一株抗羊肚菌单克隆抗体及其制备方法 【技术领域】
该发明涉及一株抗羊肚菌单克隆抗体及其制备方法，属于免疫诊断及食用菌栽培技术领域。
背景技术
羊肚菌是一种珍稀的食用真菌，现有技术已经实现羊肚菌地人工栽培，但是，由于重复性差，在关键栽培环节尚存在技术问题，因此，目前仍不能实现羊肚菌的规模化生产，自野生资源中采集仍是收获羊肚菌的主要渠道。
羊肚菌的生活史是这样的，由子实体产生子囊孢子，在合适的条件下萌发成营养菌丝，营养菌丝经过积累并经过一系列复杂的质配、核配后形成结实菌丝，进而在合适的条件下形成菌核、原基、子实体。由此可知菌丝状态在羊肚菌的一生中占有及其重要地位，羊肚菌的菌种基本都是羊肚菌的菌丝体。
目前羊肚菌菌丝的鉴别方法主要是形态学方法。这就要求生长出子实体才能证明菌丝是该品种的菌丝，而羊肚菌却难以人工栽培，因此，借助形态学方法难以鉴别羊肚菌菌丝。近年来随着分子生物学等生物技术的进步，利用核酸序列分析也就是DNA测序已能解决菌丝的鉴别问题，但是，由于试剂、仪器价格昂贵，这种方法难以普及。
在免疫学领域，通过杂交瘤细胞株获得单克隆抗体是一种常规技术。单克隆抗体用于免疫诊断具有特异性强、灵敏度高、费用低、诊断周期短的特点。
【发明内容】
为了克服现有技术在羊肚菌鉴别上的不足，通过快速、准确、低成本地鉴别羊肚菌菌丝，探寻、跟踪羊肚菌在生长发育过程中菌丝的生长、分布、存亡规律，我们发明了一株抗羊肚菌单克隆抗体及其制备方法。
本发明之一株抗羊肚菌单克隆抗体其特征在于，该单克隆抗体能够特异性地与羊肚菌菌丝发生反应。
本发明之一株抗羊肚菌单克隆抗体制备方法其特征在于，制备羊肚菌菌丝抗原，用制备的羊肚菌菌丝抗原免疫BALB/C小鼠获得致敏的B淋巴细胞，再将该B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选得到能够分泌抗羊肚菌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用该细胞株制备抗羊肚菌单克隆抗体。
本发明其效果在于，在免疫学领域通过免疫诊断识别羊肚菌菌丝、检测羊肚菌含量。既能够定性地鉴别羊肚菌菌丝，也能够定量地检测样品中羊肚菌的含量。例如，双抗体夹心法酶联免疫吸附实验表明该单克隆抗体能够特异性地与羊肚菌菌丝反应，而不与试验所采用的其他担子菌目食用菌菌丝反应，见下表：
项目 羊肚菌 51589 羊肚菌 50536 羊肚菌 50537 羊肚菌 50759 木耳 香菇 平菇 滑子蘑 金针菇 双孢菇 OD450-620 0.950 0.845 0.860 0.915 0.120 0.112 0.095 0.105 0.094 0.086 结果判定 阳性 阳性 阳性 阳性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
同样，通过双抗体夹心法酶联免疫吸附实验建立与本发明之单克隆抗体相对应的羊肚菌抗原蛋白浓度酶标仪OD值工作曲线，一个线性回归方程为：
y＝0.0053x+0.0196，
x为标准样品中羊肚菌抗原蛋白浓度，y为标准样品的OD值。该线性回归方程的线性回归系数R为：
R2＝0.9879，
见附图所示，根据该工作曲线，即可检测羊肚菌抗原蛋白浓度，再换算出羊肚菌含量。
【附图说明】
附图是通过双抗体夹心法酶联免疫吸附实验建立与本发明之单克隆抗体相对应的羊肚菌抗原蛋白浓度酶标仪OD值工作曲线图，该图兼作为摘要附图。
【具体实施方式】
间接酶联免疫吸附实验表明该单克隆抗体能够特异性地与羊肚菌菌丝发生反应，具体特征包括：
a、间接酶联吸附实验表明该单克隆抗体能够特异性地与羊肚菌菌丝蛋白发生反应；
b、间接免疫荧光表明该单克隆抗体能够与羊肚菌菌丝细胞膜上特异位点结合；
c、该单克隆抗体为IgG型，特别是其中的IgG3亚型。
本发明之一株抗羊肚菌单克隆抗体制备方法其具体特征在于：
a、羊肚菌菌丝抗原的制备
将羊肚菌菌种接种到灭过菌的含有50ml马铃薯培养基(PDA)的250ml三角瓶中，23.5℃、120rpm培养；收集菌丝球，研磨、超声波破碎，9000g离心15分钟，取上清做为羊肚菌抗原，同时测定抗原液蛋白浓度。
b、免疫BALB/C小鼠获得致敏的B淋巴细胞
免疫纯种BALB/C小鼠，经检测确认免疫小鼠产生满意的效价后，无菌取脾制成脾细胞悬液，获得致敏的B淋巴细胞。
c、将该B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合
准备SP2/0骨髓瘤细胞；细胞计数，取1×107个SP2/0骨髓瘤细胞与1×108个脾细胞，之后混合于50ml离心管中，在60s内滴加完1ml50％的细胞融合剂聚乙二醇(PEG)；之后缓慢加入50ml1640培养液；离心后加入100ml的选择性培养液(HAT)，以每孔100μl滴加到10块96孔细胞培养板，放入CO2培养箱中培养。
d、筛选抗羊肚菌单克隆抗体杂交瘤细胞株
用处理好的羊肚菌抗原免疫兔，取兔抗羊肚菌阳性血清建立ELISA(酶联免疫吸附实验)。待96孔细胞板上的单克隆细胞长到1/4孔时，无菌吸取上清，用建立的ELISA间接法检测上清中是否有抗体，阳性孔按位置编号，再用有限稀释法对阳性细胞株进行亚克隆，亚克隆细胞板的单克隆细胞株上清的抗体检测100％阳性后，完成抗羊肚菌单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选，编号为W8C9，并冻存。
e、单克隆抗体的制备
用W8C9杂交瘤细胞株上细胞瓶培养，同时将W8C9杂交瘤细胞株注入BALB/C小鼠腹腔培养，培养的细胞上清及腹水中含有抗羊肚菌单克隆抗体，腹水的效价可达到1∶12000以上。
抗羊肚菌单克隆抗体的检验：
1、抗羊肚菌单克隆抗体的纯化与鉴定
用饱和硫酸铵法初步纯化制备的抗羊肚菌单克隆抗体。所制备的抗羊肚菌单克隆抗体与中国农业微生物菌种保藏中心(CCCA)的536#、537#、589#、579#羊肚菌菌种ELISA均显阳性反映，而与平菇、木耳、香菇、金针菇、滑子蘑、双孢菇均无交叉，说明所制备的抗羊肚菌单克隆抗体对羊肚菌菌丝有较好的特异性，见本说明书第2页表格中的内容。
2、双抗体夹心法酶联免疫吸附实验
先制备捕捉抗体。选健康的新西兰成年实验兔，皮下注射与弗氏完全佐剂完全混合羊肚菌抗原1ml，20天后采血，分离血清，测定抗体效价。用纯化的抗羊肚菌单克隆抗体以合适浓度包被酶标板，以标准羊肚菌抗原按浓度稀释作被检样，37℃1小时后洗板3次；以合适浓度的制备的兔抗羊肚菌抗血清作捕捉抗体，37℃1小时后洗板3次；以说明书注明稀释浓度的羊抗兔HRP标记抗体作酶标二抗，37℃1小时后洗板3次；加底物显色。进行特异性检验，结果见本说明书第2页表格中的内容，证明由W8C9杂交瘤细胞株分泌的抗羊肚菌单克隆抗体与羊肚菌菌丝特异性结合。
3、间接免疫荧光检测羊肚菌菌丝
先处理羊肚菌菌丝。把经过处理的羊肚菌菌丝与合适浓度的抗羊肚菌单克隆抗体在37℃作用1小时，离心、洗三次，再加合适浓度羊抗鼠FITC二抗，同上处理，处理后的菌丝悬浮，镜检。荧光显微镜观察，在495nm光源下，可以观察到羊肚菌菌丝体发出绿色的荧光。进行特异性检验，用同样处理方法处理其他食用菌菌丝，均观察不到菌丝荧光，说明抗羊肚菌单克隆抗体只与羊肚菌特异性结合。