分析仪器系统.pdf

本发明提供了光学仪器系统和方法，其用于分析来自生物阵列的信号，并进行分析型扩增反应，以识别所分析的样品中是否存在靶标核酸序列。

1.  一种检测系统，所述系统包含：
激发光源；
反应容器，包含设置于其上的捕获探针位点阵列，所述阵列响应激发光而产生一个或多个荧光信号；
图像传感器；
光学组件，用于将激发光从所述激发光源传输至所述阵列，将荧光信号从所述阵列传输至所述图像传感器；
一个或多个热控元件，其设置成与所述反应容器热连通；以及
处理器，其可操作地连接到所述一个或多个热控元件，用于将所述反应容器的内容物置于热循环过程。

2.  如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述光学组件包括将荧光信号聚焦到所述图像传感器上的聚焦透镜和位于所述聚焦透镜与所述图像传感器之间的光程长度调节部件。

3.  如权利要求2所述的系统，其特征在于，所述光程长度调节部件包含厚度可变的可旋转圆盘。

4.  如权利要求3所述的系统，其特征在于，所述厚度可变的可旋转圆盘包含选自玻璃、石英、熔凝二氧化硅和透明聚合物的透明材料。

5.  如权利要求4所述的系统，其特征在于，所述透明聚合物选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚醚砜、聚脂族醚、卤代的聚脂族醚、聚芳族醚、卤代的聚芳族醚、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚烯烃、卤代的聚烯烃、聚环烯烃、卤代的聚环烯烃和聚乙烯醇。

6.  如权利要求1所述的系统，其特征在于，至少一个热控元件是置于所述激发光源与所述阵列之间的光路中的热电元件，所述热控元件具有置于其中的光孔，用于将所述激发光传输至所述阵列，所述光孔包含透明导热材料。

7.  如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述透明导热材料具有至少1W/mK、优选大于5W/mK、更优选大于10W/mK，并且在一些情况下大于100W/mK甚至大于500W/mK的热导率。

8.  如权利要求6所述的系统，其特征在于，所述透明导热材料包含选自玻璃、蓝宝石、金刚石、结晶石英、MgAl₂O₄和ALON的材料。

9.  如权利要求6所述的系统，其特征在于，当所述反应容器处于与有孔从其中穿过的热控元件热连通的状态时，在光学透明的导热材料与反应容器之间提供约1-50μm厚的间隙。

10.  如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述一个或多个热控元件能在反应容器内产生不同温度的区域，从而在反应容器的至少一部分施加差异化温度。

11.  如权利要求10所述的系统，其特征在于，所述处理器包括通过编程对热控元件的不同温度区域施加不同温度。

12.  如权利要求10所述的系统，其特征在于，所述热控元件能造成反应容器内一种或多种组分的热混合。

13.  一种检测核酸扩增产物的方法，所述方法包括：
在核酸阵列存在下于反应混合物中扩增靶标核酸；
在杂交步骤中，冷却反应混合物至杂交温度，使扩增产物杂交到所述阵列上；
在所述杂交步骤之前或期间对所述反应混合物进行对流混合；以及
检测杂交到所述阵列上的扩增产物。

分析仪器系统
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年3月15日提交的第61/793,388号美国临时专利申请的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。
关于联邦资助研究/开发的声明
本发明在美国国土安全部的基金支持下完成，
合同号：HSHQDC-lO-C-00053。政府对本发明拥有某些权利。
发明背景
在许多不同领域，从一组不同光学信号中逐一识别、区分和/或量化这些信号相当重要。特别值得注意的是多路分析操作的应用，例如核酸分析、生物分析、化学分析等，它们依赖于光学信号。许多分析系统已经得到开发和商业化，用于收集、记录和分析光学信号数据，这些数据来自生物或化学分析阵列，包括例如核酸阵列扫描仪、多路核酸测序系统等。
举例而言，核酸阵列已广泛用于识别样品中是否存在一个或多个靶标核酸。特别是在典型的阵列中，在平面基材上提供不同核酸探针序列，它们结合在基材表面的独特定位区，在这些区域，阵列表面上的束缚实体(boundentity)或捕获探针(captureprobe)的特性及其位置是已知的。各不同特性的捕获探针置于孤立的捕获探针位点或区域，所述位点或区域包括多个相同的捕获探针。利用对所关注的靶标核酸序列(即样品中待测的序列)具有特异性的引物序列，对样品进行扩增反应。两个引物中的一个或两个通常可包括荧光基团或其他标记基团。扩增之后，使所得反应混合物接触阵列。如果阵列表面上出现荧光信号，则表明与该位置的捕获探针互补的序列被扩增，因而存在于该样品中。
从这些阵列中读取荧光信号一般采用多个不同类型的系统。例如，早期阵列读取仪器采用扫描荧光显微镜，所述扫描荧光显微镜对阵列表面进行光栅式扫描，并随扫描位置读取发出的荧光。后来的荧光读取仪器采用成像光学元件和传感器，对整个阵列一次成像，从而加快了分析过程。对于各种不同的应用，包括例如诊断 阵列系统、核酸测序应用等，这样的系统增加了复杂性，参见例如IlluminaHiSeq系统、PacBioRS系统等。
尽管这种系统一般都可以买到，但需要改进这些系统，降低其复杂性，增强其功能。本发明解决了这些和其他需求。
发明内容
本发明涉及可用于分析生物阵列的分析仪器系统和分析方法。该系统的优选仪器能够在执行扩增反应过程例如RT-PCR过程的情况下进行这种分析。这些系统包括对光学组件(opticaltrain)、热管理以及所述仪器应用到所用反应容器的反应操控过程的改进。
在至少一个方面，本发明提供了一种检测系统，其包含激发光源；反应容器，该反应容器包含置于其上的捕获探针位点阵列，并且能够响应激发光而产生一个或多个荧光信号；图像传感器；光学组件，该光学组件用于将激发光从激发光源传输至所述阵列并将荧光信号从所述阵列传输至所述图像传感器；一个或多个与所述反应容器热连通的热控元件；处理器，该处理器可操作地连接至所述一个或多个热控元件，用于将反应容器的内容物置于热循环过程(例如用于对试剂进行热混合等)。在一些这样的实施方式中，核酸阵列可任选包含一个或多个荧光探针(例如捕获探针)，该阵列的荧光可任选根据荧光捕获探针对例如核酸的捕获或检测而增大或减小。在此方面的一些实施方式中，该系统可包含这样的情况，其中光学组件包括将荧光信号聚焦到图像传感器上的聚焦透镜，以及位于聚焦透镜与图像传感器之间的光程长度调节部件，例如厚度可变的可旋转圆盘。在包含厚度可变的可旋转圆盘的实施方式中，这种圆盘可包含选自玻璃、石英、熔凝二氧化硅和透明聚合物的透明材料，所述透明聚合物是例如选自下组的一种或多种：聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚醚砜、聚脂族醚、卤代聚脂族醚、聚芳基醚、卤代聚芳基醚、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚烯烃、卤代聚烯烃、聚环烯烃、卤代聚环烯烃和聚乙烯醇。在这种系统的一些实施方式中，至少一个热控元件可以是置于激发光源与阵列之间的光程中的热电元件，并且任选具有置于其中用于将激发光传输至阵列的光孔(例如包含透明导热材料)。对于包含其中具有透明导热材料的光孔的实施方式，导热材料可具有至少1W/mK、优选大于5W/mK、更优选大于10W/mK并且在一些情况下大于100W/mK甚至大于500W/mK的热导率，并且/或者可包含选自玻璃、蓝宝石、金刚石、结晶石英、MgA1₂O₄和ALON 的材料。在本发明的一些实施方式中，当反应容器处于与有孔从其中穿过的热控元件热连通的状态时，可在光学透明的导热材料与反应容器之间提供约1-50μm厚的间隙。此外，在一些实施方式中，所述一个或多个热控元件可在反应容器内产生不同温度的区域，从而在反应容器的至少一部分施加差异化温度。包含在反应容器内施加不同温度区域的热控元件的实施方式中，系统可包含处理器，该处理器包括通过编程对一个或多个热控元件的不同温度区域(从而对反应容器的不同区域)施加不同温度。在一些实施方式中，热控元件可造成反应容器内的一种或多种组分发生热混合。
在一些方面，本发明包含检测核酸扩增产物的方法：在核酸阵列存在下扩增反应混合物中的靶标核酸；在杂交步骤中将反应混合物冷却至杂交温度，使扩增产物杂交至阵列；在杂交步骤之前或期间对反应混合物进行对流混合；检测杂交到阵列的扩增产物。在一些这样的实施方式中，核酸阵列可任选包含一个或多个荧光探针(例如捕获探针)，该阵列的荧光可任选根据荧光捕获探针对例如核酸的捕获或检测而增大或减小。
附图说明
图1提供了可结合本文所述的系统和方法使用的示例性分析形式的示意图。
图2提供了本发明总体仪器系统的示意图。
图3提供了本文中仪器系统的示例性样品架部件的图示。
图4A显示了与仪器系统的基材架部分的热控元件连接的示例性反应容器的示意图。图4B显示了对流混合的示意图。
图5显示了包含光程长度调节部件的本发明仪器的光学组件部分。
图6A和6B提供了阵列上样品分布的示意图，施加在阵列上的分析物例如扩增子分别经过混合和没有混合。
图7A和7B呈现了在扩增反应中通过阵列的荧光信号数据的比较，在扩增期间分别经过混合和没有混合。
图8A和8B也呈现了在扩增反应中通过阵列的荧光信号数据的比较，在扩增期间分别经过混合和没有混合。
图9显示了可与本发明系统结合使用的示例性分析方法的示意图。
图10显示了本发明系统中所含的反应容器中试剂的热混合。
发明详述
一、综述
本发明总体涉及用于执行生物和生物化学分析的分析仪器、系统和方法。本发明仪器和系统特别适合监控来自靶标核酸扩增反应的荧光信号，而且通常也适合进行基本的扩增过程。因此，本发明系统的多种实施方式不仅具备检测能力，而且具备进行所关注反应的能力，例如热循环及其他操作参数。
出于讨论的目的，本发明的多个实施方式结合例如2013年3月15日提交的美国专利申请第13/844,426号所述的分析方法予以说明，该文献的全部内容通过参考纳入本文以用于所有目的。图9显示了用于这种分析的简化流程图。如图9所示，捕获探针组902中各探针携带相连的荧光部分(moiety)或荧光团(F)，所述探针组被固定在基材904的表面上。还提供了靶标特异性探针906，其与捕获探针902和感兴趣的靶标核酸序列互补。这些靶标特异性探针包含相连的淬灭剂部分(Q)。选择捕获探针902上荧光团F和靶标特异性探针906上淬灭剂Q的位置，使得在探针902和906杂交在一起时，淬灭剂位于与荧光团足够近的距离内，从而在经受激发光照时淬灭荧光团的荧光。
可使上述探针接触可能含有感兴趣的靶标核酸(如靶序列908)的样品材料，并使用聚合酶对靶序列进行PCR反应，所述聚合酶包含例如固有的外切核酸酶活性。PCR过程可包括多个反复的解链、退火和延伸反应步骤，导致适当引物910跨靶序列908的延伸。在各退火步骤期间，至少一些靶标特异性探针906会退火至靶序列908。由于延伸反应期间由聚合酶对靶序列进行复制，聚合酶的外切核酸酶活性会消化与靶标杂交的靶标特异性探针906，避免其与捕获探针902杂交，从而使与捕获探针相连的荧光团保持未淬灭。对于靶标特异性探针与捕获探针或靶序列的结合而言，在给定的反应混合物中会存在平衡。由于PCR反应期间靶序列被扩增，该平衡会朝更多的靶标特异性探针与靶标结合、而非结合并淬灭带标记的捕获探针的方向移动。结果是，该扩增导致荧光信号增加。
附加的和/或替代的分析方法，如美国专利申请第13/399,872号所述的那些方法也可与本发明的各种实施方式结合使用，该文献的全部内容通过参考纳入本文以用于所有目的。图1显示了用于这种分析的简化流程图。简而言之，如步骤I所示，对样品材料进行PCR扩增，该扩增经过调整，通过提供对扩增一种或多种感兴趣的靶序列102具有特异性的扩增引物序列104来扩增所述感兴趣的一种或多种靶标核酸序列102。扩增反应也在一种或多种探针序列106的存在下进行，该探针序列 也经过调整，以便杂交到一种或多种感兴趣的靶序列上。具体而言，探针106通常具有与靶序列互补的第一部分106a和不与靶序列互补的第二带标记的折翼(flap)部分106b。在靶序列扩增时(步骤II)，由于扩增所用聚合酶的外切核酸酶活性，带标记的折翼部分106b被释放。释放的折翼部分106b被互补捕获探针108序列捕获，该序列提供在固体支持物110(例如基材表面)上。如前文所述，这些捕获探针通常置于基材表面上离散的区域或位点，其中每个位点包括多个全都具有相同序列和/或特异性的捕获探针。固体支持物110表面上带标记的折翼部分106b的累积表明靶序列102存在且正被扩增。通过针对不同待分析靶序列使用不同折翼部分序列，并通过将与那些折翼部分序列互补的不同捕获探针排列在基材上的不同位置，可以通过单个扩增反应过程有效地检测单个样品中是否存在多种不同的靶序列。此外，由于带标记的折翼部分无需与靶标杂交，其序列可基于基材上的一个或多个所需捕获探针序列进行选择。结果是，可使用通用捕获探针或捕获探针组来测得任何一种或多种靶序列。
尽管就基材表面的荧光累积描述了能够与本发明系统/装置结合使用的一些方法，其中累积是基于淬灭探针从表面的释放或者带标记的荧光探针结合到表面上(在任一情况下，例如，通过释放自或结合到与捕获探针相连的表面上)，但应当理解，各种信号模式也很容易实施。例如，在某些形式中，借助于探针的折翼部分上的淬灭剂基团，通过与连接在表面的捕获探针上荧光基团相关的信号淬灭，可以检测探针的折翼部分的累积。类似的，捕获探针可构造成结合完好的带标记的靶标特异性探针，该靶标特异性探针在靶标扩增时被消化，从而导致累积的荧光减少，或者在一些情况下，由于存在于靶标特异性探针上的淬灭剂(例如，如上文所述)，与捕获探针相连的荧光团的淬灭减少。最后，可利用替代性标记方案，如基于FRET的标记，使负载的捕获探针所发信号的荧光光谱发生偏移。这些不同方案见述于例如2012年2月17日提交的共同在审美国临时专利申请第13/399,872号和2012年8月16日提交的US13/587,883，其全部内容通过参考完整地纳入本文以用于所有目的。
在多个实施方式中，上述分析方法可在含有检测区的反应容器或反应室中进行，所述检测区包含位于反应室的至少一个表面上的平面核酸检测阵列，例如包含一个或多个不同的捕获探针区。每个捕获探针区可包含固定在该区域内并具有特定的捕获探针序列的多个探针，使得这种探针能够杂交并定位溶液中任何游离的互补核酸，例如该区域内互补的带标记的折翼探针部分。其他探针区可包括具有不同核 酸序列的探针群。反应室可构造成减少从前述阵列检测到的信号的信号背景。例如，反应室在邻近所述阵列的至少一个维度上的深度小于约500μm，如在临近所述阵列的至少一个维度上的深度为约10μm–约200μm。在其上形成阵列例如检测区的反应室表面优选用透明材料制造，通过该透明材料可收集光学信号，特别是荧光信号。因此，检测区的这种表面可任选由玻璃、石英或透明聚合物组成，所述透明聚合物是例如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚醚砜、聚脂族醚、卤代的聚脂族醚、聚芳族醚、卤代的聚芳族醚、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚烯烃、卤代的聚烯烃、聚环烯烃、卤代的聚环烯烃、聚乙烯醇等。
在多种实施方式中，在装置操作期间，所述阵列上的捕获核酸探针可以非限速密度(non-ratelimitingdensity)存在。该阵列任选地可包含多种捕获核酸类型，例如，定位于空间上不同的阵列区域。例如，该阵列上可以存在5种或更多种不同捕获核酸类型，如多至约100种或更多种不同类型。再次，对示例性装置的详细描述见例如美国专利申请第13/587,883号，前面已通过参考纳入本文。
任选地使捕获核酸连接至反应室表面上的热稳定涂层，以促进阵列的热循环。示例性涂层可任选包括：化学反应基团、亲电基团、NHS酯、四氟苯基酯或五氟苯基酯、单硝基苯基酯或二硝基苯基酯、硫酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰基叠氮化物、环氧化物、氮杂环丙烷、醛、包含乙烯酮或马来酰亚胺的酰胺或α,β-不饱和酮、酰基卤化物、磺酰卤、亚胺酸酯、环酸酐、环加成反应中的活性基团、烯烃、二烯、炔烃、叠氮化物或其组合。可用的表面涂层见述于例如美国专利申请第13/769,123号，其全部内容通过参考纳入本文以用于所有目的。
二、系统的一般构造
本发明总体上涉及特别适用于进行上述扩增反应和分析的仪器、系统和方法。具体而言，所述系统在反应容器内执行扩增反应，然后收集从集成在这些反应容器内的捕获探针阵列发出的荧光信号数据。
图2提供了本发明总体系统的示例性实施方式的示意图。如图所示，总体系统200包括倒插入基材架204中的反应容器202。如上文所述，反应容器通常包括集成在反应容器202的透明表面208上的捕获探针阵列206。基材架通常包括合适的温控元件210，用来根据选定或编程的指令升高和降低施加到反应容器202中的温度。温控元件210可通过可集成到本发明仪器系统中的计算机或处理器212来控制，辅以合适的用户界面(图中未示出)，以便对这种控制进行选择和/或编程。或者，这种编程可由与所述仪器系统接口的相连处理器或计算机212提供。此外， 基材架204通常还包括观察窗216，当反应容器插入基材架204中时，观察窗所处的位置使它与反应容器202的相应透明表面208协调一致。
总体系统200的仪器部分(部分220)包括荧光检测光学元件222，用于收集和记录从基材架204中的反应容器202发出的荧光信号。
如图所示，所述仪器包括光学组件222，其包括激发光源226，如激光器、激光二极管、LED等。在操作中，光源226发出的光被导向并通过激发光聚焦透镜228和滤光片230，聚焦激发光，并为所需荧光分析调整激发光谱，例如激发一种或多种荧光团，所述荧光团用于标记所分析组分，例如上文所述的带标记的折翼探针部分。为方便呈现，光路用虚线箭头显示。然后，将激发光导向分色镜232上。分色镜232构造成使激发光反射通过物镜234，物镜234使光聚焦通过基材架204中的孔或观察窗216并聚焦到反应容器202上。然后，通过物镜234收集反应容器内的荧光反应物受激产生的荧光信号，使其通过分色镜232，该分色镜构造成反射激发光，同时让所发射出的波长不同的荧光信号通过。然后，荧光信号通过发射滤光片236，如窄带滤光片或狭缝滤光片，它可构造成减少分色镜232未滤掉的直接反射激发光及其他光噪声。然后，经过滤的荧光信号通过发射透镜238及任选的附加聚焦光学元件(图中未示出)，然后投射到图像传感器240上。所述装置/系统的图像传感器可包括各种合适的传感器阵列中的任何一种，包括例如CCD、EMCCD、ICCD、CMOS传感器等。图像传感器240通常连接至合适的电子处理器件，例如处理器212，用于记录成像信号，分析所产生的成像信号，这在下面将更详细描述。
三、反应容器
示例性反应容器的放大示意图示于图3A和3B。如图3A和3B所示，反应容器302包括置于其内部的反应和检测室304。在优选方面，检测室包括透明窗部分306，优选包括置于内部表面例如表面306a上的核酸阵列。如图所示，在优选方面，反应容器通常具有平面几何形状，在窗部分306上方具有浅剖面，从而对于相关的分析模式，减少背景荧光水平，所述背景荧光水平由例如溶液中的(即未结合到表面的)带荧光标记的试剂发出。这种平面器件见述于例如美国专利申请第13/587,883号，前面已通过参考纳入本文。图中显示该装置内包括一个或多个试剂端口308，用于向该装置引入试剂。
在至少一个示例性方面，反应室可包括层叠结构，如图3B所示。如图所示，反应容器包括通过中间层314连接的底表面层310和上表面层312。在层310、312 和314组装后，挖切部316形成腔室。一个或多个端口308形成便利通道以在组装后将缓冲液和试剂递送到腔室中。可以在形成挖切部316的顶表面或底表面的区域的顶层或底层上形成核酸捕获阵列。在一个方便的实施方式中，当采用落射荧光检测来检测结合到阵列的标记物时，在下表面310上制造阵列，设置耗材以通过本发明装置和系统中定位于下表面下的检测光学元件来观察。通常，顶表面和/或底表面会包含窗口，检测光学器可以通过该窗口来观察阵列。
四、反应容器架
如上文参考图2所述，本发明的反应容器可插入仪器系统200的反应容器架或基材架部分204。对插入基材架204的反应容器的热控制通过加入热控元件来进行。图4A提供了基材架部分里面的示例性热控元件的示意图，为反应容器里的扩增反应提供热管理(例如热循环)和定位，以及为集成到反应容器内的捕获探针阵列提供光学通道。
如此图所示，在基材架部分里面设置至少两个热控元件402和404，并定位成能够在反应容器插入容器架时控制反应容器及其内容物的温度，也称作与反应容器热连通。在某些实施方式中，可加入单一热控元件来控制反应容器内的热循环反应。热控元件402和404设置成与插入基材架部分的反应容器的相对侧面接触或热连通。这些温控元件可包括本领域已知的各种不同热控元件中的任何热控元件，但优选能够根据需要加热和冷却反应容器的热电元件。在反应容器与温控元件之间提供接触可通过各种机构中的任意机构实现，包括偏置机构、夹具、凸轮弹簧或其他将反应容器和/或热控元件压至相互接触的机械元件。
进入反应容器的光学通道可由穿过基材架至少一侧设置的孔提供，如上文所述。也可穿过热控元件404之一提供互补孔406，以便与插入的反应容器408及其相连的探针阵列光学连通。在特别优选的方面，穿过热控元件404限定基材架的观察窗的孔406包括横贯它设置的透明层410。在特别优选的方面，此透明层包含具有非常高的热导率的透明材料，以免干扰热控元件的操作，同时具有非常低的自身荧光。结果，透明窗既能经受始终存在的宽温度变化，又能将热快速传入和传出反应容器。在一些方面，透明材料的热导率大于1W/mK，优选大于5W/mK，更优选大于10W/mK，在一些情况下大于100W/mK，甚至为500W/mK。特别有用的透明材料的例子包括例如热导率分别约为36W/mK和1000W/mK的蓝宝石和金刚石，其他可用的透明材料如结晶石英、尖晶石(MgA1₂O₄)和ALON的热导率大于5W/mK，也可用于本文中的实施方式。在一些情况下，导热透明窗仅穿过热控 元件中的孔设置，而在其他情况下，它可作为整个层提供在热控元件上。
在某些实施方式中，为了防止窗口与反应容器界面处的光学干扰，当反应容器插入基材架时，导热窗口与反应容器之间可包含小间隙。具体而言，可提供1-50μm之间的间隙，以提供足够的距离，避免光学干扰，同时又不会产生这样的距离，即在基材与导热窗口之间产生显著的绝热层。一般地，避免干扰带所需的间隙宽度约为通过间隙的光的相干长度或更长。此相干长度依赖于波长和光带宽，对于高斯分布可根据波长²/带宽计算；参见例如Marion和Heald所著的《经典电动力学辐射》(ClassicalElectrodynamicRadiation)，第二版(纽约学术出版社)(AcademicPress，NewYork)，1980年。
在某些实施方式中，热控元件构造成在扩增过程中在反应容器内提供增强的加热和对流混合。具体而言，对于要检测流体中的核酸杂交到与阵列连接的捕获探针的基于核酸阵列的分析，过程限速步骤之一是溶液探针扩散到阵列探针并与阵列探针杂交的速率。用于加快这些过程的许多途径已见诸描述，包括使用磁性粒子或电泳策略将核酸拉至阵列表面，从而进行杂交步骤。在许多情况下，通过简单混合置于阵列上面的流体来实现充分接触，这加快了流体中的核酸充分接近或接触阵列探针的速率。尽管通过在阵列腔室中引入混合元件，或者简单地将流体泵入和泵出腔室，简单的阵列系统可以做到这一点，但对于本发明的反应容器，这些方法并不很适宜。因此，在本文的特定实施方式中采用对流混合过程。
图4B呈现了实现这种对流混合的示例性构造。如图所示，置于基材架内的热控元件可构造成为反应室提供热分布，在反应室内造成对流混合。具体而言，通过提供温度相对低于另一热控元件的一小组热控元件，可在反应室内驱动对流混合。例如，参考图2，每个热控元件210可彼此保持不同的温度，从而在反应室内驱动对流混合。或者，如图4B所示，至少一个热控元件(示为热控元件450)包括两个受到不同控制的部分452和454，在反应容器的至少一部分上施加差异化温度，例如较冷部分和较热部分。其他热控元件可类似地配置，或者可提供恒温。为了驱动对流混合，部分452以低于部分454的温度提供，从而在反应室456中驱动对流混合，如箭头所示。这种对反应室施加的不连续加热分布驱动反应容器内流体的对流混合。
通常在将液体加入反应室之后但在热循环步骤之前将对流混合过程施加于反应混合物，例如帮助干燥的试剂在反应室中快速溶解和分布，且/或在热循环步骤之间施加对流混合过程，例如在杂交步骤中，其中反应被冷却，以便扩增产物(即 扩增子)杂交到阵列上的捕获探针上。
如前文所述，本发明的仪器系统通常包括用于处理从反应容器收集的信号和/或根据所需温度分布控制热控元件的处理器部件。例如，就这些仪器系统中所进行的优选的PCR扩增反应而言，处理器可包括通过编程驱动热控元件，将扩增热循环分布施加于反应容器及其内容物。这种热分布通常包括变性步骤，在此步骤中，将反应混合物加热到例如95℃，以分离杂交的靶标互补核酸链，然后进行退火和延伸步骤，其中反应冷却至引物序列可杂交到靶标序列而聚合酶可沿着靶标延伸引物的温度，例如45-60℃。此温度分布可重复若干个循环，以扩增潜在的靶标序列。因此，本发明的系统可包括通过编程实施这些热循环分布。这种分布的例子见述于例如2012年2月17日提交的共同在审美国临时专利申请第13/399,872号和2012年8月16日提交的US13/587,883，前面已通过参考纳入本文。此外，处理器也可包括通过编程将差异化温度分布施加于一个或多个热控元件的不同部分，或者将不同温度施加于至少两个不同热控元件中的每一个，以便驱动反应容器内反应物的对流混合，例如扩增子混合。处理器还可包括通过编程接收和分析从图像传感器上的阵列接收到的信号数据，例如识别正信号，并将它们与起始样品材料中是否存在给定的靶标序列关联起来。
五、聚焦光学元件
如上文所述，为了将来自反应容器的荧光信号图像聚焦到图像传感器上，总体仪器系统的光学组件通常还包括聚焦光学元件。在一些实施方式中，出于简便和成本考虑，优选简化的光学组件。具体而言，如图5所示，光学组件500包括两个主聚焦透镜：用于收集来自反应容器504内阵列的荧光信号并将激发光导向阵列的物镜502，以及将来自阵列的荧光信号图像聚焦到成像传感器508上的聚焦透镜506。为了提供更简单、成本效率更高的仪器系统，这些透镜优选相对于彼此以及相对于反应容器504和图像传感器508中的每一个以固定构造提供。为了提供精细的焦点调节，在光路中提供光程长度调节部件510。通过提供可变的光程长度，可以调节图像传感器508上的图像的焦平面。
前面已经揭示，光程长度可以这样调节：引入一个或多个垂直于光轴平移的楔形棱镜，从而产生光程长度差，修正光学系统的焦点。参见例如1941年的专利“用于光学仪器的可变焦系统”(VariableFocusSystemforOpticalInstruments)(Mitchell,美国专利号2,258,903)。类似的，阶梯楔形棱镜也已用于为系统的光程长度引入离散的变化(参见例如Steinle的美国专利第5,040,872号，题为“带光 程长度补偿器的分束器/合束器”(BeamSplitter/CombinerwithPathLengthCompensator))。在其他情况下，电介质(例如玻璃窗或塑料窗)的光程长度与自由空间(即空气)相差数量(d/n0-d/n1)，其中n0是自由空间的折射率(约1)，n1是介质的折射率(例如，塑料约1.5)。例子是推迟板和补偿器。前述任何元件构成光程长度调节部件，可任选存在于本文的各种实施方式中。
就本文所述的仪器系统而言，可对光程调节部件加以选择，以提供具有成本效率的简单部件。具体而言，优选的系统包括置于光路中的含有厚度可变的可旋转圆盘的光程长度调节部件。通过旋转圆盘，可将圆盘较厚的部分引入光路，从而增加光程长度。旋转圆盘，直至获得最佳图像焦点。图5还显示了作为可调光程长度部件510的可变厚度圆盘510a的展开图。光程长度调节部件，例如厚度可变的可旋转圆盘，包含透明材料，并且任选由各种光学材料中的任何材料制造，如玻璃、石英、熔凝二氧化硅和透明聚合物，如聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚醚砜、聚脂族醚、卤代的聚脂族醚、聚芳族醚、卤代的聚芳族醚、聚酰胺、聚酰亚胺、聚酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚烯烃、卤代的聚烯烃、聚环烯烃、卤代的聚环烯烃或聚乙烯醇。
实施例
提供以下实施例用于说明而非限制请求保护的本发明。应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和范围以及所附权利要求书的范围内。
反应组分的原位对流混合
如上文所述，在基于阵列的分析检测流体中的核酸(例如带荧光标记的折翼探针、带标记的扩增子等)杂交到与表面结合的捕获探针上的情况下，为了使所述分析获得更高的灵敏度，优选能够主动混合流体中的核酸并将其输送到阵列表面。图6A描绘了检测室仅依赖于所输送的分子的扩散的情形。如果靶标拷贝数低，扩增子很有可能不会在可接受的时间范围内杂交到阵列上。然而，借助混合，扩增子均匀分布在检测室内(图6B)，从而增加核酸与阵列表面相互作用并杂交到阵列表面的概率。
为了测试混合对PCR灵敏度的影响，进行如下标准分析：在包含折翼探针的靶标特异性核酸探针的存在下，对具有已知靶标核酸(100拷贝的H3DNA)的测试样品进行扩增，例如，如上文所述。在扩增过程中，在扩增反应的第9个循环与第10个循环之间引入混合步骤。同时进行对照试验，其中第9个循环与第10个循 环之间没有混合。总共进行16个对应的分离的PCR反应。如下表所示，伴有混合的PCR反应在各轮反应之间得到紧凑得多的阈值循环分布(Ct)。