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1、10申请公布号CN101955933A43申请公布日20110126CN101955933ACN101955933A21申请号201010502030422申请日20101001C12N15/11200601C12N15/10200601C12Q1/6820060171申请人郑琪地址312500浙江省新昌县城关镇江南南路三弄1幢171室申请人孙叶芳赵虎黄岳夫林国梅邢海72发明人郑琪孙叶芳赵虎黄岳夫林国梅邢海74专利代理机构绍兴市越兴专利事务所33220代理人张谦54发明名称一种春兰梅瓣品种的分子特异标记及其获得方法57摘要本发明涉及一种春兰梅瓣品种的分子特异标记及其获得方法，属于生物技术领域。。
2、春兰梅瓣的分子标记DNA片段大小为550KP，特异性PCR扩增引物序列为ACACACACACACACACCTT。方法包括步骤梅瓣春兰资源的收集，基因组DNA的提取；特异PCR扩增引物的获得；ISSRPCR扩增产物的获得；电泳检测。本发明的分子特异标记可应用于梅瓣春兰的快速鉴定。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图1页CN101955933A1/1页21一种春兰梅瓣品种的分子特异标记，其特征在于采用特异性ISSRPCR扩增引物对春兰普通品种与梅瓣基因进行扩增，得到大小为550BP的DNA片段即为所述的分子特异标记。2如权利要求1所述的一种春兰。
3、梅瓣品种的分子特异标记的获得方法，其特征在于包括如下步骤1春兰梅瓣品种的资源收集和基因组DNA的提取；2春兰梅瓣品种的特异PCR扩增引物的获得，采用ISSRPCR技术，经过大量的筛选试验，获得特异PCR扩增引物为ACACACACACACACACCTT；3ISSR分子标记的PCR扩增产物的获得扩增总体积为20UL，10PCRBUFFER含MG220UL，10MMOL/LDNTP04UL，25U/ULTAQDNA聚合酶03UL，10UMOL/L特异PCR扩增引物ACACACACACACACACCTT2UL，基因组DNA1UL，DDH2O143UL；PCR反应条件943MIN；9445SEC，514。
4、5SEC，7290SEC，38个循环；727MIN；4电泳检测取上述PCR扩增产物2UL，与1UL上样缓冲液混匀，点样于1的琼脂糖凝胶上，于1TBE缓冲液中，8V/CM电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相，此时可见550BP大小的特异片段，而其他普通春兰均未见特异性片段。3如权利要求2所述的一种春兰梅瓣品种的分子特异标记的获得方法，其特征在于所述步骤1中，用改良的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20NG/UL，20冰箱贮藏备用。权利要求书CN101955933A1/3页3一种春兰梅瓣品种的分子特异标记及其获得方法技术领域0001本发明涉及一种春兰梅瓣品种的分子特异。
5、标记及其获得方法，属于生物技术领域。背景技术0002二千三百年前就有越王勾践种兰渚山可谓全国最早，三百多年来共选育出春兰品种400多个可谓全国最多，百余年来誉满神州的春兰“四大天王”宋梅、集圆、龙字、万字均出自浙江。浙江自1645年以来，共选育出春兰品种600多个，仅绍兴地区选育和栽培的春兰品种就有430多个；品种之多为全国之最。改革开放后，兰花在绍兴市，特别在绍兴县成了农民发家致富的一条捷径，兰花产业不断发展壮大。目前，仅绍兴县兰花产业从业者达2500多人，兰花种植面积2000多亩，兰花产业年产值达1亿元以上。文人雅士玩赏的小小兰花，如今在浙江绍兴县却成了百万乃至千万富翁的“生产线”。在这个。
6、县有1500多农户长年从事兰花的收集、驯化和培育。目前，至少有20多户农民因种植兰花而资产逾千万元。0003近几年来，随着我省经济的长足发展，人民生活水平的不断提高，兰花交流营运也得到不断升温。如绍兴地区养兰户每年以15以上的速度递增。目前我省已基本形成一个普遍养兰的氛围。从2000年至2006年我省兰花交易形势上看，兰花产业正成为我省人民致富的一条捷径，正成为我省可持续发展的特色优势产业。同时我省兰花产业也面临着诸多被动因素，严重影响着该产业的健康发展。0004兰花是大自然赋予我们的宝贵自然资源，也是我省宝贵的自然资源和经济资源，近年来，由于兰花价格的持续上升，一些地区对野生兰花的采挖比较混。
7、乱。目前江浙两省每年的下山兰草很少，野生兰花资源已遭很大程度的破坏，许多山区已经到了乱挖、滥采的地步，目前已无下山草可挖，所以兰展上已很难找到一些带有香味的浙江下山春兰。我国为避免此类现象的发生，除利用法律、法规措施禁止人为破坏和掠夺兰花野生资源，更重要的是利用现有的兰花资源，加强新品种的培育和栽培管理技术的研究，利用现有的种质资源以兰养兰、以兰扩兰，既有效地保护兰花自然资源，又满足养兰爱好者的需要。发明内容0005本发明的目的是为了能对春兰梅瓣品种进行简便、快速、准确的鉴定和检测，提供了一种春兰梅瓣品种的分子特异标记及其获得方法。0006为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为0007一种。
8、春兰梅瓣品种的分子特异标记，采用特异性ISSRPCR扩增引物对春兰普通品种与梅瓣基因进行扩增，得到大小为550BP的DNA片段即为所述的分子特异标记。0008一种春兰梅瓣品种的分子特异标记的获得方法，包括如下步骤00091春兰梅瓣品种的资源收集和基因组DNA的提取；00102春兰梅瓣品种的特异PCR扩增引物的获得，采用ISSRPCR技术，经过大量的筛选试验，获得特异PCR扩增引物为ACACACACACACACACCTT；说明书CN101955933A2/3页400113ISSR分子标记的PCR扩增产物的获得扩增总体积为20UL，10PCRBUFFER含MG220UL，10MMOL/LDNTP三。
9、磷酸脱氧核糖核苷04UL，25U/ULTAQDNA聚合酶03UL，10UMOL/L特异PCR扩增引物ACACACACACACACACCTT2UL，基因组DNA1UL，DDH2O重蒸水143UL；PCR反应条件943MIN；9445SEC，5145SEC，7290SEC，38个循环；727MIN；00124电泳检测取上述PCR扩增产物2UL，与1UL上样缓冲液6LOADINGBUFFER混匀，点样于1的琼脂糖凝胶上，于1TBE缓冲液中，8V/CM电压下电泳，电泳结束后，用EB溴化乙锭染色，然后在凝胶成像仪上照相，此时可见550BP大小的特异片段，而其他普通春兰均未见特异性片段。0013所述步骤1。
10、中，用改良的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20NG/UL，20冰箱贮藏备用。0014根据采用这一个特殊引物进行PCR扩增，以能否产生550BPDNA片段作为对梅瓣春兰进行鉴定和检测的依据。0015该检测方法与传统的辨别梅瓣春兰的方法相比，具有更强的操作性，传统的方法须等开花之后通过花瓣的花型特征来判定，而该检测方法在春兰幼苗时通过嫩叶即可进行检测，检测时间短，准确性高。0016以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。附图说明0017图1为梅瓣春兰专用检测引物对春兰进行ISSRPCR扩增结果。图中梅瓣春兰天兴，万字，瑞梅，宋梅，冠姚和贺梅均能扩增出分子量约为550BP的特殊DN。
11、A条带，而普通春兰普1，普2和普3则没有。具体实施方式0018下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不受以下实施例所限定。0019实施例100201春兰梅瓣品种的资源收集和基因组DNA的提取；其中，基因组DNA的提取具体为用改良的CTAB法提取基因组DNA，DNA稀释至20NG/UL，20冰箱贮藏备用。00212春兰梅瓣品种的特异PCR扩增引物的获得，采用ISSRPCR技术，经过大量的筛选试验，获得特异PCR扩增引物为ACACACACACACACACCTT。00223ISSR分子标记的PCR扩增产物的获得扩增总体积为20UL，10PCRBUFFER含MG220UL，10MMOL/L。
12、DNTP04UL，25U/ULTAQDNA聚合酶03UL，10UMOL/L特异PCR扩增引物ACACACACACACACACCTT2UL，基因组DNA1UL，DDH2O143UL；PCR反应条件943MIN；9445SEC，5145SEC，7290SEC，38个循环727MIN。00234电泳检测取上述PCR扩增产物2UL，与1UL上样缓冲液混匀，点样于1的琼脂糖凝胶上，于1TBE缓冲液中，8V/CM电压下电泳，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相，此时可见550BP大小的特异片段，而其他普通春兰均未见特异性片段。00245对9个春兰品种进行ISSR扩增，其中3个普通品种，6个梅瓣品种。6个梅瓣说明书CN101955933A3/3页5品种均能扩增出专一的ISSR标记。0025上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。说明书CN101955933A1/1页6图1说明书附图。