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1、(10)授权公告号 CN 103232964 B (45)授权公告日 2014.12.17 CN 103232964 B (21)申请号 201310199811.4 (22)申请日 2013.05.24 CCTCC NO ： M2013221 2013.05.20 C12N 1/20(2006.01) C12P 1/06(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (73)专利权人 武汉大学 地址 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武 汉大学 (72)发明人 洪葵 潘洁 (74)专利代理机构 武汉科皓知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 42222 代理人 张火春 C。
2、N 101720772 A,2010.06.09,说明书实施例 1. 肖琳等 . 前体对吸水链霉菌 NND-52 抗生素 合成的调控 .中国抗生素杂志 .2003, 第 28 卷 ( 第 5 期 ),260-262. 江曙等.吸水链霉菌NND-52-C菌株产阿扎霉 素 B 发酵条件的优化 . 生物加工过程 .2004, 第 2 卷 ( 第 1 期 ),53-57. (54) 发明名称 一种高产阿扎霉素 F 类化合物菌株链霉菌 TKPJ3039 及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种高产阿扎霉素 F 类化合物 菌株链霉菌TKPJ3039及其应用。 链霉菌TKPJ3039 保藏于中国典型培养物。
3、保藏中心， 分类命名为链 霉 菌 TKPJ3039Streptomycessp.TKPJ3039， 保 藏 编号为 CCTCCNO ： M2013221。链霉菌 TKPJ3039 可 用于制备阿扎霉素 F 类化合物， 将其种子液接种 到发酵培养基上进行发酵即可获得阿扎霉素 F 类 化合物。 若发酵培养基为葡萄糖马铃薯培养基， 则 阿扎霉素F类化合物的产量可达4.07g/L， 与野生 链霉菌 211726 在原始培养基发酵相比， 产量提高 了近 4 倍 ； 若发酵培养基为甘油马铃薯培养基， 则 阿扎霉素 F 类化合物种类丰富， 为 11 个以上。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (。
4、56)对比文件 审查员 滕文静 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 (10)授权公告号 CN 103232964 B CN 103232964 B 1/1 页 2 1.一种高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039， 其特征在于该菌株保藏于中国 典型培养物保藏中心， 其分类命名为链霉菌 TKPJ3039Streptomyces sp.TKPJ3039， 保藏编 号为 CCTCC NO ： M2013221。 2. 权利要求 1 所述的高产阿扎霉素 F 类化合物菌株链霉菌 TKP。
5、J3039 在制备阿扎霉素 F 类化合物中的应用。 3. 利用权利要求 1 所述的高产阿扎霉素 F 类化合物菌株链霉菌 TKPJ3039 制备阿扎霉 素 F 类化合物的方法， 其特征在于包含如下步骤 ： 将链霉菌 TKPJ3039 种子液接种到发酵培 养基上进行发酵。 4. 根据权利要求 3 所述的制备阿扎霉素 F 类化合物的方法， 其特征在于 ： 所述的发 酵培养基为葡萄糖马铃薯培养基或甘油马铃薯培养基 ； 其中， 葡萄糖马铃薯培养基的配方 包含如下配比的成分 ： 葡萄糖 10g、 酵母提取物 9.23g、 马铃薯淀粉 26.7g， 去离子水 1L， pH7.2-7.4 ； 甘油马铃薯培养基。
6、的配方包含如下配比的成分 ： 甘油 10mL、 马铃薯淀粉 35g、 酵 母粉 6g、 去离子水 1L， pH 调至 7.2-7.4。 5. 根据权利要求 3 所述的制备阿扎霉素 F 类化合物的方法， 其特征在于 ： 所述的种子 液为链霉菌 TKPJ3039 孢子液接种 YE 液体培养基在 28、 220rpm 条件下， 培养 2-3 天的 菌液 ； 所述的 YE 液体培养基为 ： 葡萄糖 4g、 酵母提取物 4g、 麦芽提取物 10g、 去离子水 1L， pH7.2-7.4。 6. 根据权利要求 3 所述的制备阿扎霉素 F 类化合物的方法， 其特征在于 ： 所述的种子 液的量为发酵培养基体积。
7、的 10。 7. 根据权利要求 3 所述的制备阿扎霉素 F 类化合物的方法， 其特征在于 ： 所述的发酵 的条件为 ： 培养温度 25-30， 220-240rpm， 容器装量 1-2/10， 发酵周期 10-14 天。 8. 根据权利要求 3 所述的制备阿扎霉素 F 类化合物的方法， 其特征在于还包括阿扎 霉素 F 类化合物的粗提取步骤， 具体为 ： 量取一定体积发酵液， 等体积加入甲醇， 浸提 12h， 7500rpm10min 离心取上清液， 等体积乙酸乙酯萃取三次， 合并乙酸乙酯， 用旋转蒸发仪蒸 干乙酸乙酯得到阿扎霉素 F 类化合物的粗提物。 权 利 要 求 书 CN 1032329。
8、64 B 2 1/4 页 3 一种高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉菌TKPJ3039及其应 用 技术领域 0001 本发明属于生物工程领域， 具体涉及一种高产阿扎霉素 F（Azalomycin F） 类化合 物菌株链霉菌 TKPJ3039 及其应用。 背景技术 0002 目前主要从链霉菌属的不同种所产的次级代谢产物中发现阿扎霉素类化合物， 文 献报道有四种类型， 分别为 Azalomycin B（阿扎霉素 B） 、 Concanamycins、 Bispolides 和 Azalomycin F， 其内酯环碳原子数分别为 16、 18、 20 和 36 元， 均显示出广谱的抗真菌、 抗细 菌和细。
9、胞毒活性。 0003 Azalomycin B 可由孢链霉菌、 吸水链霉菌、 白色链霉菌、 紫黑链霉菌、 假轮枝链霉 菌和小小链霉菌合成， 具有典型大环内酯类抗生素的抗菌特征， 如抗枯草芽孢杆菌、 金黄色 葡萄球菌、 藤黄八叠球菌、 白喉棒状杆菌、 破伤风芽孢杆菌的活性， 对某些植物的病原菌水 稻腐霉菌、 一串红小菌核也具有较强的抑制作用 ； 此外还具有抗寄生虫活性， 可作为瘤胃动 物增长促进剂、 免疫抑制剂及用于研究 ATPase 的类型 （严淑玲， 2002） 。在Streptomyces melanosporofaciens生物制备阿扎霉素 B 的研究中， 一级种子在糊精和水解玉米淀粉作。
10、为 主要碳源的培养基中生长良好， 以大豆油和蔗糖作为碳源使用 60L 发酵罐装料 35kg 发酵 7 天后阿扎霉素 B 含量为 1.2g/kg (M.IKOOV etal, 2004)。 0004 Concanamycins A 在 1981 年分离得到， 因其可以使细胞酸化瓦解而具有多种生物 活性， 如抗病毒、 免疫抑制的活性以及衰减 MDB 肿瘤细胞株的耐受性， 它也是一种治疗骨质 疏松症的潜在药物， 第一次由 Stille 交叉偶联反应全合成制得 (Kazunobu Toshima etal, 2002)。 0005 Bispolides 是由Noriyuki Okujo等在马来西亚土壤。
11、中分离的Microbispora sp. A34030 的培养物中发现， 结构鉴定为一类二十元的双内酯化合物， 具有较好的抗金黄色葡 萄糖球菌的活性 (Noriyuki Okujo, 2007)。 0006 阿扎霉素 F（Azalomycin F） 类， 具有抗 G+ 和广谱抗真菌活性， 同时还对多种农 业病虫害有抑制或杀灭作用。包括 Azalomycins F3a、 F4a、 F5a（Chandra A., Nair A. Azalomycin F complex from Streptomyces hygroscopicus, MSU/MN-4-75BJ. J. Antibiotics.1。
12、995, 48(8):896-898.） ； 2- 位去甲基的 RS-22A、 B、 C（Ubukata M., Morita T.I., Osada H.RS-22A,B and C: new macrolide antibiotics from Streptomyces violaceusniger . Physico-chemical properties and structure elucidationJ. J. Antibiotics.1995, 48(4):293-299.） 2- 位去甲基、 28- 位甲基取代的 Shurimycins A、 B(Kumazawa S., As。
13、ami Y., Awane k.,et al. Structure studies of new macrolide antibiotics, Shurimycins A and BJ. J. Antibiotics.1994, 47(6):688-696.)。 杨佩 文等从马来西亚链霉菌 ECO00002 的次级代谢产物分离得到 Azalomycin F3 和 Azalomycin F4， 经结构鉴定为 36 元环的大环内酯化合物， 其原药的防效与同等剂量的一线化学农药扑 说 明 书 CN 103232964 B 3 2/4 页 4 海因、 三环唑、 茵核净和百菌清对番茄灰霉病、 水稻稻瘟病。
14、、 烟草赤星病及辣椒炭疽病具有 的保护作用相当 ( 杨佩文等， 2009)。 Gan Jun Yuan 等从红树林微生物次级代谢产物化学 筛选中分离并鉴定了一类具有 36 元环的大环内酯化合物 Azalomycins F3a、 F4a 和 F5a， 具 有广谱的抗菌活性， 对人的结肠癌细胞HCT-116具有中度细胞毒活性(Gan Jun Yuan etal, 2010)。Ganjun Yuan 在 2013 年又发表了 7 种具有 36 元环的 Azalomycins F3a、 F4a 和 F5a 的酯类同系物 (Ganjun Yuan etal, 2013)。 发明内容 0007 本发明的首。
15、要目的在于提供一种高产阿扎霉素 F 类化合物菌株。 0008 本发明的另一目的在于提供上述菌株在制备阿扎霉素 F 类化合物中的应用。 0009 本发明的再一目的在于提供利用上述菌株制备阿扎霉素 F 类化合物的方法。 0010 本发明的目的通过下述技术方案实现 ： 0011 一种高产阿扎霉素 F 类化合物菌株链霉菌 TKPJ3039， 该菌株保藏于中国典型培养 物保藏中心 （保藏日期 ： 2013 年 5 月 20 日， 保藏地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学） ， 其分类命名 为链霉菌 TKPJ3039 Streptomyces sp. TKPJ3039， 保藏编号为 CCTCC NO ：。
16、 M2013221。 0012 所 述 的 链 霉 菌 TKPJ3039 通 过 太 空 诱 变 得 到， 具 体 为 ： 将 链 霉 菌 211726 （Streptomyces sp. 211726， 保藏编号为 CCTCC NO ： M209153） 的孢子送往 “神州 8 号” 搭 载， 返回后制备孢子悬液， 分离单菌落， 挑取 214 株菌发酵， 检测阿扎霉素类化合物合成量， 初筛获得 84 株正变株， 再经过复筛和遗传稳定性测试获得。 0013 所述的链霉菌 TKPJ3039 具有如下生物学特征 ： 0014 菌落在 YE 固体培养基 （葡萄糖 4g、 酵母提取物 4g、 麦芽提取。
17、物 10g、 琼脂 20g， 去离 子水 1L， pH7.2-7.4） 上生长呈圆形， 四周光滑， 中间凹下， 白色孢子集中于凸起菌落部分， 背 面呈米黄色。 0015 所述的链霉菌 TKPJ3039 具有如下分子生物学特征 ： 16S rRNA 基因序列如 SEQ ID NO.1 所示。 0016 上述链霉菌 TKPJ3039 在制备阿扎霉素 F 类化合物中的应用。 0017 利用链霉菌 TKPJ3039 制备阿扎霉素 F 类化合物的方法， 包含如下步骤 ： 将链霉菌 TKPJ3039 种子液接种到发酵培养基上进行发酵， 阿扎霉素 F 类化合物存在于发酵液中。 0018 所述的发酵培养基优选。
18、为葡萄糖马铃薯培养基或甘油马铃薯培养基 ； 其中， 葡萄 糖马铃薯培养基的配方包含如下配比的成分 ： 葡萄糖 10g、 酵母提取物 9.23g、 马铃薯淀 粉 26.7g， 去离子水 1L， pH7.2-7.4 ； 甘油马铃薯培养基的配方包含如下配比的成分 ： 甘油 10mL、 马铃薯淀粉 35g、 酵母粉 6g、 去离子水 1L， pH 调至 7.2-7.4。 0019 所述的种子液优选为链霉菌TKPJ3039孢子液接种YE液体培养基 （葡萄糖4g、 酵母 提取物 4g、 麦芽提取物 10g、 去离子水 1L， pH7.2-7.4） 在 28、 220rpm 条件下， 培养 2-3 天 的菌。
19、液。 0020 所述的种子液的量优选为发酵培养基体积的 10%。 0021 所述的发酵的条件优选为 ： 培养温度 25-30， 220-240rpm， 容器装量 1-2/10， 发 酵周期 10-14 天。 0022 所述的利用上述链霉菌 TKPJ3039 制备阿扎霉素 F 类化合物的方法， 还包括阿扎 说 明 书 CN 103232964 B 4 3/4 页 5 霉素 F 类化合物的粗提取步骤， 具体为 ： 量取一定体积发酵液， 等体积加入甲醇， 浸提 12h， 7500rpm10min 离心取上清液， 等体积乙酸乙酯萃取三次， 合并乙酸乙酯， 用旋转蒸发仪蒸 干乙酸乙酯得到阿扎霉素 F 类。
20、化合物的粗提物。 0023 本发明相对于现有技术具有如下优点和效果 ： 0024 本发明利用菌株链霉菌 TKPJ3039， 通过发酵工艺优化， 用摇瓶发酵的方式将阿扎 霉素 F 类化合物的产量由链霉菌 TKPJ3039 在原始培养基发酵的产量 2.73g/L 与野生链霉 菌 211726 在原始培养基发酵产量 1.04g/L 相比， 提高 1.6 倍。链霉菌 TKPJ3039 利用优化 后的葡萄糖马铃薯培养基发酵， 产量为 4.07g/L ； 与链霉菌 TKPJ3039 在原始培养基发酵产 量 2.73g/L 相比， 提高到 1.5 倍。利用链霉菌 TKPJ3039 优化后的甘油马铃薯培养基发。
21、酵产 阿扎霉素 F 类化合物种类更丰富。且葡萄糖马铃薯培养基和甘油马铃薯培养基成分简单， 成本低。 具体实施方式 0025 以下实施例用于进一步说明本发明， 但不应理解为对本发明的限制。若未特别指 明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0026 阿扎霉素 F 类 （Azalomycin F） 化合物的含量检测方法如下 ： 0027 取等体积甲醇浸提离心后的上清液用 0.22m 滤头过滤， 用 WATERS 2998 HPLC， phenomenex C18（250mm4.60mm） 反相色谱柱， 进样20L， 全波长检测， =260nm， 流速1mL/ min， 按梯。
22、度洗脱 （0.00-15.00 水 : 甲醇 =95:5， 15.00-25.00 水 : 甲醇 =70:30， 25.00-30.00 水 : 甲醇 =0:100， 30.00-35.00 水 : 甲醇 =95:5） 洗脱 35min， tmin=20-35min， 用外标法计算 Azalomycin 产量。外标方程为 y=0.1246x+0.0097 （y ： 阿扎霉素浓度 g/L， x ： 峰面积 V s） 。 通过与标准品的保留时间及特征吸收波长判断 Azalomycin F 的种类。 0028 实施例 1 高产阿扎霉素 F 类化合物菌株链霉菌 TKPJ3039 的获得 0029 将链。
23、霉菌 211726（保藏编号为 CCTCC NO ： M209153） 的孢子送往 “神州 8 号” 搭载， 返回后制备孢子悬液， 分离单菌落， 挑取 214 株菌发酵， 检测阿扎霉素类化合物合成量， 初 筛获得84株正变株， 再经过复筛和遗传稳定性测试获得高产阿扎霉素F类化合物菌株链霉 菌 TKPJ3039。 0030 链霉菌 TKPJ3039 已于 2013 年 5 月 20 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地 址 ： 中国武汉、 武汉大学， 其分类命名为链霉菌 TKPJ3039 Streptomyces sp. TKPJ3039， 保 藏编号为 CCTCC NO ： M201322。
24、1。 0031 实施例 2 链霉菌种子液的制备 0032 将链霉菌的孢子悬浮液接种到YE液体培养基中， 在28、 摇床转速220rpm下培养 3 天得到种子液 ； 其中， YE 液体培养基组成 ： 葡萄糖 4g、 酵母提取物 4g、 麦芽提取物 10g、 去 离子水 1L， pH7.2-7.4。 0033 实施例 3 优化后的葡萄糖马铃薯培养基的配制 0034 称取 26.7g 马铃薯淀粉于烧杯中， 加适量去离子水调匀后加入煮沸的去离子水 中， 边加边搅拌， 溶解至澄清， 称取酵母提取物 9.23g、 葡萄糖 10 g， 加入澄清的马铃薯淀粉 溶液中， 加去离子水至 1L， 在 115下灭菌 。
25、30min。 0035 实施例 4 链霉菌 211726 用原始培养基的液体发酵 说 明 书 CN 103232964 B 5 4/4 页 6 0036 按 10%（体积比） 的接种量将种子液接到原始发酵培养基 （葡萄糖 10g、 酵母提取物 2g、 干酪素 4g， 去离子水 1L， pH7.2-7.4） 中， 发酵培养基装液量为 1/5， 接种好的培养基置 于 28、 220rpm 的摇床中， 培养 10 天。等体积甲醇浸提发酵液 12h， 离心取上清液过滤， 经 HPLC 检测阿扎霉素 F 类化合物产量为 1.04g/L， 三个平行样分别检测到的阿扎霉素 F 类化 合物种类个数分别为 7、。
26、 7、 7。 0037 实施例 5 链霉菌 TKPJ3039 在原始发酵培养基中的发酵 0038 按 10%（体积比） 的接种量将种子液接到原始发酵培养基 （葡萄糖 10g、 酵母提取物 2g、 干酪素 4g， 去离子水 1L， pH7.2-7.4） 中， 发酵培养基装液量为 1/5， 接种好的培养基置 于 28、 220rpm 的摇床中， 培养 10 天。等体积甲醇浸提发酵液 12h， 离心取上清液过滤， 经 HPLC 检测阿扎霉素 F 类化合物产量为 2.73g/L。 0039 实施例 6 链霉菌 TKPJ3039 在优化后的葡萄糖马铃薯培养基中的发酵 0040 按 10%（体积比） 的接。
27、种量将种子液接到优化后的葡萄糖马铃薯培养基， 发酵培养 基装液量为 1/10， 接种好的培养基置于 28、 240rpm 的摇床中， 培养 10 天。等体积甲醇浸 提发酵液 12h， 离心取上清液过滤， 经 HPLC 检测阿扎霉素 F 类化合物产量为 4.07g/L。 0041 实施例 7 发酵产物的粗提取 0042 量取 2500mL 发酵液， 阿扎霉素含量 1.09g/L， 按等体积加入甲醇浸提 12h， 7500rpm10min 离心取上清液， 等体积乙酸乙酯萃取三次， 合并乙酸乙酯， 用旋转蒸发仪蒸 干乙酸乙酯， 制得浸膏。取全部浸膏容至 1L 溶液， HPLC 检测含量为 0.22g。
28、/L， 三个平行样分 别检测到 4、 5、 4 种阿扎霉素化合物。 0043 实施例 8 多种类阿扎霉素 F 类化合物在甘油马铃薯培养基上合成 0044 按照前述种子液制备方法准备种子液， 发酵培养基为已经初步优化的甘油马铃薯 培养基， 选为甘油 10mL、 马铃薯淀粉 35g、 酵母粉 6g、 去离子水 1L， pH 调至 7.2-7.4， 弹簧圈 防结球， 接种量 200mL/1L， 25， 220rpm， 发酵 12 天。三次平行发酵液中检测到阿扎霉素含 量为 0.81g/L， 检测到的化合物个数分别为 15、 13、 11。与原始培养基发酵结果， 三次平行检 测到阿扎霉素 F 类化合物。
29、的个数为 7、 7、 7 相比， 甘油马铃薯淀粉培养基发酵产阿扎霉素 F 类化合物种类更丰富。 0045 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103232964 B 6 1/1 页 7 SEQUENCE LISTING 武汉大学 一种高产阿扎霉素 F 类化合物菌株链霉菌 TKPJ3039 及其应用 1 1 PatentIn version 3.5 1 1486 DNA Streptomyce。
30、s sp. 1 gagtttgatc ttggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg 60 atgaaccggt ttcggccggg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggcaatctgc 120 cctgcactct gggacaagcc ctggaaacgg ggtctaatac cggatacgac gcgttcccgc 180 atgggatacg cgtggaaagc tccggcggtg caggatgagc ccgcggccta tcagcttgtt 240 ggtggggtga tg。
31、gcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg cgaccggcca 300 cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca 360 atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg ggttgtaaac 420 ctctttcagc agggaagaag cgcaagtgac ggtacctgca gaagaagcgc cggctaacta 480 cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggc 。
32、gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540 agagctcgta ggcggcttgt cgcgtcggat gtgaaagccc ggggcttaac cccgggtctg 600 cgttcgatac gggcaggcta gagttcggta ggggagatcg gaattcctgg tgtagcggtg 660 aaatgcgcag atatcaggag gaacaccggt ggcgaaggcg gatctctggg ccgatactga 720 cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggta。
33、g tccacgccgt 780 aaacgttggg aactaggtgt gggcgacatt ccacgttgtc cgtgccgcag ctaacgcatt 840 aagttccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt gacgggggcc 900 cgcacaagcg gcggagcatg tggcttaatt cgacgcaacg cgaagaacct taccaaggct 960 tgacatacgc cggaaaaccc tggagacagg gtcccccttg tggtcggtgt acaggtggtg 1020 ca。
34、tggctgtc gtcagctcgt gtcgtaagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080 cttgttctgt gttgccagca tgcctttcgg ggtgatgggg actcacagga gactgccggg 1140 gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat gccccttatg tcttgggctg 1200 cacacgtgct acaatggccg gtacaatgag ctgcgaagcc gtgaggtgga gcgaatctca 1260 aaaagccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagtcgct 1320 agtaatcgca gatcagcatt gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacgccgccc 1380 gtcacgtcac gaaagtcggt aacacccgaa gccggtggcc caacccttgt ggagggagcc 1440 gtcgaaggtg ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtaac 1486 序 列 表 CN 103232964 B 7 。