过目视检查Biacore^TM传感图与IMP731比较时改进的(即，降低的)解离速率。所有这些分子含有L7轻链，其在轻链CDR1中的位置27e含有甘氨酸至脯氨酸取代。该数据表明，当与许多人源化重链配对时，在位置27e的脯氨酸改善了人源化抗LAG-3抗体对于IMP321的解离速率。
剩下的测试抗体中，4种分子落入组2中，且具有与嵌合IMP731抗体类似的解离速率，而4种其他分子落入组3中，且表现出比IMP731更差的解离速率。表3提供了那些分子与IMP731相比的近似排名。通过目视检查Biacore^TM传感图，H5L7在该实验中表现出最好的(即，最低的)解离速率。
表3：解离速率与IMP731的比较
人源化变体与IMP731的解离速率比较解离速率的等级次序H5L7更好1H1L7更好2J7L7更好3H4L7更好4J11L7更好5H2L7更好6J13L7更好7H7L7更好8J0L7更好9H0L7更好10H1L1相同H5L1相同J7L1相同J11L1相同J13L1更差H7L1更差J0L1更差H0L1更差
实施例2：使用Biacore^TMT100结合分析野生型岩藻糖基化和无岩藻糖基化人源化抗LAG-3抗体与重组人LAG-3-His的结合
通过在BioWaPOTELLIGENT?(FUT8敲除的CHO)细胞系中表达编码H5L7的质粒而生成无岩藻糖基化抗体H5L7BW。已经显示使用POTELLIGENT?技术产生的无岩藻糖基化抗体通过增加的与FcγRIIIa(CD16)的亲和力表现出与等效的高度岩藻糖基化的常规抗体相比增加的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
使用Biacore?T100(GEHealthcare?)比较野生型岩藻糖基化和无岩藻糖基化抗体与具有C-末端His6的重组人LAG-3ECD(SEQIDNO:51)结合的能力。通过伯胺偶联将蛋白A固定在CM5芯片上。该表面然后用于捕获人源化抗体。重组人LAG-3ECD-His6然后通过32、8、2、0.5和0.125nM的捕获抗体上，且使用50mMNaOH实施再生。用缓冲液注射(即，0nM)双重参考结合曲线，且使用1:1模型将数据拟合至T100分析软件。使用HBS-EP作为运行缓冲液在25℃实施运行。
为了研究该动力学数据的统计显著性，该实验用相同批次的四种抗体和嵌合对照重复3次。在分开统计分析之前各自对数(基数10)转换KD、ka和kd参数。对于各参数，对转换的数据(包括对于运行(随机区组效应)和抗体的术语)进行了混合模型方差分析(‘Anova’)。
从Anova，对于每种抗体预测几何平均值，连同各平均值的统计可信的范围(95％置信区间)。在Anova内进行抗体的计划比较。将比较呈现为比较的两种抗体的比率，再次连同95％置信区间和p值。该比率也可被解释为倍数变化，例如，0.1的比率对应于90％降低。
对于人源化抗体和嵌合对照IMP731中的每种衍生结合亲和力(KD)的几何平均值，显示于表4中。H5L7的平均KD为0.2075nM，当与IMP731比较时显著降低92％(即，10倍降低)，p<0.0001。IMP731表现出2.76nM的平均KD。无岩藻糖基化的H5L7BW表现出与岩藻糖基化的H5L7等效的结合，几何KD为0.2179nM，没有显著差异(p=0.1790)。
抗体对于LAG-3-ECD-His6的解离速率的差异主要驱动对于H5L7观察到的与IMP731相比的亲和力的改善，显示于表5中。与IMP731相比，对于H5L7的kd存在近似85％降低(即，几乎10倍降低)，这是高度统计显著的。无岩藻糖基化的H5L7BW和H5L7之间没有显著差异(p=0.4408)。
表4：岩藻糖基化和无岩藻糖基化的抗LAG-3变体与重组人LAG-3-His的结合的KD的统计评估

表5：岩藻糖基化和无岩藻糖基化的抗LAG-3变体与重组人LAG-3-His的结合的kd的统计评估

实施例3：使用ProteOn?评估抗LAG-3人源化变体与嵌合抗体IMP731相比的LAG-3-His结合表位
用H5L7进行表位分级实验以评估IMP731结合其内的LAG-3表位在人源化之后是否是保守的。此外，还比较岩藻糖基化和无岩藻糖基化的人源化变体的结合表位。
使用ProteOn^TMXPR36(BioRad^TM)生物传感器机器，通过评价抗LAG-3抗体是否能够同时结合与捕获在ProteOn^TM芯片表面上的抗体的复合物中的LAG-3-His，评估表位结合。IMP731和非竞争性鼠抗体17B4用作该测定中的对照。
使用Ez-Link-sulfo-NHS生物素化试剂盒将待测试的抗体进行生物素化。使用垂直注射将各生物素化的抗体捕获在中性抗生物素蛋白NLC芯片上的单独流动室上。抗体捕获之后，用2.5mg/ml的生物胞素封闭表面。使用ProteOn运行软件固有的共注射设施，将LAG-3ECD-His6以100nM注射在偶联抗体上，随后以100nM注射未生物素化的抗体，其中两次注射是水平的，使得LAG-3-His和抗体交叉所有6种中性抗生物素蛋白捕获的抗体。在25℃且在ProteOnXPR36蛋白相互作用阵列系统上的HBS-EP中运行测定。
使用在LAG-3-His注射之后取的报道点和在非生物素化的抗体分析物注射之后取的报道点实施数据分析。通过从用LAG-3ECD-His6结合看到的反应减去用抗体结合看到的反应而计算总体反应。正共振单元(RU)值意指，抗体分析物注射物已经结合至与中性抗生物素蛋白捕获表面上的生物素化抗体复合的LAG-3ECD-His6，表明在非竞争性表位的结合。无反应或负反应意指，抗体分析物注射物没有结合至与中性抗生物素蛋白捕获表面上的生物素化抗体复合的LAG-3ECD-His6，表明抗体在竞争性表位结合。
抗LAG-3人源化变体(岩藻糖基化的和无岩藻糖基化的)无法结合至与IMP731复合的人LAG-3ECD-His6，表明共享LAG-3ECD-His6的表位，因此是保守的。鼠抗体17B4能够结合至与IMP731复合的人LAG-3ECD-His6，证实该抗体与IMP731对于LAG-3ECD-His6结合是非竞争性的。相反，人源化抗体能够结合至与17B4复合的人LAG-3ECD-His6。
该结果证实，在本实验中测试的嵌合IMP731和IMP731的人源化变体之间的表位中没有改变。本实验还显示，岩藻糖基化和无岩藻糖基化抗体之间对于结合没有差异。
实施例4：使用Biacore?T100分析抗LAG-3人源化抗体与重组食蟹猴和狒狒LAG-3ECD-His6的结合
使用Biacore?T100(GEHealthcare^TM)评价抗LAG-3人源化抗体对于食蟹猴(食蟹猴)和狒狒重组LAG-3ECD-His6两者(分别为SEQIDNO52和53)的结合交叉反应性。
通过伯胺偶联将蛋白A固定在CM5芯片上。该表面然后用于捕获人源化抗体。内部生成的重组食蟹猴和狒狒LAG-3ECD-His6然后通过捕获的抗体上，且使用50mMNaOH实施再生。LAG-3ECD-His6以16、4、1、0.25和0.0625nM通过。用缓冲液注射(即，0nM)双重参考结合曲线，且使用1:1模型将数据拟合至T100分析软件。使用HBS-EP作为运行缓冲液在37℃实施运行。
H5L7、H5L7BW和IMP731以相当的亲和力结合至食蟹猴和狒狒重组LAG-3ECD-His6两者。从分开实验生成数据，然而，嵌合抗体IMP731用作实验之间的对照。
该数据表明，两种非人灵长类动物重组LAG-3直向同源物结合至H5L7来源的抗体，与人重组LAG-3ECD-His6(SEQIDNO:51)相比，亲和力改善10倍(H5L7：人LAG-30.208nM，食蟹猴LAG-30.017nM和狒狒LAG-30.022nM；H5L7BW人LAG-30.218nM，食蟹猴LAG-30.021nM和狒狒LAG-30.024nM)。同时两种非人灵长类动物重组LAG-3直向同源物结合至IMP731来源的抗体，与人重组LAG-3ECD-His6(SEQIDNO:51)相比，亲和力改善近似100倍(IMP731：人LAG-32.76nM，食蟹猴LAG-30.021nM和狒狒LAG-30.019nM)。
实施例5：H5L7BW、H5L7和IMP731与表达人LAG-3的EL4细胞和人原代活化的CD3+T细胞的结合概况
将表达人LAG-3的EL4细胞与至多50μg/ml的不同浓度的IMP731、H5L7或H5L7BWAlexa647-缀合的抗体在室温孵育30分钟。细胞用FACS缓冲液(PBS+0.5%BSA)洗涤，以去除未结合的抗体。
通过阴性选择使用UntouchedHumanTcellDynal珠粒从PBMC制备CD3⁺T细胞。CD3⁺T细胞通过与固定的抗-CD3和抗-CD28和可溶性重组人IL-12在37℃孵育3天来活化。活化的细胞与至多3μg/ml的不同浓度的Alexa647-缀合的抗体在室温孵育30分钟。细胞用FACS缓冲液(PBS+0.5%BSA)洗涤。
EL4细胞和CD3⁺T细胞通过FACS使用BeckmanCoulterFC500流式细胞仪进行分析。FACS原始数据使用CXPAnalysis软件(BeckmanCoulter)进行分析。将数据最初绘制在前向散射vs侧向散射图，且门控目标细胞群体。该门控群体然后绘制为展示荧光强度和计算的平均荧光强度(MFI)的柱状图。然后在GraphPadPrism5软件中绘制MFI值以生成剂量响应曲线。
H5L7BW、H5L7和IMP731与表达人LAG-3的EL4细胞和人原代活化的CD3+T细胞的结合概况显示于图1中。所述三种抗体表现出与表达人LAG-3的EL4细胞(图1A)和活化的人CD3+T细胞(图1B)的类似的结合特征。
实施例6：通过原代人T细胞中的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)评价H5L7BW和H5L7的耗竭活性
筛选这些实验中使用的供体对Revaxis(白喉、破伤风和脊髓灰质炎)中存在的CD4抗原和对CMVpp65肽合并物或CD8肽合并物(其含有针对CMV、EBV和流感的肽表位)的再呼叫应答(re-callresponses)。用于进行初始研究的抗原是CMVpp65肽合并物。然而，由于表现出对该抗原的再呼叫应答的供体的数目有限，Revaxis和CD8肽合并物是用于生成抗LAG3抗体的大多数功效数据的抗原。
外周血在实验的第0天(25mL)和第5天(75mL)收集自健康人志愿者，且用于通过ficollplaque密度梯度离心制备单核细胞。在第0天制备的PBMC使用CellTrace?Violet细胞增殖试剂盒根据制造商的说明进行标记，其后将其洗涤，以2x106/mL的密度接种于24孔平底组织培养板中的培养基中，且用抗原刺激(Revaxis和CD8肽合并物以1/1000的稀释度使用；CMVpp65肽以1/100的稀释度使用)。将PBMC在5%CO2润湿培养箱中在37℃孵育5天。
通过阴性选择使用来自Invitrogen或MiltenyiBiotec的试剂盒根据各制造商的具体说明从在实验的第5天制备的PBMC纯化自体供体NK细胞。将纯化的NK细胞计数且在培养基中稀释至1.3x106/mL的密度。
将已经用抗原刺激5天的细胞洗涤，计数且在培养基中稀释至2x106/活细胞/mL的密度。
将自体供体NK细胞(80μL)和抗原活化的细胞(100μL)移取至具有测试抗体或培养基(20μL)的圆底5mL聚苯乙烯FACS管中。测试的抗LAG-3抗体的最终浓度范围为1000至0.015ng/mL。将样品在5%CO2润湿培养箱中在37℃孵育18小时。18小时之后，使用流式细胞术分析ADCC测定样品的抗原特异性LAG-3阳性T细胞的存在。简而言之，将样品在FACS缓冲液中洗涤，用人IgG(3μg/管)封闭，且与小鼠抗人CD4、CD8、CD337、CD25和LAG-3荧光染料(flurochrome)缀合的抗体在黑暗中在室温孵育30分钟。在PBS中进一步洗涤步骤之后，将细胞在可固定绿色死细胞存在的情况下在黑暗中在室温孵育30分钟。将样品最终用PBS洗涤，固定，且通过流式细胞术使用60秒采集时间以1μL/秒的流速进行分析。
使用具有FACSDiva软件6.1.3版本的BDFACSCantoII流式细胞仪(BDBioSciences采集所有样品数据。活/死可固定绿色死细胞染色用作死细胞排除标志物，且适当的同种型和FMO-1对照用于定义阴性群体。简而言之，使用前向散射(FSC-A)针对FL1(绿色死细胞染色)中的荧光的图从分析省略死细胞。然后使用FSC-W针对FSC-H的图从分析中排除双重峰。随后使用前向散射(FSC-A)针对侧向散射(SSC-A)的图鉴定和门控活单淋巴细胞。分别使用CD4荧光针对SSC-A和VioletDye荧光针对CD4荧光的图从该门控的细胞群体鉴定CD4抗原特异性T细胞。通过VioletDye荧光的降低鉴定抗原特异性CD4T细胞。绘制CD25荧光针对LAG-3荧光的进一步图以证实该细胞群体的活化状态和它们表达LAG-3。绘制类似的图以鉴定抗原特异性CD8T细胞。
记录每种样品中存在的抗原特异性CD4和CD8T细胞的百分比(作为活淋巴细胞群体的百分比)。绘制这些数据的非线性可变斜率曲线-拟合，且使用GraphPadPrism软件(v5.03)生成EC50值。
为了计算测定中观察到的耗竭的最高水平，以测试的抗体的最高浓度，使用下式：(1-(%抗体处理之后剩余的抗原特异性T细胞)/(%在抗体不存在的情况下剩余的抗原特异性T细胞))*100。
使用上面详述的体外测定系统生成H5L7BW和H5L7耗竭LAG3阳性抗原特异性CD8和CD4T细胞的功效数据。H5L7BW在针对各细胞类型的消失研究的七个供体中的六个中诱导了ADCC对LAG3阳性抗原特异性CD4和CD8T细胞的耗竭。H5L7BW在抗原特异性CD4T细胞中的功效，如EC50值所定量，范围为14pg/mL至3.4ng/mL，其中最高耗竭水平范围为44至78%。该抗体在抗原特异性LAG-3阳性CD8T细胞中的功效范围为122pg/mL至17.5ng/mL，其中最高耗竭水平范围为39至87%。在研究的供体中，H5L7介导低耗竭水平，或者是无活性的。
实施例7：在体内人PBMC/小鼠SCID异种移植模型中评价H5L7BW和H5L7的耗竭活性
该测定描述了使用人PBMC/小鼠SCID异种移植模型以评价单克隆、完全人源化、无岩藻糖基化的LAG-3耗竭性抗体H5L7BW对活化的人T细胞的体内耗竭效力。分离健康志愿者外周血单核细胞(PBMC)且刺激过夜(抗CD3，IL-12)，以诱导LAG-3表达，然后注射至免疫受损的SCID小鼠的腹膜中。将LAG-3耗竭性或对照抗体共同施用至腹膜中或静脉内注射。
在细胞注射后5或24小时通过流式细胞术评价腹膜灌洗液样品中的LAG-3阳性细胞的耗竭。
通过腹膜内途径用活化的huPBMC(0.4mlPBS中的4x106-2x107个细胞)注射小鼠。根据具体的研究途径，LAG-3抗体或huIgG1BioWa对照用huPBMCi.p.共同施用，或将小鼠静脉内预处理，18小时之后注射huPBMC。细胞注射后5或24小时，使小鼠安乐死，进行腹膜灌洗，且通过流式细胞术分析灌洗缓冲液的细胞含量。简而言之，腹腔灌洗涉及使用含有3mMEDTA的冷PBS3x5ml洗涤完整腹腔。
使用具有FACSDiva软件6.1.3版本的BDFACSCantoII流式细胞仪(BDBioSciences采集所有样品数据。每个FACS管添加近似1x106个细胞(在可能的情况下)，将细胞悬浮液以1500rpm离心10分钟，且然后将沉淀再悬浮于3mlPBS中。然后小心地倾析上清液，且将细胞沉淀再悬浮于100μl冷FACS洗涤缓冲液中。然后每个管添加15μlFcR阻断剂，且将细胞在室温孵育10分钟。然后分别添加5μl各染色抗体(10μl1:100预稀释的抗LAG-3阻断/检测抗体17B4-PE)或同种型对照，且在室温在避光下孵育20分钟。随后通过每个管添加4mlFACS缓冲液洗涤细胞，且以1500rpm离心5分钟，其后小心地倾析上清液。重复该洗涤步骤。最后，将细胞再悬浮于300μlFACS缓冲液中，且通过流式细胞术分析。除了通过使用荧光标记的LAG-3阻断性抗体17B4-PE检测LAG-3，以下T细胞和活化标志物用于分析T细胞表型：CD45、CD4、CD8和CD25。CD4和CD8T细胞的百分比表示为CD45阳性细胞的百分比。LAG-3阳性T细胞群体表示为其亲本群体CD4和CD8的百分比。
FACSDiva软件版本6.1.3用于生成单个细胞计数/事件和细胞群体的百分比的批次分析。用SAS版本9.2.2软件使用用于二项式数据的广义线性模型分析数据。该分析将细胞计数直接模拟为亲本群体的比例。以该方式，在分析过程中考虑亲本群体的大小。对于各处理的目标细胞类型的比例计算平均值，连同95％置信区间。这些表示为百分比。
使用几率比(oddsratios)进行处理相比于对照的计划比较。这将一种处理中具有目标细胞类型的几率表示为与在对照处理上具有目标细胞类型的几率的比率。<1的几率比(oddsratio)将表明目标处理中与对照相比具有细胞类型的降低的几率。<1的几率比将表明目标处理中与对照相比具有细胞类型的降低的几率。
所有实验使用来自个体健康供体的PBMC进行，并且由于每次实验需要大血液体积，所以多于一次不使用供体。过夜刺激后的LAG-3表达水平在供体之间变化很大(范围为2-73％细胞表面表达)，但这些表达水平的差异对测试抗体的高度显著的耗竭效力没有影响。
人PBMC/小鼠SCID体内模型成功地用于显示免疫受损的SCID小鼠的腹膜中的活化的人表达LAG-3的T细胞的耗竭。根据供体、施用途径和分析的时间点，耗竭了84.22-99.71%的LAG-3阳性人CD4T细胞和84.64-99.62%的LAG-3阳性人CD8T细胞。如图2中所示，与对照IgG注射的动物相比，将5mg/kgH5L7BW共同施用于SCID小鼠的腹膜中的活化的人PBMC导致注射后24小时LAG-3阳性的CD4和CD8阳性T细胞的高度显著耗竭。
图3突出共同i.p.施用于活化的人PBMC之后5小时5mg/kgH5L7BW和H5L7之间的比较，如前所述。两种抗体诱导了LAG-3阳性CD4和CD8T细胞的高度显著耗竭(图3A)。
如图4中所示，经由静脉内途径施用5mg/kgH5L7BW导致5小时之后LAG-3阳性T细胞的高度统计显著的耗竭(图4A)，其类似于在用i.p.共同施用的LAG-3耗竭抗体的实验中观察到的结果。i.p.施用活化的人PBMC之后5小时的i.v.施用的H5L7BW、H5L7和IMP731(所有均为5mg/kg)之间的比较揭示与对照处理的动物相比3种分子之间非常类似的耗竭效力(图5)。3种测试的LAG-3耗竭性抗体中的每种引起LAG-3阳性CD4和CD8T细胞的数目的高度显著降低(图5A)，其中H5L7BW与H5L7或IMP731相比表明更大的耗竭能力。
实施例8：使用ProteOn?分析抗LAG-3人源化抗体与重组可溶性人Fcγ受体的结合
研究人FcγRIIIa结合，以评价H5L7和H5L7BW诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。使用ProteOn^TMXPR36(BioRad^TM)生物传感器机器评价H5L7和H5L7BW抗LAG-3抗体与除了FcγRI和FcγRII受体以外的重组可溶性人FcγRIIIa的结合，并且针对嵌合抗体IMP731进行比较。
通过伯胺偶联将山羊抗多组氨酸IgG固定在GLM生物传感器芯片上。该表面用作用于多组氨酸标记的人Fcγ受体的捕获表面。待测试的抗体用作分析物且以2048nM、512nM、128nM、32nM和8nM通过，其中0nM的注射(即，单独的缓冲液)用于双重参考结合曲线。在相互作用之间用100mM磷酸再生山羊抗多组氨酸IgG表面。在25℃且使用HBS-EP作为运行缓冲液在ProteOnXPR36蛋白阵列相互作用系统上实施运行。设置总体R-max且使用ProteOn的分析软件固有的平衡模型，分别分析每种受体的数据。在待测试的样品集合的开始和结束时运行对照分子，以确保结果的可比性。比较来自两次实验和在实验之间用作对照的杂交对照抗体的数据。
结果显示，H5L7BW以与H5L7相比改善近似10倍的亲和力结合至FcγRIIIa的两种多态型(缬氨酸V158和苯丙氨酸F158)(参见表6)。岩藻糖基化抗体H5L7以与嵌合抗体IMP731类似的亲和力结合至FcγRIIIa。
人源化的岩藻糖基化和无岩藻糖基化的抗LAG-3抗体对于FcγRI或FcγRIIa受体的结合之间没有观察到显著变化。
表6：H5L7和H5L7BW与人Fcγ受体的结合

序列
表7：序列概述