技术领域
本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因及其应用。
背景技术
在当今节能、减排、低碳等理念的引导下，开发可再生能源成为热门的研究方向。目前大多数可再生能源都是以发电的形式提供能量，但是由于绝大多数运输工具仍以液体燃料作为能源，因此电能无法直接解决目前运输工具的动力问题。
生物燃料是目前惟一可以作为液体燃料的可再生能源，因此在可再生能源的发展中占据着重要地位。生物乙醇和生物柴油由于具有大规模生产的潜质，成为最有希望取代石油的两种生物燃料。二者中，生物柴油更适合目前的内燃机，意味着从石油到生物柴油基本不会影响当前运输网络的运行。况且生物柴油还拥有许多优于石油的特点，如降低一氧化碳排放以及提高燃烧效率等等(Demirbas,2007)。不同于生物乙醇和天然气，生物柴油可以利用目前成熟的石油运输系统进行快速配送，这为其大规模推广创造了有利条件(Demirbas,2008)。生物柴油主要来源于植物中的储存脂质，例如油料作物(花生、大豆、油棕)中的三脂酰甘油(triacylglycerols,TAG)。理论上，如果大规模生产油料作物，必定能够满足当前的能源需求，然而这一举措也会产生诸多问题，包括油料作物与人争粮争地，以及提高净碳排放等等。
在这种情况下，产油微藻成为生物柴油行业的重要关注对象。大多数微藻的油脂单位产量高于陆生植物，据报道，某些微藻的含油量占干重的75％以上(Chisti,2008)。此外，微藻培养不占用耕地，且具有水上培养的潜在可能，海生藻更避免了与人争夺淡水的隐患，因此微藻产油具有十分乐观的前景。
TAG是绝大多数微藻中最重要的储存油脂，在形成TAG的通路中，三个脂酰辅酶A分子通过内质网中的KennedyPathway，先后结合在甘油-3-磷酸分子的sn-1、sn-2和sn-3位置(Kresge等,2005)。其中，甘油-3-磷酸脂酰转移酶(glycerol3-phosphateacyltransferase,GPAT)和溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidicacidacyltransferase,LPAT)分别将前两个脂酰基结合在甘油-3-磷酸分子的sn-1和sn-2位，磷脂酸酯酶(Phosphatidicacidphosphatase,PAP)随后除去sn-3位上的磷酸基团，形成二脂酰甘油(diacylglycerol,DAG)。TAG合成的最后一步反应也是该通路惟一的限速步骤，该反应以DAG作为酰基受体，主要由二酰甘油酰基转移酶(diacylglycerolacyltransferases,DGAT)进行催化。
DGAT存在于所有已研究过的真核细胞中，与KennedyPathway中的其他酰基转移酶相似，DGAT以脂酰辅酶A作为酰基供体。目前已发现至少2类主要的DGAT家族，分别被命名为I型和II型DGAT，这两类DGAT都是膜蛋白，尽管他们在TAG生物合成中扮演相同角色，但在氨基酸序列上没有任何相似性。位于细胞基质的III型DGAT也已在植物中有报道，目前认为参与角质素的合成(Rani等,2010)。在动物中，与I型DGAT相比，II型DGAT对底物有更强的亲和力，积累TAG的速度也更快(Yen等,2008)，小鼠的基因敲除实验表明这两类DGAT在功能上是不重叠的——敲除掉I型DGAT的小鼠会肥胖化，而敲除掉II型DGAT的小鼠则会在出生数小时之内死亡(Chen等,2002)。在高等植物中，虽然I型和II型DGAT的功能差异尚在争论中，但目前的报道都倾向于认为二者的表达模式在时空上都存在差异。在油桐中进行的亚细胞荧光免疫实验表明这两类DGAT在内质网上的分布并不重叠(Shockey等,2006)，有关橄榄的研究发现I型DGAT在橄榄的油脂积累中起主要作用(Banilas等,2010)，而在油桐和蓖麻(都含有稀有脂肪酸)油脂积累的报道中，则认为II型DGAT起主要作用(Kroon等,2006)。对于两类DGAT的生化研究也为二者的差异提供了线索，目前普遍认为I型DGAT负责催化16:0和18:1脂肪酸与DAG的sn-3位的结合，而II型DGAT则负责催化稀有脂肪酸的结合(Li等,2010)。
综上所述，DGAT在促进TAG的生物合成以及改良TAG品质等方面，都具有极其重要的作用。因此，利用微藻中丰富多样的DGAT基因资源、采用基因工程的手段来提高生物体TAG的含量和组分，进而提高产油量及燃料品质，在生物能源行业中必将拥有巨大的发展潜力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有三脂酰甘油(TAG)合成功能的基因及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种具有三脂酰甘油合成功能的基因，基因为述核苷酸序列：
1)基因为SEQIDNO1所示的碱基序列；或，
2)基因与序列表中序列1所限定的核酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的DNA序列。
一种具有三脂酰甘油合成功能的基因编码蛋白，所述基因编码的蛋白为下列氨基酸序列
1)基因编码的蛋白为SEQIDNO2所示的氨基酸序列；或
2)基因编码的蛋白通过将SEQIDNO2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质与SEQIDNO2的蛋白具有相同的生物学功能。
一种具有三脂酰甘油合成功能的基因的克隆方法，
1)从IMET1的cDNA中扩增DGAT基因；
2)回收扩增产物连接到测序载体上，通过测序获得微拟球藻DGAT基因的全长编码序列；
其中，步骤1)所采用的引物为
NoDGAT-for：5’ATGACGCCGCAAGCCGAC3’；
NoDGAT-rev:5’CTCAATGGACAACGGGCGCGTCT3’。
一种重组载体，该重组载体含有权利要求1所述的基因序列。
一种宿主细胞，该宿主细胞含权利要求4所述的重组载体。所述的宿主细胞为酵母。
一种具有三脂酰甘油合成功能的基因的应用，将所述基因作为二酰甘油酰基转移酶，应用于促进三脂酰甘油的生物合成以及改良三脂酰甘油的品质中。
本发明所具有的优点：
本发明的基因位于微拟球藻藻株IMET1的核基因组，所编码的蛋白全名为二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)，本发明还涉及该基因的功能和用途。本发明分离出了该DGAT基因的全长cDNA序列，并采用酵母DGAT缺失突变系统，进行该基因的功能互补实验，实验证明该基因能够提高模式生物酵母的TAG合成能力，而且该DGAT在合成TAG时，对于不同脂肪酸底物的吸收具有偏好性。所公开的全长基因及氨基酸序列为微拟球藻中的首次报道，丰富了DGAT基因家族的成员；该基因能够显著提高酵母合成TAG的能力，证明了其在利用基因工程手段提高生物体生产TAG方面的应用价值；此外，该基因在合成TAG时，对于不同脂肪酸底物的吸收具有偏好性，因而还具有改良生物体产油品质的应用潜力。
本发明的TAG合成功能的基因，该基因是从微拟球藻(Nannochloropsis)中分离出来的二酰甘油酰基转移酶DGAT基因。该TAG合成功能的基因在提高生物体TAG含量方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提供的基因的物种间同源性分析图。
图2为本发明实施例提供的酵母表达载体的构建过程图。
图3为本发明实施例提供的基因在酵母中产生TAG的检测结果图。其中，图3A是薄层色谱的检测结果，图3B是用ESI-MS对TAG进行定量的结果。
图4为本发明实施例提供的基因对酵母TAG中的脂肪酸链组成的影响图。其中x轴为脂肪酸种类，y轴为脂肪酸所占百分比，*表示t检验有显著差异(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.)或酵母遗传法实验指南(MethodinYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual,AdamsAetal编,ColdSpringHarborLaboratory,1998出版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一：NoDGAT全长编码区的克隆与分析
利用PCR技术从产油微拟球藻Nannochloropsisoceanica(IMET1)的cDNA中克隆DGAT基因，所用引物依据本实验室前期的数据分析基础进行设计，并在引物的两端引入需要的酶切位点，交由上海生工合成：
NoDGAT-for：5’ATGACGCCGCAAGCCGAC3’；
NoDGAT-rev:5’CTCAATGGACAACGGGCGCGTCT3’。
所用PCR仪为Eppendorf公司的MasterCycler，反应体系50μL，包括4μLdNTP(2.5mMeach，TAKARA)，正反向引物各2μL(10μM)，5μL10×buffer(Mg2+plus，TAKARA)，0.4μLrTaq酶(5U/μL，TAKARA)，1μLDNA模板(50ng/μL，正、负对照分别加入等体积的相应质粒和野生型DNA)，以及超纯水35.6μL。反应体系如下：起始94℃预变性3min，然后94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1-2min，30个循环，最后72℃反应7min。
反应结束后，取5μLPCR产物与1μL6×loadingbuffer(TAKARA)混匀，点入1％(w/v)的琼脂糖(BIOWEST)凝胶中，在北京六一仪器厂生产的电泳系统上以120V电泳25min后，使用UVP公司的UV凝胶成像仪BioChemiHR进行观察、拍照。用Omega公司的Cycle-PureKit或GelExtractionKit从PCR产物中纯化并回收目的片段，其操作完全按照说明书进行。
将得到的纯化片段连入TAKARA公司的pMD18-T载体中，并使用热激转化的方式将其转入全式金公司的大肠杆菌感受态细胞Trans5α中，阳性克隆送至Invitrogen公司测序，得到了微拟球藻DGAT基因的全长编码区序列，参见序列表SEQIDNO1所示序列。
对获得的基因进行分析：NoDGAT的cDNA全长2442bp，其中ORF为1092bp，40nt处是ATG，1991nt处是终止子TAA，编码了一个含363个氨基酸的蛋白，参见序列表SEQIDNO2所示序列。
序列表SEQIDNO1
(a)序列特征：
●长度：2442(其中ORF为40-1993，其长度为1092)
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：产油微拟球藻Nannochloropsisoceanica
结构特点：NoDGAT的cDNA全长2442bp，其中ORF为1092bp，40nt处是ATG，1991nt处是终止子TAA，编码了一个含363个氨基酸的蛋白。
实施例2：NoDGAT编码的蛋白结构及同源分析
利用NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对NoDGAT所编码的蛋白进行分析，结果显示该基因编码的蛋白具有LPLAT_MGAT-like结构域。
利用MEGA4.1程序对NoDGAT的氨基酸序列进行同源比对分析，参见图1。分析结果显示，它与高等植物中的同源基因具有较高的同源性，例如与拟南芥AtDGAT-2的同源性为34％。与动物中的同源性则比较低，例如与人HsDGAT-2的同源性仅为27％。图中，黑色阴影部分代表保守的氨基酸。方块表示在所有DGAT中都保守而且具有关键作用的一个His和一个Phe，比对的物种分别是人Hs(NCBI接收号AY358532)，小鼠Mm(NM026384)，油桐Vf(ABC94473)，蓖麻Rc(XP002528531)，卫矛Ea(ADF57328)，拟南芥At(NP566952)，烟草Nt(JX843807)，向日葵Ha(HM015633)，三角褐脂藻Pt(JQ837823)，酵母Sc(NM001183664)，微拟球藻No(●突出表示)。
实施例3：NoDGAT在酵母中的应用
(一)酵母表达载体的构建
参见图2。构建载体的具体方法如下：通过PCR方法，以微拟球藻IMET1的cDNA为模板，扩增获得NoDGAT的全长ORF片段。为了构建克隆的需要，借助引物引入法，在靶序列5’端加上KpnI酶切位点和保护碱基，在其3’端加上EcoRI酶切位点，引物序列如下：
NoDGAT-for-KpnI：
5’GGTACCACATAATGACGCCGCAAGCCGAC3’
NoDGAT-rev-EcoRI：
5’GAATTCTTACTCAATGGACAACGGGCGCGTCT3’
同时，以酵母的DGAT基因DGA1作为正对照：通过PCR方法，以酵母SCY62的cDNA为模板，扩增获得DGA1的全长ORF片段。为了构建克隆的需要，借助引物引入法，在靶序列5’端加上BamHI酶切位点和保护碱基，在其3’端加上NotI酶切位点，引物序列如下：
DGA1-for-BamHI：
5’GGATCCACATAATGTCAGGAACATTCAATGATATAAG3’
DGA1-rev-NotI：
5’TGCGGCCGCTTACCCAACTATCTTCAATTCTGCAT3’
其中，下划线表示酶的识别位点，粗体表示起始密码子和终止密码子。
将PCR扩增得到产物利用酶切位点分别定向克隆至Invitrogen公司的载体pYES2中，并使用热激转化的方式将其转入大肠杆菌感受态细胞Trans5α中。阳性克隆送至Invitrogen公司测序确认后，。于-80℃保存。
(二)转化酵母
使用LiAc热激转化法，将上述获得的含有NoDGAT的pYES2表达载体转化到营养缺陷型酿酒酵母突变体H1246(MATαare1-Δ::HIS3are2-Δ::LEU2DGA1-Δ::KanMX4lro1-Δ::TRP1ADE2)中，该突变体由瑞典Sten教授赠予。同时，将含有DGA1的pYES2表达载体转化到H1246中作为正对照，将pYES2空载体转化到H1246中作为负对照。
(三)酵母转化子的诱导表达与油脂提取
所用基本培养基为YNB，并加入所需氨基酸。筛选标记为尿嘧啶营养缺陷。
诱导表达时，将菌液在上述尿嘧啶缺陷培养基中培养至对数期，再接入诱导培养基中，初始OD600＝0.4。上述添加所需氨基酸的YNB诱导培养基的配方为，在YNB培养基的基础上再加入2％半乳糖(w/v)，1％棉籽糖(w/v)，0.67％去氨基酸酵母氮源(w/v)以及0.74g/L-Ura必需氨基酸，NoDGAT和正、负对照均各包含3个转化子，作为生物学平行。上述样品置于30℃摇床中培养，直到OD600＝6.0。
酵母油脂的提取参考Bligh和Dyer发明的氯仿-甲醇法，提取物用于进一步的薄层层析和GC-MS分析。
(四)酵母油脂中TAG的含量与组分分析
酵母油脂的薄层层析分离参考Ghosal的方法。由图3A可见，负对照pYES2观察不到TAG点，而正对照DGA1则有明显的TAG点，此外，微拟球藻DGAT也显现出明显的TAG点，表明NoDGAT确实具有TAG合成酶的活性。进一步由图3B可见，NoDGAT的TAG合成酶活性要显著高于酵母自身DGA1的活性，这证明了微拟球藻DGAT在提高生物体的TAG含量方面具有重要的应用价值。
用Agilent气相色谱-四级杆质谱联用仪(GC-MS)分析TAG的流程如下：将TAG从上述载有TAG的硅胶板上刮下，用氯仿-甲醇溶解后，将下层氯仿溶液在氮吹仪下吹干后，加入1％硫酸-甲醇溶液(v/v)，并加入50uL正十九烷酸的甲醇溶液(2.25g/L)作为内标，充氮气后用封口膜密封，于70℃烘箱中反应60min进行甲酯化。待冷却后，用正己烷萃取甲酯化产物并用GC-MS分析。各脂肪酸链的量依据其与正十九烷酸的峰面积比值进行估定。由图4可见，与DGA1相比，NoDGAT产生的TAG中，短链的脂肪酸含量较高，而且，脂肪酸14:0、16:0和20:0的含量在NoDGAT和DGA1之间都有显著差异，这证明了微拟球藻DGAT与DGA1在脂肪酸底物的吸收上具有不同的偏好性。由于微拟球藻DGAT更偏好合成短链脂肪酸相关的TAG，因此具有改良生物体产油品质的应用潜力。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。