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1、(10)授权公告号 CN 102559531 B (45)授权公告日 2014.03.19 CN 102559531 B (21)申请号 201010596059.3 (22)申请日 2010.12.15 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/21(2006.01) (73)专利权人 武汉科前动物生物制品有限责任 公司 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街 1 号 专利权人 华中农业大学 (72)发明人 陈关平 陈守文 顾伟 金梅林 冀志霞 徐高原 韩进 尹争艳 曹毅 方玉林 何伟 蔡旭旺 周锐 陈焕春 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏。
2、锋 CN 1942204 A,2007.04.04, WO 2008085406 A3,2008.09.18, 高鹏程 . 副猪嗜血杆菌培养条件的筛选及对 豚鼠的致病性试验 .动物医学进展 .2008, 第 29 卷 ( 第 10 期 ), 王海燕 . 副猪嗜血杆菌培养特性及致病性研 究 .金陵科技学院学报 .2009, 第 25 卷 ( 第 4 期 ), (54) 发明名称 一种副猪嗜血杆菌 5 型高密度发酵培养基及 应用 (57) 摘要 本发明属于农业微生物技术领域， 具体涉及 一种适用于副猪嗜血杆菌 5 型的高密度发酵培 养基， 其包括下列组分 ： 按照重量 / 体积计， 谷氨 酸钠 1。
3、 10g/L， 酵母粉 5 50g/L， 氯化钠 1 10g/L， 无水磷酸二氢钾 0.063 2.502g/L， 三水 磷酸氢二钾 0.351 14.044g/L ； 按体积比计牛 血清 5 40， 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD)1 10， 余量是水。本发明有利于副猪嗜血杆菌 5 型的高密度发酵， 菌体生长速度快， 能获得较高菌 量， 培养后的副猪嗜血杆菌 5 型活菌数可达到 50 亿。本发明的培养基材料来源广泛， 成本低廉， 可 有效扩增副猪嗜血杆菌 5 型， 能满足大规模疫苗 生产的需要。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 郝佳 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图。
4、 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102559531 B CN 102559531 B 1/1 页 2 1. 一种适用于副猪嗜血杆菌 5 型的高密度发酵培养基， 其特征在于所述的培养基是按 照如下步骤制备得到的 ： A、 取谷氨酸钠 1 10g/L， 酵母粉 5 50g/L， 氯化钠 1 10g/L， 用蒸馏水溶解后定容 至 1000ml， 调培养基的 pH 至 7.2 8.0， 在 115 121的高压蒸汽下灭菌 20 30min ； B、 称取 27.2g 的无水磷酸二氢钾， 加蒸馏水定容至 1。
5、000ml， 配制成磷酸二氢钾溶液 ； 称 取 45.6g 三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至 1000ml， 配制成磷酸氢二钾溶液 ； 取 23ml 磷酸二 氢钾溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 将二者混合， 配制成磷酸盐缓冲溶液， 在 121的高压蒸 汽下灭菌 20 30min ； C、 按体积比计， 取步骤 B 的磷酸盐缓冲溶液 1 40， 过滤除菌的牛血清 5 40， 烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸110， 加入灭过菌的步骤A的培养基， 得到副猪嗜血杆菌5型高密 度发酵培养基。 2. 一种适用于副猪嗜血杆菌 5 型的高密度发酵培养基的制备方法， 其特征包括下列步 骤 ： A、 取谷氨酸钠 1 10。
6、g/L， 酵母粉 5 50g/L， 氯化钠 1 10g/L， 用蒸馏水溶解后定容 至 1000ml， 调培养基的 pH 至 7.2 8.0， 在 115 121的高压蒸汽下灭菌 20 30min ； B、 称取 27.2g 的无水磷酸二氢钾， 加蒸馏水定容至 1000ml， 配制成磷酸二氢钾溶液 ； 称 取 45.6g 三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至 1000ml， 配制成磷酸氢二钾溶液 ； 取 23ml 磷酸二 氢钾溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 将二者混合， 配制成磷酸盐缓冲溶液， 在 121的高压蒸 汽下灭菌 20 30min ； C、 按体积比计， 取步骤 B 的磷酸盐缓冲溶液 1 。
7、40， 过滤除菌的牛血清 5 40， 烟 酰胺腺嘌呤二核苷酸110， 加入灭过菌的步骤A的培养基， 得到副猪嗜血杆菌5型高密 度发酵培养基。 3. 权利要求 1 所述的培养基在副猪嗜血杆菌 5 型的高密度发酵中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102559531 B 2 1/4 页 3 一种副猪嗜血杆菌 5 型高密度发酵培养基及应用 技术领域 0001 本发明属于农业微生物技术领域， 具体涉及一种副猪嗜血杆菌 5 型高密度发酵培 养基及应用。 背景技术 0002 副猪嗜血杆菌 (Haemophilus parasuis， HPs) 是常规饲养猪群上呼吸道的一种常 在菌， 但在特定条件下可以侵。
8、入机体并引起严重的全身性疾病， 以纤维素性多发性浆膜炎、 关节炎和脑膜炎为特征， 该病又称为革拉瑟氏病(Oliverira et al.， 2004)。 早期采用抗生 素进行治疗， 但是该菌耐药现象越来越常见， 常用药物对该病已无明显的疗效， 而且， 随着 人们对无药物残留、 绿色食品需求的期望越来越高， 目前许多国家对抗生素在动物饲料中 应用的限制也越来越严格， 抗生素在本病预防和控制等方面的应用必将受到严格限制和逐 步禁止， 因此， 疫苗接种己成为预防和控制该病的主要措施。 0003 TSB 培养基作为 HPs 传统的培养基， 该培养基的基本成分为 ： 葡萄糖 2.5g/L， 干酪 素 1。
9、7g/L， 磷酸二氢钾 2.5g/L， 胰液大豆蛋白胨 3g/L。该培养基的优点在于配制容易， 且是 复合的培养基。但是 TSB 培养基成本较高， 最后所得的活菌数较少， 一般活菌数在 15 20 亿， 且生产周期长。另外， TSB 培养基中氮源物质的种类和含量均很少， 不利于菌体大量增 长。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷， 针对副猪嗜血杆菌 5 型高密度发酵培养 的需要而筛选的一种高性能的发酵培养基， 该培养基既能保证副猪嗜血杆菌生长旺盛， 进 行正常代谢， 又能提高生长速度， 缩短生产时间， 并且该培养基完全能适应于副猪嗜血杆菌 疫苗生产。 0005 本发明制备的。
10、培养基是一种生产成本低廉， 活菌数较高， 一般活菌数为 45 50 亿， 且生产周期短的高密度发酵培养基。 0006 本发明通过下列技术方案实现 ： 0007 一种适用于副猪嗜血杆菌 5 型的高密度发酵培养基， 所述的培养基是按照如下步 骤制备得到的 ： 0008 A、 取谷氨酸钠110g/L， 酵母粉550g/L， 氯化钠110g/L， 用蒸馏水溶解后定 容至 1000ml， 调培养基的 pH 至 7.2 8.0， 在 115 121的高压蒸汽下灭菌 20 30min ； 0009 B、 称取 27.2g 的无水磷酸二氢钾， 加蒸馏水定容至 1000ml， 配制成磷酸二氢钾溶 液 ； 称取 。
11、45.6g 三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至 1000ml， 配制成磷酸氢二钾溶液 ； 取 23ml 磷酸二氢钾溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 将二者混合， 配制成磷酸盐缓冲溶液， 在 121的 高压蒸汽下灭菌 20 30min ； 0010 C、 按体积比计， 取步骤 B 的的磷酸盐缓冲溶液 1 40， 过滤除菌的牛血清 5 40， 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 1 10， 加入灭过菌的步骤 A 的培养基， 得到副猪嗜血杆菌 说 明 书 CN 102559531 B 3 2/4 页 4 5 型高密度发酵培养基。 0011 本发明提供的培养基通过下列方法制备 ： 0012 A、 取谷氨酸钠110g/L。
12、， 酵母粉550g/L， 氯化钠110g/L， 用蒸馏水溶解后定 容至 1000ml， 调培养基的 pH 至 7.2 8.0， 在 115 121的高压蒸汽下灭菌 20 30min ； 0013 B、 称取 27.2g 的无水磷酸二氢钾， 加蒸馏水定容至 1000ml， 配制成磷酸二氢钾溶 液 ； 称取 45.6g 三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至 1000ml， 配制成磷酸氢二钾溶液 ； 取 23ml 磷酸二氢钾溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 将二者混合， 配制成磷酸盐缓冲溶液， 在 121的 高压蒸汽下灭菌 20 30min ； 0014 C、 按体积比计， 取步骤 B 的的磷酸盐缓冲溶液。
13、 1 40， 过滤除菌的牛血清 5 40， 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 1 10， 加入灭过菌的步骤 A 的培养基， 得到副猪嗜血杆菌 5 型高密度发酵培养基。 0015 本发明的特点是 ： 本发明的培养基以谷氨酸钠即味精作为副猪嗜血杆菌 5 型的主 要碳源， 既降低了生产成本， 并且谷氨酸钠作为小分子碳源物质， 更利于被副猪嗜血杆菌 5 型吸收和利用。本发明以酵母粉作为主要氮源， 酵母粉作为一种复合氮源不仅可以为菌体 提供氮源， 还可以为菌体提供必须的各种微量元素。磷酸盐缓冲液一方面能够有效地中和 副猪嗜血杆菌 5 型生长过程中所产生的酸性物质， 从而促进菌体增殖。另一方面磷酸盐是 细菌合成 AT。
14、P 等代谢产物的必须物质。因此该培养基比商业培养基 TSB 更经济且更利于菌 的生长。 附图说明 0016 图 1 ： 是副猪嗜血杆菌 5 型在商业培养基 TSB 中的生长曲线 ( 对照 )。 0017 图 2 ： 是副猪嗜血杆菌 5 型在本发明的最佳实施例制备的培养基中的生长曲线。 具体实施方式 0018 实施例 1 ： 0019 培养基的制备 ： 0020 (1)将谷氨酸钠1g， 酵母粉5g， 氯化钠1g， 用蒸馏水溶解后， 定容至1L， 调培养基的 pH 至 7.2， 在 115高压蒸汽下灭菌 30min。 0021 (2) 称取 27.2g 无水磷酸二氢钾加蒸馏水定容至 1L， 配置成。
15、磷酸二氢钾溶液， 备 用 ； 称取 45.6g 三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至 1L， 配置成磷酸氢二钾溶液， 备用 ； 取 23ml 磷酸二氢钾溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 将二者混合， 配成磷酸盐缓冲溶液， 于 115高压 蒸汽下灭菌 30min。 0022 (3) 待步骤 (1) 培养基冷却到 35时， 向灭过菌的培养基中加入所述的磷酸盐缓 冲液 (v/v)1， 再加入过滤除菌的牛血清 5 (v/v) 和 NAD1 (v/v)， 得到副猪嗜血杆菌 5 型高密度发酵培养基。 0023 实施例 2 ： 优化培养基的制备 0024 (1) 将谷氨酸钠 5g， 酵母粉 20g， 氯化钠 4g。
16、， 用蒸馏水溶解后， 定容至 1L， 调培养基 的 pH 至 7.5， 在 117高压蒸汽灭菌 25min。 0025 (2) 称取 27.2g 无水磷酸二氢钾加蒸馏水定容至 1L， 配置成磷酸二氢钾溶液， 备 说 明 书 CN 102559531 B 4 3/4 页 5 用 ； 称取 45.6g 三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至 1L， 配置成磷酸氢二钾溶液， 备用。取 23ml 磷酸二氢钾溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 二者混合， 配成磷酸盐缓冲体系溶液， 于 117高 压蒸汽灭菌 25min。 0026 (3) 待步骤 (1) 培养基冷却到 37时， 向灭过菌的培养基中加入所述的磷酸盐缓。
17、 冲液 (v/v)20。再加入过滤除菌的牛血清 20 (v/v) 和 NAD3 (v/v)， 得到副猪嗜血杆 菌 5 型高密度发酵培养基。 0027 实施例 3 ： 优化培养基的制备 0028 (1) 将谷氨酸钠 10g， 酵母粉 50g， 氯化钠 10g， 用蒸馏水溶解后， 定容至 1L， 调培养 基的 pH 至 7.6， 在 121高压蒸汽灭菌 20min。 0029 (2) 称取 27.2g 无水磷酸二氢钾加蒸馏水定容至 1L， 配置成磷酸二氢钾溶液， 备 用 ； 称取 45.6g 三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至 1L， 配置成磷酸氢二钾溶液， 备用。取 23ml 磷酸二氢钾溶液和 77m。
18、l 磷酸氢二钾溶液， 二者混合， 配成磷酸盐缓冲体系溶液， 于 121高 压蒸汽灭菌 20min。 0030 (3) 待步骤 (1) 培养基冷却到 40时， 向灭过菌的培养基中加入所述的磷酸盐缓 冲液 (v/v)40。再加入过滤除菌的牛血清 40 (v/v) 和 NAD10 (v/v)， 得到副猪嗜血杆 菌 5 型高密度发酵培养基。 0031 实施例 4 ： 优化培养基的制备 0032 (1)将谷氨酸钠2g， 酵母粉6g， 氯化钠2g， 用蒸馏水溶解后， 定容至1L， 调培养基的 pH 至 7.3， 在 116高压蒸汽灭菌 26min。 0033 (2) 称取 27.2g 无水磷酸二氢钾加蒸馏。
19、水定容至 1L， 配置成磷酸二氢钾溶液 ； 称 取45.6g三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至1L， 配置成磷酸氢二钾溶液。 取23ml磷酸二氢钾 溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 二者混合， 配成磷酸盐缓冲体系溶液， 于 116高压蒸汽灭菌 26min。 0034 (3) 待步骤 (1) 培养基冷却到 36时， 向灭过菌的培养基中加入所述的磷酸盐缓 冲液 (v/v)2。再加入过滤除菌的牛血清 6 (v/v) 和 NAD2 (v/v)， 得到副猪嗜血杆菌 5 型高密度发酵培养基。 0035 实施例 5 ： 优化培养基的制备 0036 (1) 将谷氨酸钠 8g， 酵母粉 40g， 氯化钠 8g， 用。
20、蒸馏水溶解后， 定容至 1L， 调培养基 的 pH 至 7.8， 在 118高压蒸汽灭菌 24min。 0037 (2) 称取 27.2g 无水磷酸二氢钾加蒸馏水定容至 1L， 配置成磷酸二氢钾溶液 ； 称 取45.6g三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至1L， 配置成磷酸氢二钾溶液。 取23ml磷酸二氢钾 溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 二者混合， 配成磷酸盐缓冲体系溶液， 于 118高压蒸汽灭菌 24min。 0038 (3) 待步骤 (1) 培养基冷却到 38时， 向灭过菌的培养基中加入所述的磷酸盐缓 冲液 (v/v)30。再加入过滤除菌的牛血清 35 (v/v) 和 NAD8 (v/v)，。
21、 得到副猪嗜血杆 菌 5 型高密度发酵培养基。 0039 实施例 6 ： 优化培养基的制备 0040 (1) 将谷氨酸钠 2.5g， 酵母粉 30g， 氯化钠 5g， 用蒸馏水溶解后， 定容至 1L， 调培养 基的 pH 至 7.4， 在 121高压蒸汽灭菌 20min。 说 明 书 CN 102559531 B 5 4/4 页 6 0041 (2) 称取 27.2g 无水磷酸二氢钾加蒸馏水定容至 1L， 配置成磷酸二氢钾溶液 ； 称 取45.6g三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至1L， 配置成磷酸氢二钾溶液。 取23ml磷酸二氢钾 溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 二者混合， 配成磷酸盐缓冲体系。
22、溶液， 于 121高压蒸汽灭菌 20min。 0042 (3) 待步骤 (1) 培养基冷却到 39时， 向灭过菌的培养基中加入所述的磷酸盐缓 冲液 (v/v)5。再加入过滤除菌的牛血清 10 (v/v) 和 NAD2 (v/v)， 得到副猪嗜血杆菌 5 型高密度发酵培养基。 0043 实施例 7 ： 优化培养基的制备 0044 (1) 将谷氨酸钠 5g， 酵母粉 25g， 氯化钠 2.5g， 用蒸馏水溶解后， 定容至 1L， 调培养 基的 pH 至 7.4， 在 121高压蒸汽灭菌 20min。 0045 (2) 称取 27.2g 无水磷酸二氢钾加蒸馏水定容至 1L， 配置成磷酸二氢钾溶液 ；。
23、 称 取45.6g三水磷酸氢二钾加蒸馏水定容至1L， 配置成磷酸氢二钾溶液。 取23ml磷酸二氢钾 溶液和 77ml 磷酸氢二钾溶液， 二者混合， 配成磷酸盐缓冲体系溶液， 于 121高压蒸汽灭菌 20min。 0046 (3) 待步骤 (1) 培养基冷却到 34时， 向灭过菌的培养基中加入所述的磷酸盐缓 冲液 (v/v)20。再加入过滤除菌的牛血清 15 (v/v) 和 NAD5 (v/v)， 得到副猪嗜血杆 菌 5 型高密度发酵培养基。 0047 表 1 ： 副猪嗜血杆菌 5 型 3L 发酵罐实验 0048 0049 参考文献 ： 0050 1Oliveira S， Pijoan C.Computer-based analysis of Haemophilus parasuis protein fingerprints.Can J Vet Res， 2004a， 68 ： 71-75 0051 2Oliveira S， Pijoan C.Haemophilus parasuis ： new trends on diagnosis， epidemiology and contro1.Vet Microbiol， 2004b， 99 ： 1-12 说 明 书 CN 102559531 B 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102559531 B 7 。