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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410648061.9 (22)申请日 2014.11.14 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104450607 A (43)申请公布日 2015.03.25 (73)专利权人 武汉金开瑞生物工程有限公司 地址 430206 湖北省武汉市东湖高新区高 新大道666号生物城创新园B4栋B006 号 (72)发明人 沈鹤霄华权高肖颖徐春雷 (74)专利代理机构 北京华沛德权律师事务所 11302 代理人 刘杰 (51)Int.Cl. C12N 5/073(201。
2、0.01) (56)对比文件 CN 1908162 A,2007.02.07, CN 101974481 A,2011.02.16, CN 101914485 A,2010.12.15, CN 1772884 A,2006.05.17, WO 02/29045 A2,2002.04.11, 审查员 耿锟锟 (54)发明名称 用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分培 养基及培养方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于HEK293细胞悬浮生 长的全化学成分培养基及培养方法， 培养基组成 包括氨基酸、 无机盐、 维生素、 微量元素、 碳水化 合物和其他有机分子； 在36.5-37， pH7.2-7。
3、.4， 溶氧浓度45-65条件下悬浮培养。 本发明的培 养基由于无任何生长因子及蛋白， 能够支持高密 度HEK293细胞生长， 维持活力时间长。 权利要求书8页 说明书17页 附图1页 CN 104450607 B 2017.07.11 CN 104450607 B 1.用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分培养基， 其特征在于： 由氨基酸、 无机盐、 维 生素、 微量元素、 碳水化合物和其他有机分子组成； 所述氨基酸的组分和用量为： 所述无机盐的组分和用量为： 权利要求书 1/8 页 2 CN 104450607 B 2 所述维生素的组分和用量为： 所述微量元素的组分和用量为： 权利要求书。
4、 2/8 页 3 CN 104450607 B 3 所述碳水化合物和其他有机分子的组分和用量为： 权利要求书 3/8 页 4 CN 104450607 B 4 2.如权利要求1所述的用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分培养基， 其特征在于： 培 养基的组成和用量为： 其中， 氨基酸的组分和用量为： 权利要求书 4/8 页 5 CN 104450607 B 5 无机盐的组分和用量为： 微量元素的组分和用量为： 权利要求书 5/8 页 6 CN 104450607 B 6 维生素的组分和用量为： 权利要求书 6/8 页 7 CN 104450607 B 7 碳水化合物和其他有机分子的组分和用量。
5、为： 3.权利要求1-2任一项所述的培养基的配制方法， 其特征在于： 按照加入量称取各组 分， 加入三蒸水溶解， 完全溶解后， 加三蒸水定容到1L， 0.22 m滤膜过滤即可。 权利要求书 7/8 页 8 CN 104450607 B 8 4.权利要求1-2任一项所述的培养基培养HEK293细胞的方法， 其特征在于： 在装有 HEK293细胞培养基的生物反应器中悬浮培养HEK293细胞， 悬浮培养的条件为： 温度36.5-37 ， pH 7.2-7.4， 溶氧浓度45-65， 接种的起始细胞浓度为0.5106个细胞/mL。 权利要求书 8/8 页 9 CN 104450607 B 9 用于HE。
6、K293细胞悬浮生长的全化学成分培养基及培养方法 技术领域 0001 本发明涉及细胞培养技术领域， 特别涉及一种用于HEK293细胞高密度悬浮生长的 全化学成分培养基， 以及使用此培养基培养HEK293细胞的方法。 背景技术 0002 目前HEK293细胞的培养方式多采用带血清的培养基进行培养， 血清存在来源复 杂， 价格昂贵， 成分复杂， 易污染等缺点， 对重组蛋白的纯化与使用不利。 通常的无血清培养 基为了解决无血清添加的问题， 通过向培养基中添加血清细胞因子替代物， 如胰岛素， 转铁 蛋白， 植物蛋白水解物等成分， 这些蛋白成分在后期从培养基中纯化蛋白产品起到杂质的 作用， 不利于蛋白的。
7、纯化。 为了更好的纯化培养基的蛋白产品， 获得高质量的蛋白产品， 所 以需要组分限定的无血清无蛋白培养基来培养哺乳动物细胞例如HEK293细胞， 以获得较高 的产品质量。 发明内容 0003 本发明针对现有技术的不足， 提供一种用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分培 养基及培养方法。 0004 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案是： 0005 用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分培养基， 包括氨基酸、 无机盐、 维生素、 微 量元素、 碳水化合物和其他有机分子； 0006 所述氨基酸的组分和用量为： 0007 说明书 1/17 页 10 CN 104450607 B 10 0008。
8、 0009 所述无机盐的组分和用量为： 0010 0011 所述维生素的组分和用量为： 0012 说明书 2/17 页 11 CN 104450607 B 11 0013 0014 所述微量元素的组分和用量为： 0015 说明书 3/17 页 12 CN 104450607 B 12 0016 0017 所述碳水化合物和其他有机分子的组分和用量为： 0018 说明书 4/17 页 13 CN 104450607 B 13 0019 0020 进一步地， 所述培养基中还包括酚红指示剂， 用量为： 2.0-7.0mg/L。 0021 进一步地， 所述培养基中还包括表面活性剂F-68， 用量为： 1。
9、00-1000mg/L。 0022 进一步地， 所述培养基的组成和用量为： 0023 氨基酸的组分和用量为： 0024 说明书 5/17 页 14 CN 104450607 B 14 0025 0026 无机盐的组分和用量为： 0027 0028 微量元素的组分和用量为： 0029 0030 说明书 6/17 页 15 CN 104450607 B 15 0031 维生素的组分和用量为： 0032 0033 碳水化合物和其他有机分子的组分和用量为： 0034 说明书 7/17 页 16 CN 104450607 B 16 0035 0036 进一步地， 用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分。
10、培养基的配制方法， 按照加入 量称取各组分， 加入三蒸水水溶解， 完全溶解后， 加三蒸水定容到1L， 0.22 m滤膜过滤即可。 0037 上述的培养基培养HEK293细胞的方法， 在装有HEK293细胞培养基的生物反应器中 悬浮培养HEK293细胞， 悬浮培养的条件为： 温度36.5-37， pH7.2-7.4， 溶氧浓度45-65， 接种的起始细胞浓度为0.5*106个细胞/mL。 0038 本发明提供的无血清无蛋白全化学成分的培养基， 由于无任何生长因子及蛋白， 所有组分化学结构已知， 均为小分子物质， 成本低， 便于配制、 储存； 支持高密度HEK293细胞 生长， 维持活力时间长。 。
11、说明书 8/17 页 17 CN 104450607 B 17 附图说明 0039 图1为本发明实施例提供的培养基培养HEK293细胞时培养基中活细胞的密度和活 细胞占总细胞数的百分比随时间变化情况。 0040 图2为本发明实施例提供的培养基培养HEK293细胞时培养基中乳酸和葡萄糖的含 量随时间变化情况。 具体实施方式 0041 本发明的构思是， 一个用于细胞长时间悬浮培养的培养基， 1)添加通常培养基含 量一到二倍的各种氨基酸和无机盐等营养物质； 2)添加各种维持细胞悬浮培养的维生素， 以维持细胞的代谢和生命活动； 3)添加小分子有机营养物质以及广泛种类的微量元素增加 细胞长期悬浮培养的营。
12、养。 0042 (一)维生素： 在细胞生长代谢中， 维生素不作为能源， 而是作为细胞的组成成分。 维生素作为维持细胞生长的生物活性物质， 在细胞代谢中起调节及控制作用。 本发明在通 常培养基的基础上额外添加以下维生素以促进HEK293细胞的悬浮增殖。 0043 维生素C： 人源细胞系需要维生素C， 其他动物细胞可以自己制造这种维生素， 而人 等高等灵长类细胞需要添加这种维生素。 维生素C是一种抗氧化剂， 保护细胞免于自由基的 威胁， 维生素C同时也是一种辅酶。 0044 氯化胆碱： 既是细胞膜的组成成分之一， 又有促进脂肪分解的作用。 0045 叶酸： 1)作为体内生化反应中一碳单位转移酶系的。
13、辅酶， 起着一碳单位传递体的 作用。 2)参与嘌呤和胸腺嘧啶的合成， 进一步合成DNA和RNA。 0046 维生素K： 维生素K参与某特定的蛋白质中的谷氨酸的位置的羧化作用， 这些- 羧基谷氨酸(缩写为Gla)参与钙离子结合， 而具Gla残基对活性是必需的蛋白质统称Gla-蛋 白质。 0047 烟酰胺： 烟酰胺即维生素B3， 是烟酸的酰胺化合物。 烟酰胺是辅酶I和辅酶II的组 成部分， 成为许多脱氢酶的辅酶。 缺乏时可影响细胞的正常呼吸和代谢。 0048 维生素PP： 烟酸也称作维生素B3， 或维生素PP， 烟酸在人体内转化为烟酰胺， 烟酰 胺是辅酶 和辅酶的组成部分， 参与体内脂质代谢， 组。
14、织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解 的过程。 0049 维生素B5： 是辅酶A的组成部分。 0050 维生素B2:维生素B2的衍生物黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是谷胱甘肽还原酶(EGR) 的辅酶。 0051 维生素E:维生素E(vitamin E)是生育酚(tocopherol， T)与三烯生育酚 (Tocotrienol， T-3)的总称， 是脂溶性维生素， 为细胞膜上的重要组成成分， 亦是细胞膜上 的主要抗氧化剂。 0052 (二)小分子有机营养物质 0053 辅酶A:辅酶A是一种含有泛酸的辅酶， 在某些酶促反应中作为酰基的载体。 0054 乙醇胺： 是无血清培养基的重要组成成分， 与磷脂的合。
15、成有关。 0055 (三)微量元素： 铁、 硒、 铜、 钼、 锰、 钒、 锌、 铷、 锆、 铬、 镉、 钴、 镍、 硅、 锡、 锗等， 主要起 说明书 9/17 页 18 CN 104450607 B 18 细胞生理过程调节和控制作用。 0056 铁： 酶和血红素的辅基， 是线粒体中呼吸链的组成部分。 0057 铜： 超氧化物歧化酶的辅基。 0058 锌： 酶的辅基。 0059 钴： B12的组成部分。 0060 硒： 谷胱甘肽氧化酶的组成部分， 具有抗氧化作用。 0061 基于以上考虑， 本发明的培养基主要由以下几方面的组分构成： 0062 氨基酸： 作为合成蛋白质的基本成分， 同时也可以代。
16、谢为其他能量分子； 0063 无机盐： 无机盐的主要作用是帮助细胞维持渗透压平衡， 协助有机分子往细胞的 转运； K+， Ca2+， Mg2+， Zn2+等离子则参予代谢与信号转导以及促进贴壁和细胞增殖； 各种阴离 子(SO42-， NO3-等)则主要作为含硫或氮元素有机分子的前体； 0064 维生素： 许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分， 没有它们， 酶便没有活 性， 代谢活动将无法进行； 0065 碳水化合物和其他有机分子： 葡萄糖是细胞培养中需要的主要碳水化合物， 用作 细胞代谢的主要能量来源， 有机营养物质增加细胞长期悬浮培养的营养； 0066 微量元素： 调节细胞生理过程； 0。
17、067 酚红为培养基的pH指示剂； 0068 F-68为培养基的表面活性剂。 0069 实施例1用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分培养基及培养方法 0070 (一)运用统计学方法Plackett-Burman法确定HEK293细胞无血清培养基添加成分 0071 将HEK293细胞按5105cells/ml接种于100ml三角瓶中， 培养体积为35ml， 培养时 以DMEM/F12(v/v， 1 1)为基础培养基， 将三角瓶置于37温箱中摇床上培养， 摇床转速90r/ min。 0072 应用Plackett-Burman方法考察维生素C(X1)、 氯化胆碱(X2)、 叶酸(X3)、 微量。
18、元素 (X4， 表1)、 烟酰胺(X5)、 维生素PP(X6)、 维生素B5(X7)、 维生素B2(X8)、 维生素E(X9)等9种添 加成分对细胞生长的影响(表2、 3)。 在此基础上加入其他微量成分及Pluronic F-68， 组成 了适用于HEK293细胞悬浮培养的全化学成分培养基的组成配方， 见下文所述。 0073 表1.微量元素的组成成分 说明书 10/17 页 19 CN 104450607 B 19 0074 0075 表2.Plackett-Burman设计因素水平 0076 0077 表3.Plackett-Burman实验设计结果(细胞密度*105) 说明书 11/17 。
19、页 20 CN 104450607 B 20 0078 0079 据上数据可知， 用于HEK293细胞悬浮生长的全化学成分培养基， 培养基的组成和 用量为： 0080 氨基酸的组分和用量为： 0081 说明书 12/17 页 21 CN 104450607 B 21 0082 0083 无机盐的组分和用量为： 0084 0085 微量元素的组分和用量为： 说明书 13/17 页 22 CN 104450607 B 22 0086 0087 0088 维生素的组分和用量为： 说明书 14/17 页 23 CN 104450607 B 23 0089 0090 碳水化合物和其他有机分子的组分和用量。
20、为： 0091 说明书 15/17 页 24 CN 104450607 B 24 0092 0093 (二)培养基的配制方法 0094 按照上述加入量称取各组分， 加入三蒸水水溶解， 完全溶解后， 加三蒸水定容到 1L， 0.22 m滤膜过滤即可。 0095 (三)HEK293细胞在无血清无蛋白全化学成分的培养基中的驯化 0096 先用含5胎牛血清的本培养基， 克隆HEK293细胞， 随后逐渐以加有转铁蛋白和胰 说明书 16/17 页 25 CN 104450607 B 25 岛素(各10 g/ml)的无血清本培养基来培养HEK293细胞使之适应无血清培养环境。 随后在 转瓶上以加有牛血清白蛋。
21、白(30 g/ml)的无血清培养基以不完全连续方式(每天移除20 体积的培养物并补充新鲜培养基)培养细胞， 培养3-5天后， 换用本无血清无蛋白培养基培 养HEK293细胞， 检查细胞密度和分泌重组蛋白浓度， 整个细胞生长期重组蛋白的分泌量并 不降低。 除去胰岛素后， 既没有影响细胞密度， 也没有影响重组蛋白的产生。 0097 (四)应用本实施例的培养基培养HEK293细胞的结果情况 0098 本实施例的全化学限定培养基能够用于高密度的细胞生长及生活力， 见图1， 为了 检验存活细胞的数量， 培养基放置在3L的灌流培养反应器， 培养基接种HEK293细胞系， 接种 的起始细胞浓度为0.5*10。
22、6个细胞/ml， 悬浮培养的条件为： 温度36.5-37， pH7.2-7.4， 溶 氧浓度45-65。 该细胞系细胞在反应器中连续培养16天， 期间监控活性细胞的细胞密度。 活性细胞计数通过标准的台盼蓝染色分析并通过细胞计数板进行计数， 计算总细胞数中的 活性细胞数量比例， 氧气和二氧化碳通过管道连续供应到反应器中。 0099 培养基中乳酸及葡萄糖的含量随时间变化情况， 见图2， 乳酸含量和葡萄糖浓度的 浓度通过标准的化验程序来进行， 图1和图2的数据来自于同一批细胞培养， 可以看出， 这一 时期的活性细胞密度的增加， 但是乳酸在培养基中的浓度降低， 同一时期葡萄糖浓度仍保 持相对的恒定， 。
23、比较图2和图1提示同一反应器中的活性HEK293细胞数量增加直到第16天， 总结以上数据， 显示随着HEK293细胞的培养， 产生的乳酸含量在减少， D-葡萄糖的代谢也在 下降。 0100 最后所应说明的是， 以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管参照实例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明 的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖 在本发明的权利要求范围当中。 说明书 17/17 页 26 CN 104450607 B 26 图1 图2 说明书附图 1/1 页 27 CN 104450607 B 27 。