虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法.pdf

本发明公开了一种虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，讲过甲醇粗提、两次YTX分离提取、YTX纯品的制备等步骤制备得到YTX样品，可用于制作YTX毒素标准品，测定海洋食品（鱼、虾、贝等）中虾夷扇贝毒素YTX的含量，属于海洋食品安全领域必须要检测的指标之一。该方法填补了国内对于贝类毒素标准品缺乏的空白，极大的促进了国内贝类毒素检测技术的发展和海洋食品安全的工作，对于国内海产品顺利出口到欧盟等发达国家，有着很大的促进作用。

1.  虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，步骤如下：
1）甲醇粗提
向装有藻糕的离心管中加入甲醇，超声萃取，离心，收集上清液并过滤；将滤液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净，量体积并放置于-80℃冰箱保存，备用；
2）经过两次分离提取
YTX粗分离：
使用2.4×32cm层析柱，以70g碱性氧化铝作为填料，CHCl₃–MeOH作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次加入150ml的CHCl₃–MeOH,150ml的MeOH，MeOH–1%氨水洗脱，收集MeOH–1%氨水部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液；将上述洗脱液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，然后将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用；
YTX纯化：
使用2.4×32cm层析柱，以60gC18作为填料，30%MeOH水溶液作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次用250ml的30%MeOH水溶液，140ml的40%MeOH水溶液，140ml的50%MeOH水溶液，140ml的60%MeOH水溶液，250ml的MeOH，梯度冲洗柱子，收集MeOH部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液，将上述收集液旋转蒸干后加入12ml甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用；
3）YTX纯品制备
使用半制备液相色谱-紫外光谱联用，以甲醇作为洗脱剂，用250mm×10mm的半制备柱，5μmC18作为填料，在273nm处检测洗脱液的紫外吸收强度，取3.64min处出峰，保留滤液，重复多次提取，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。

2.  根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，甲醇粗提过程中将收集的上清液先于-80℃冰箱放置过夜，第二天再使用孔径为0.45μm滤膜过滤提取液，收集滤液。

3.  根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，初始洗脱剂洗脱过程为：用弯头胶头滴管，紧贴柱壁转圈上样3ml，开阀，待样品下移至液面相切时，用初始洗脱液淋洗柱壁2-3次，每次约1ml，然后进行梯度洗脱。

4.  根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，旋转蒸干后加入甲醇淋洗时，用弯头胶头滴管从平底旋转整瓶的瓶劲处不断淋洗。

5.  根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，YTX纯品制备过程中，重复多次提取，把纯化后收集液全部提取完成，合并取得滤液，旋转蒸发浓缩至2ml；浓缩后的滤液再次提取，并提取3.64min处出峰，合并所提取滤液，得到YTX纯化产品；将YTX纯化产品旋蒸浓缩，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。

6.  根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，两次分离提取最后溶解液过滤均使用孔径为0.22μm的滤膜。

虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法
技术领域
本发明制备的YTX样品，可用于制作YTX毒素标准品，测定海洋食品（鱼、虾、贝等）中虾夷扇贝毒素YTX的含量，属于海洋食品安全领域必须要检测的指标之一。
背景技术
已有技术中，有国外文献报道过针对YTX毒素的研究，主要用于YTX毒素的研究，结构的表征，YTX毒素的衍生物的化学结构测定，YTX产毒环境与产毒的关系。国内文献未见对YTX毒素化学分子结构和性质的具体研究。
YTX标准品的制备，要求所得到的YTX产品必须有一定的产量，同时纯度达到一定的要求。目前的报道中，YTX的提取主要用于性质分析，提取出的量很小，且纯度不高，无法满足制备YTX检测标准品的需求。同时，现有文献没有涉及到YTX提纯的具体步骤及方法，无法满足制备YTX标准品的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，YTX样品可用于制作YTX毒素标准品，测定海洋食品（鱼、虾、贝等）中虾夷扇贝毒素YTX的含量，属于海洋食品安全领域必须要检测的指标之一。在我国食品安全，海洋产品出口等问题上具有重大的意义。
本发明的技术方案是这样实现的：虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，步骤如下：
1）甲醇粗提
向装有藻糕的离心管中加入甲醇，超声萃取，离心，收集上清液并过滤；将滤液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净，量体积并放置于-80℃冰箱保存，备用；
2）经过两次分离提取
YTX粗分离：
使用2.4×32cm层析柱，以70g碱性氧化铝作为填料，CHCl₃–MeOH作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次加入150ml的CHCl₃–MeOH,150ml的MeOH，MeOH–1%氨水洗脱，收集MeOH–1%氨水部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液；将上述洗脱液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，然后将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用；
YTX纯化：
使用2.4×32cm层析柱，以60gC18作为填料，30%MeOH水溶液作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次用250ml的30%MeOH水溶液，140ml的40%MeOH水溶液，140ml的50%MeOH水溶液，140ml的60%MeOH水溶液，250ml的MeOH，梯度冲洗柱子，收集MeOH部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液，将上述收集液旋转蒸干后加入12ml甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用；
3）YTX纯品制备
使用半制备液相色谱-紫外光谱联用，以甲醇作为洗脱剂，用250mm×10mm的半制备柱，5umC18作为填料，在273nm处检测洗脱液的紫外吸收强度，取3.64min处出峰，保留滤液，重复多次提取，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。
进一步地，甲醇粗提过程中将收集的上清液先于-80℃冰箱放置过夜，第二天再使用孔径为0.45um滤膜过滤提取液，收集滤液。
进一步地，初始洗脱剂洗脱过程为：用弯头胶头滴管，紧贴柱壁转圈上样3ml，开阀，待样品下移至液面相切时，用初始洗脱液淋洗柱壁2-3次，每次约1ml，然后进行梯度洗脱。
进一步地，旋转蒸干后加入甲醇淋洗时，用弯头胶头滴管从平底旋转整瓶的瓶劲处不断淋洗。
进一步地，纯品制备过程中，重复多次提取，把纯化后收集液全部提取完成，合并取得滤液，旋转蒸发浓缩至2ml；浓缩后的滤液再次提取，并小心提取3.64min处出峰，合并所提取滤液，得到YTX纯化产品；将YTX纯化产品旋蒸浓缩，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。
进一步地，两次分离提取最后溶解液过滤均使用孔径为0.22μm的滤膜。
本发明的有益效果为：本发明虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法填补了国内对于贝类毒素标准品缺乏的空白，极大的促进了国内贝类毒素检测技术的发展和海洋食品安全的工作，对于国内海产品顺利出口到欧盟等发达国家，有着很大的促进作用。
附图说明
图1纯品制备过程检测一色谱分离波谱图。
图2纯品制备过程检测二色谱分离波谱图
图3纯品检测色谱分离波谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明。
一、甲醇粗提
1.向装有0.5g藻糕的50mL离心管中加入适量的甲醇，用玻璃棒搅匀，超声萃取15min，3500r/min，离心10min，收集上清液，向残渣中加入适量甲醇，反复离心、收集上清液3次。将全部所得上清液于-80℃冰箱放置过夜，第二天使用孔径为0.45um滤膜过滤提取液，收集滤液。
2.将上述过滤液旋转蒸发（100rpm/min,，40℃），蒸干后，分3次，加入12ml甲醇，使用弯头胶头滴管从平底旋蒸瓶（25mL）瓶颈处不断淋洗，然后超声，直至瓶壁上的溶质溶解干净为止，量体积并放置于-80℃冰箱保存，备用。
二、两次分离提取
YTX粗分离
3.使用2.4×32cm层析柱，以70g碱性氧化铝作为填料，CHCl₃–MeOH（1:1）作为初始洗脱剂，粗分离YTX。用弯头胶头滴管，紧贴柱壁转圈上样3ml，开阀，待样品下移致液面相切时，用CHCl₃–MeOH（1:1）淋洗柱壁2-3次，每次约1mL，然后进行梯度洗脱，依次加入CHCl₃–MeOH(1:1，150ml),MeOH（150ml），MeOH–1%氨水洗脱。收集MeOH–1%氨水部分，10ml/管，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液。
4.将上述收集液旋转蒸发（100rpm/min,40℃），蒸干后，分3次，加入12ml甲醇，使用弯头胶头滴管从平底旋蒸瓶（25ml）瓶颈处不断淋洗，然后超声，直至瓶壁上的溶质溶解干净为止，将溶解液过0.22μm滤膜，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用。
YTX纯化
5.使用2.4×32cm层析柱，以60gC18作为填料，30%MeOH水溶液作为初始洗脱剂。紧贴柱壁转圈上样3ml，开阀，待样品下移致液面相切时，用30%MeOH淋洗柱壁2-3次，每次约1mL，然后进行梯度洗脱，依次用30%MeOH水溶液（250ml），40%MeOH水溶液（140ml），50%MeOH水溶液（140ml），60%MeOH水溶液（140ml），MeOH（250ml），梯度冲洗柱子。收集MeOH部分，10ml/管，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液。
6.将上述收集液旋转蒸发（100rpm/min,，40℃），蒸干后，分3次，加入12ml甲醇，使用弯头胶头滴管从平底旋蒸瓶（25ml）瓶颈处不断淋洗，然后超声，直至瓶壁上的溶质溶解干净为止，将溶解液过0.22μm滤膜，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用。
三、YTX纯品制备
7.使用半制备液相色谱-紫外光谱联用，以甲醇作为洗脱剂，用250mm×10mm的半制备柱，5umC18作为填料，在273nm处检测洗脱液的紫外吸收强度。进样量100ul，流速4.0ml/min，取3.64min处出峰（如图1），保留滤液。重复次过程，把步骤6中收集液全部提取完成。合并取得滤液，旋转蒸发浓缩至2ml。
8.浓缩后的滤液再次提取，重复步骤7过程，并小心提取3.64min处出峰（如图2），合并所提取滤液，得到YTX纯化产品。
将YTX纯品旋蒸浓缩，利用步骤7过程检测纯度，得到波谱图上只有一个单峰（如图3），旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。