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1、(10)授权公告号 CN 102492671 B (45)授权公告日 2013.02.27 CN 102492671 B *CN102492671B* (21)申请号 201110378381.3 (22)申请日 2011.11.24 C12N 9/10(2006.01) C07K 16/40(2006.01) G01N 33/573(2006.01) (73)专利权人 中国农业大学 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 王保民 谭桂玉 南铁贵 赵洪伟 高巍 王敏 孙硕 曹振 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 任凤华 。
2、CN 101307092 A,2008.11.19, 全文 . CN 1869073 A,2006.11.29, 全文 . CN 101914156 A,2010.12.15, 全文 . CN 101042403 A,2007.09.26, 全文 . 王硕等 . 草甘膦抗性基因的重组表达及 ELISA 检测方法的初步建立 .食品科技 .2010, 第 35 卷 ( 第 8 期 ),39-43. 唐霓等 . 重组抗原 CP4-EPSPS 的表达及免疫 学活性研究 .重庆医科大学学报 .2006, 第 31 卷 ( 第 1 期 ),10-13. 敬凌霞等 . 抗 CP4_EPSPS 单克隆抗体的制。
3、 备和生物学特性的鉴定 .细胞与分子免疫学杂 志 .2007, 第 23 卷 ( 第 5 期 ),457-459. (54) 发明名称 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫 原及其制备方法与应用 (57) 摘要 本发明公开了5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合 酶的多肽抗原及其制备方法与应用。本发明所提 供的制备5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的多肽 抗原的方法， 包括如下步骤 ： (1) 将载体蛋白与双 功能试剂进行反应， 得到反应产物 I ； 所述双功能 试剂选自 4- 马来酰亚胺基丁酸 -N- 琥珀酰亚胺 酯、 琥珀酰亚胺基4-p-马来酰亚胺苯基丁酸盐 或N-马来酰亚胺乙酰基氧硫代。
4、琥珀酰亚胺 酯 ； (2)将所述步骤(1)得到的反应产物I与序列 表中序列 1 所示的多肽进行反应， 得到反应产物 II， 即得到 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体 的免疫原。本发明所提供的制备 EPSPS 多肽抗原 的方法以及由该方法获得的 EPSPS 多肽抗原， 将 在 EPSPS 蛋白的酶联免疫检测中有广阔的应用前 景。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘俊 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 1/1 页 2 1. 制备 5- 烯醇丙酮莽。
5、草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫原的方法， 包括如下步骤 ： （1） 将载体蛋白与双功能试剂进行反应， 得到反应产物 ； 所述双功能试剂选自 4- 马 来酰亚胺基丁酸 -N- 琥珀酰亚胺酯、 琥珀酰亚胺基 4-p- 马来酰亚胺苯基 丁酸盐或 N- 马来酰亚胺乙酰基氧 硫代琥珀酰亚胺酯 ； （2） 将所述步骤 （1） 得到的反应产物与序列表中序列 1 所示的多肽进行反应， 得到反 应产物， 即得到 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫原。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） 中所述载体蛋白与所述双功能试剂的投料摩尔比为 1 ： 10-1 ： 20 。
6、； 所述步骤 （2） 中所述反应产物与所述多肽的投料摩尔比为 1 ： 10-1 ： 20。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） 中所述反应的温度为 20 -25， 所述反应的时间为 1h-3h。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中所述反应的温度为 20 -25， 所述反应的时间为 10h-20h。 5.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） 中所述载体蛋白为牛血 清白蛋白或卵清白蛋白。 6.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （1） 中在得到所述反应产物 。
7、之后， 还包括以下步骤 ： 将所述反应产物进行凝胶过滤层析， 用 0.01M PH7.5 磷酸盐缓冲液进行洗脱， 收 集 OD278为 1.5-3.0 的洗脱液， 即得到纯化的反应产物 ； 所述凝胶过滤层析的介质为 Sephadex G-25。 7.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 （2） 中还包括将所述反应产 物进行透析， 得到纯化的反应产物的步骤。 8. 根据权利要求 1-6 任一所述的方法制备得到的 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗 体的免疫原。 9. 由权利要求 8 所述的 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫原制备得到的抗 体。 10.权利。
8、要求8所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原和/或权利要求 9 所述的抗体在鉴别转 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶基因植物中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102492671 B 2 1/7 页 3 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫原及其制备方 法与应用 技术领域 0001 本发明涉及5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原及其制备方法与应用。 背景技术 0002 莽草酸途径是植物和微生物芳香族氨基酸合成的重要途径。5- 烯醇丙酮莽草 酸 -3- 磷酸合酶 (EPSPS) 是莽草酸途径的关键酶。近年来， 由于除草剂草甘膦的广泛使 用， 及其非选择性的。
9、特点， 促使克隆草甘膦抗性基因、 培育抗草甘膦基因作物成为热点。 CP4-EPSPS 作为该类备选基因， 已成功应用于多种商业化抗草甘膦转基因作物。 0003 中国政府对转基因作物的安全性极为关注， 并制定了有关法规。但由于我们目前 未开展转基因抗除草剂草甘膦方面的研究， 也没有建立对国外进口植物是否为转基因抗除 草剂商品进行检测的体系， 所以还待开发转基因 EPSPS 蛋白的检测方法。免疫检测技术已 被广泛应用于毒素、 杀虫剂、 炸药等的环境污染和危险物的检测， 与其他检测系统相比， 免 疫检测方法具有快速、 廉价、 简便、 灵敏和特异的优点， 可便携进行现场检测。 免疫检测试剂 盒可以快速。
10、检测某一特定物质的含量， 但要将免疫分析法应用到检测转基因 EPSPS 蛋白， 必须制备相应的抗原和抗体。 发明内容 0004 本发明的一个目的是提供一种制备 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫 原的方法。 0005 本发明所提供的制备5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶抗体的免疫原的方法， 包括 如下步骤 ： 0006 (1) 将载体蛋白与双功能试剂进行反应， 得到反应产物 I ； 所述双功能试剂选自 4- 马来酰亚胺基丁酸 -N- 琥珀酰亚胺酯、 琥珀酰亚胺基 4-p- 马来酰亚胺苯基 丁酸盐或 N- 马来酰亚胺乙酰基氧 硫代琥珀酰亚胺酯 ； 0007 (2)将所述步骤(1)得到。
11、的反应产物I与序列表中序列1所示的多肽进行反应， 得 到反应产物 II， 即得到 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫原。 0008 所述步骤 (1) 中所述载体蛋白与所述双功能试剂的投料摩尔比为 1 10-1 20 或 1 10 或 1 15 或 1 20 ； 0009 所述步骤 (2) 中所述反应产物 I 与所述多肽的投料摩尔比为 1 10-1 20 或 1 10 或 1 15 或 1 20。 0010 所述步骤(1)中所述反应的温度为20-25或20或23或25， 所述反应的 时间为 1h-3h 或 1h 或 2h 或 3h。 0011 所述步骤(2)中所述反应的温度为20-。
12、25或20或23或25， 所述反应的 时间为 10h-20h 或 10h 或 15h 或 20h。 0012 所述步骤 (1) 中所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清白蛋白。 说 明 书 CN 102492671 B 3 2/7 页 4 0013 所述步骤 (1) 中在得到所述反应产物 I 之后， 还包括以下步骤 ： 0014 将所述反应产物 I 进行凝胶过滤层析， 用 0.01M PH7.5 磷酸盐缓冲液进行洗脱， 收集 OD278为 1.5-3.0 的洗脱液， 即得到纯化的反应产物 I ； 所述凝胶过滤层析的介质为 Sephadex G-25。 0015 所述步骤 (2) 中还包括将所述反应产。
13、物 II 进行透析， 得到纯化的反应产物 II 的 步骤。 0016 根据所述方法制备得到的 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫原也属于 本发明的保护范围。 0017 由所述 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫原制备得到的抗体也属于本 发明的保护范围。 0018 所述 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶抗体的免疫原和 / 或所述抗体在鉴别转 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶基因植物中的应用也属于本发明的保护范围。 0019 本发明所提供的制备 EPSPS 多肽抗原的方法能够方便、 快捷地获得 EPSPS 多肽抗 原， 且合成步骤简洁明了、 合成成本低， 效。
14、果好。用本发明方法制备的 EPSPS 多肽抗原进行 免疫得到的抗体的特异性好、 最低检测限值低。因此， 本发明所提供的制备 EPSPS 多肽抗原 的方法以及由该方法获得的 EPSPS 多肽抗原， 将在 EPSPS 蛋白的酶联免疫检测中有广阔的 应用前景。 具体实施方式 0020 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0021 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0022 4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(购自Sigma公司， 商品目录号为S9381) ； 羊抗鼠 IgG-HRP( 购自 Jackson 公司， 商品目录号为 79。
15、556) ； 弗氏完全佐剂 ( 购自 Sigma 公司， 商品目录号为 F5881) ； 弗氏不完全佐剂 ( 购自 Sigma 公司， 商品目录号为 F5506) ； EDTA( 购自 Sigma 公司， 商品目录号为 E6758) ； 牛血清白蛋 ( 购自 Sigma 公司， 商品目录号 为 A7906) ； 卵清白蛋白 ( 购自 Sigma 公司， 商品目录号为 A5503) ； 其余 NaCl、 Na2CO3和甘油 等常规试剂均购自北京化学试剂公司。 0023 实施例 1、 制备 5- 烯醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶的多肽抗原 0024 一、 多肽 - 牛血清白蛋白 ( 多肽 -BSA。
16、) 抗原的制备 0025 方法 I 0026 1、 EPSPS 蛋白抗原多肽的选择 0027 (1) 从 Genbank 中查找到农杆菌 CP4-EPSPS 蛋白的氨基酸序列， 相应编码基因的 Genbank 号为 Q9R4E4。 0028 (2)将上述步骤(1)得到的蛋白序列进行ANTHEPOT软件分析， 选取具有亲水性、 抗 原性、 可及性和特异二级结构的抗原表位， 确定拟合成的多肽序列。 0029 2、 多肽片段的合成 0030 上述步骤 1 所得到拟合成多肽片段采用固相合成法合成， 实测分子量为 1701.81， 其氨基酸序列如序列表中序列 1 所示。 0031 3、 多肽与载体蛋白连。
17、接 说 明 书 CN 102492671 B 4 3/7 页 5 0032 (1)称取牛血清白蛋(BSA)12.3mg， 充分溶解于1.0mL 0.01M PH7.5的磷酸盐缓冲 液 (PBS) 中， 得到溶液 I。 0033 (2) 向上述步骤 (1) 得到的溶液 I 中加入 0.18mg 4- 马来酰亚胺基丁酸 -N- 琥珀 酰亚胺酯 (GMBS)， 20搅拌反应 1h， 得到含有 BSA 与 GMBS 的偶联产物的溶液 II。GMBS 的 加入量是过量的， 即 BSA 与 GMBS 的投料摩尔比为 1 10。 0034 (3) 将上述步骤 (2) 所得到溶液 II 进行凝胶过滤层析， 层。
18、析介质为 Sephadex G-25， 洗脱液为 0.01M PH7.5 磷酸盐缓冲液， 流速控制为 50mL/h， 用 1.5ml 离心管收集过滤 液， 在 278nm 紫外线下测吸光值， 收集第一个峰的 7-9 管滤液 (OD278为 1.5-3.0) 于反应杯， 得到含有纯化的 BSA 与 GMBS 的偶联产物的溶液 III。 0035 (4)向上述步骤(3)所得到的溶液III中加入3.4mg上述步骤2合成得到的多肽， 20搅拌反应 10h， 得到含有多肽与载体蛋白偶联产物的溶液 IV。BSA-GMBS 偶联产物与多 肽的投料摩尔比为 1 10。 0036 (5) 将上述步骤 (4) 所。
19、得到的溶液 IV 置于透析袋中， 用 0.01M， PH7.5 磷酸盐缓冲 液 (PBS) 透析 2 天， 每天换 3 次透析液， 得到纯化的多肽与载体蛋白的偶联物， 即得到 5- 烯 醇丙酮莽草酸 -3- 磷酸合酶的多肽抗原。 0037 (6) 将上述步骤 (5) 的透析产物分装， 置于 -20冰箱中保存备用。 0038 上述步骤中 0.01M， PH7.5 磷酸盐缓冲液 (PBS) 的配制方法如下 ： 0039 将8.0g NaCl、 0.2g KH2PO4和2.96g Na2HPO4 12H2O， 溶解于蒸馏水中， 再用蒸馏水 定容至 1000mL。 0040 方法 II 0041 1、。
20、 EPSPS 蛋白抗原多肽的选择 0042 与方法 I 相同。 0043 2、 多肽片段的合成 0044 与方法 I 相同。 0045 3、 多肽与载体蛋白连接 0046 (1) 与方法 I 相同。 0047 (2) 向上述步骤 (1) 得到的溶液 I 中加入 1.0mg 琥珀酰亚胺基 4-(p- 马来酰亚胺 苯基 ) 丁酸盐 (SMPB)， 23搅拌反应 2h， 得到含有 BSA 与 SMPB 的偶联产物的溶液 II。SMPB 的加入量是过量的， 即 BSA 与 SMPB 的投料摩尔比为 1 15。 0048 (3) 与方法 I 相同。 0049 (4)向上述步骤(3)所得到的溶液III中加。
21、入5.1mg上述步骤2合成得到的多肽， 23搅拌反应 15h， 得到含有多肽与载体蛋白偶联产物的溶液 IV。BSA-SMPB 偶联产物与多 肽的投料摩尔比为 1 15。 0050 (5) 与方法 I 相同。 0051 (6) 与方法 I 相同。 0052 方法 III 0053 1、 EPSPS 蛋白抗原多肽的选择 0054 与方法 I 相同。 0055 2、 多肽片段的合成 说 明 书 CN 102492671 B 5 4/7 页 6 0056 与方法 I 相同。 0057 3、 多肽与载体蛋白连接 0058 (1) 与方法 I 相同。 0059 (2)向上述步骤(1)得到的溶液I中加入1.。
22、53mg N-马来酰亚胺乙酰基氧硫 代琥珀酰亚胺酯 (Sulfo-EMCS)， 25搅拌反应 3h， 得到含有 BSA 与 Sulfo-EMCS 的偶联产物 的溶液 II。Sulfo-EMCS 的加入量是过量的， 即 BSA 与 Sulfo-EMCS 的投料摩尔比为 1 20。 0060 (3) 与方法 I 相同。 0061 (4)向上述步骤(3)所得到的溶液III中加入6.8mg上述步骤2合成得到的多肽， 25搅拌反应 20h， 得到含有多肽与载体蛋白偶联产物的溶液 IV。BSA-Sulfo-EMCS 偶联产 物与多肽的投料摩尔比为 1 20。 0062 (5) 与方法 I 相同。 0063。
23、 (6) 与方法 I 相同。 0064 二、 多肽 - 卵清白蛋白 ( 多肽 -OVA) 抗原的制备 0065 方法与实验一中方法 I 所述多肽 - 牛血清白蛋白抗原的制备方法相同， 不同的是 所用的载体蛋白为卵清白蛋白 (OVA)。 0066 实施例 2、 EPSPS 多肽抗原的应用 0067 一、 利用多肽 - 牛血清白蛋白抗原制备抗体 0068 (1) 取 6-8 周龄的 Bal b/C 小白鼠 ( 购自军事医学科学院实验动物中心 ) 作为实 验动物。 0069 (2)基础免疫 ： 用PBS将上述实施例1中方法I制备的多肽-牛血清白蛋白抗原稀 释为 1mg/ml 的溶液， 取 1ml 抗。
24、原溶液用无菌过滤器过滤， 然后加入 1ml 的弗氏完全佐剂， 充 分乳化， 直到滴入水中不扩散。将乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射 Bal b/C 小 鼠， 注射剂量为 0.1mg 抗原 / 只。 0070 (3) 加强免疫 ： 基础免疫 3 周后， 取 1ml 上述稀释好的多肽 - 牛血清白蛋白抗原溶 液， 用无菌过滤器过滤， 然后加入 1ml 弗氏不完全佐剂， 充分乳化， 直到滴入水中不扩散。将 乳化好的抗原采用腹腔及背部皮下多点注射 Bal b/C 小鼠， 注射剂量为 0.1mg 抗原 / 只。 0071 按照上述方法每隔 2 周加强免疫一次， 共 4 次， 并从第三次加强免疫开始。
25、， 每次 免疫后第 5 天， 从小鼠眼眶采血， 测定抗体效价， 待效价大于 1 8000 后， 采血， 分离出多 肽 - 牛血清白蛋白抗血清， 即得到抗体。 0072 二、 抗体效果检测 0073 下述实验中所用的各种缓冲液如下 ： 0074 (1) 包被缓冲液 ： 0.05M、 pH9.6 的碳酸盐缓冲液 ； 0075 0.05M、 pH9.6 的碳酸盐缓冲液的配制方法如下 ： 0076 分别称取 1.5g Na2CO3和 2.93g NaHCO3， 用蒸馏水充分溶解后， 用蒸馏水定容至 1000mL。 0077 (2)磷酸盐缓冲液 ： 含有质量百分含量为0.9的NaCl的0.1M、 pH7。
26、.5磷酸盐缓冲 液。 0078 所述磷酸盐缓冲液的配制方法如下 ： 0079 分别称取8.0g NaCl、 0.2g KH2PO4和2.96g Na2HPO4 12H2O， 用蒸馏水充分溶解后， 说 明 书 CN 102492671 B 6 5/7 页 7 用蒸馏水定容至 1000mL。 0080 (3) 样品稀释液 PBSTG ： 每 1L 样品稀释液中含有 8.0g NaCl、 0.2g KH2PO4、 2.96g Na2HPO412H2O、 1.0mL Tween-20 和 1g 明胶， 其余为水。 0081 (4) 柠檬酸盐 - 磷酸盐缓冲液 ： 含有 0.01M 柠檬酸三钠和 0.0。
27、3M Na2HPO4的 pH5.5 的水溶液。 0082 (5) 底物缓冲液 ： 将 20.0mg 邻苯二胺 (OPD) 溶解于 10.0mL 柠檬酸盐 - 磷酸盐缓 冲液中， 然后加入 4L 体积百分含量为 30的 H2O2得到的溶液。 0083 (6) 终止缓冲液 ： 2.0M 的硫酸水溶液。 0084 (7)洗涤液 ： 每1L洗涤液中含有8.0g NaCl、 0.2g KH2PO4、 2.96g Na2HPO4 12H2O和 1.0mL Tween-20， 其余为水。 0085 ( 一 ) 抗体抑制实验 0086 1、 多肽 - 卵清白蛋白包被抗原溶液的配制 0087 将上述实施例 1 。
28、制备的多肽 - 卵清白蛋白抗原完全解冻后， 用上述包被缓冲液按 1 1000、 1 2000、 1 4000、 1 8000、 1 16000 进行梯度稀释， 即抗原稀释为 1ug/mL、 0.5ug/mL、 0.25ug/mL、 0.125ug/mL、 0.0625ug/mL。 0088 2、 多肽标准品溶液的配制 0089 (1) 称取 10mg 多肽 ( 由上述实施例 1 制备得到 )， 充分溶解于 10ML PBS 和甘油 (PBS 和甘油的体积比为 1 1) 组成的混合液中， 得到浓度为 1mg/mL 的多肽溶液。 0090 (2)用样品稀释液将上述步骤(1)的多肽溶液配成浓度为50。
29、0ng/mL的多肽标准品 溶液。 0091 3、 多肽 - 牛血清白蛋白抗血清稀释液的配制 0092 将上述步骤一制备的多肽 - 牛血清白蛋白抗血清用样品稀释液按 1 1000、 1 2000、 1 4000、 1 8000、 1 16000 进行梯度稀释。 0093 4、 将羊抗鼠 IgG-HRP 用由 PBS 和甘油 (PBS 和甘油的体积比为 1 1) 组成的混合 液稀释成 0.1mg/mL， 保存于 -20冰箱中。使用时用样品稀释液按 1 1000 稀释。 0094 5、 抗原、 抗体的棋盘格实验 0095 (1) 包被原的包被 ： 将上述步骤 1 制备的不同浓度的包被抗原溶液加入到酶。
30、标板 中， 每孔 100l， 37温育 3 小时 ； 倒去酶标板中的溶液， 用洗涤液洗板 4 次， 甩干 ； 0096 (2) 在步骤 (1) 的酶标板中加入上述步骤 2 制备的多肽标准品溶液 ( 实验孔 )， 每 孔 50L， 对照孔中不添加标准品溶液而加入 50L 样品稀释液 ； 0097 (3) 分别向上述实验孔和对照孔中加入上述步骤 3 制备的不同浓度的抗血清稀释 液， 每孔 50L ； 37温育 30 分钟 ； 倒掉酶标板中的溶液， 用洗涤液洗板 4 次， 甩干 ； 0098 (4) 在实验孔和对照孔中分别加入 100L 用样品稀释液稀释的 IgG-HRP， 37温 育 30 分钟 。
31、； 用洗涤液洗板 4 次， 倒掉酶标板中的溶液， 甩干 ； 0099 (5) 向实验孔和对照孔中分别加入 100L 底物缓冲液， 37温育 15 分钟后， 再向 每孔中加入 50L 终止缓冲液终止反应 ； 0100 (6) 在 492nm 下测定吸光值。 0101 实验设 3 次重复， 取三次实验结果的平均值， 结果如表 1 所示。 0102 表 1 抗原和抗体棋盘格实验结果 说 明 书 CN 102492671 B 7 6/7 页 8 0103 0104 表 1 中， a 表示不添加多肽竞争显色值 A0， b 表示添加 50L 500ng/mL 的多肽竞争 显色值 A500。 0105 结果。
32、表明， 当包被抗原与抗血清浓度适宜时， 就有抑制现象， 即 500ng/mL 孔与 0ng/mL 孔的吸光度值有差别， 500ng/mL 孔吸光度值小， 0ng/mL 孔吸光度值高 ； 用抑制率计 算抗原、 抗体的最佳组合， 从表 1 中可以看出， 当包被抗原稀释度为 1 32000( 即包被抗原 的浓度为 0.0625ug/mL)， 抗血清稀释度为 1 8000 时， 此时的抑制率最好， 为 84.78 ( 抑 制率(A0-A500)/A0*100)， 也即此时的抑制效果最好。 说明上述实施例1制备的多肽-BSA 可以作为免疫原制备出检测多肽的抗体。 0106 三、 EPSPS 的免疫检测 。
33、0107 将上述实验二制备得到的抗体， 应于 ELISA 方法分别对抗草甘膦的 EPSPS 转基因 大豆品种 ( 购自美国孟山都公司 )(EPSPS 转基因大豆品种为将 EPSPS 的编码基因导入常规 大豆中得到表达 EPSPS 的转基因大豆 ) 和常规品种中黄 13( 购自嘉祥秋收种业有限公司， 产品目录号为国审豆 2001009) 进行 EPSPS 蛋白检测， 具体检测过程包括以下步骤 ： 0108 (1) 称取 EPSPS 转基因大豆和常规品种中黄 13 各 0.3g， 分别加入 3mL PBS 提取液 后充分研磨， 提取4h后3000rpm离心10min， 分别取EPSPS转基因大豆上。
34、清液和常规品种中 黄 13 上清液用于分析 ； 0109 (2)将上述EPSPS转基因大豆上清液和常规品种中黄13上清液分别加入到酶标板 中， 转基因大豆为实验孔， 常规品种大豆为对照孔， 每孔 100L， 每个样品三个重复， 37温 育 3 小时 ； 倒去酶标板中的溶液， 用洗涤液洗板 4 次， 甩干 ； 0110 (3)在步骤(1)的酶标板中分别加入上述实验二中制备的稀释倍数为18000的 抗血清稀释液， 每孔 100L ； 37温育 30 分钟 ； 倒掉酶标板中的溶液， 用洗涤液洗板 4 次， 甩干 ； 0111 (4) 在实验孔和对照孔中分别加入 100L 稀释倍数为 1 1000 的。
35、 IgG-HRP， 37 温育 30 分钟 ； 用洗涤液洗板 4 次， 倒掉酶标板中的溶液， 甩干 ； 0112 (5) 向实验孔和对照孔中分别加入 100L 底物缓冲液， 37温育 15 分钟后， 再向 每孔中加入 50L 2.0M 的硫酸溶液终止反应 ； 0113 (6) 在 492nm 下测定吸光值。 0114 显色结果表明， 含有转基因样品提取液的孔与含有非转基因样品提取液的孔颜色 说 明 书 CN 102492671 B 8 7/7 页 9 有明显不同， 含有转基因样品提取液的孔颜色深， 含有非转基因样品提取液的孔颜色浅。 以 非转基因样品为对照， 待肉眼观测到鉴定样品的颜色明显深于。
36、非转基因样品时， 认为其为 转基因样品， 颜色没有差别时， 认为所鉴定样品为非转基因样品。 由此可初步鉴定转基因作 物的真伪。 0115 同时， 以步骤 (6) 所得到吸光值鉴别转基因作物真伪， 即所鉴定样品吸光值大于 对照样品吸光值三倍时， 认为所鉴定样品为转基因样品， 否则为非转基因样品。 实验设三次 重复， 结果取平均值。 0116 在本实验中， EPSPS 转基因大豆样品测得的吸光值为 0.48， 常规品种中黄 13 样品 测得吸光值为 0.13( 表 2)， EPSPS 转基因大豆样品的吸光值大于常规品种中黄 13 样品吸光 值三倍， 说明 EPSPS 抗体及 ELISA 方法能够有效地区别 EPSPS 转基因大豆和常规 ( 非转基 因 ) 大豆。 0117 表 2 常规大豆和抗草甘膦大豆中的 EPSPS 对比 0118 说 明 书 CN 102492671 B 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 102492671 B 10 。