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利用DnaJ基因的细菌检测及其应用
技术领域
本发明涉及利用DnaJ基因的细菌检测及其利用，详细来讲，涉及利用DnaJ基因来检测细菌的方法，及该方法中使用的核酸分子，以及该方法和该核酸分子在诊断和鉴定中的应用。
背景技术
一直以来，病原细菌等各种细菌的检测和鉴定需要使用特殊的试剂及熟练的技术，并使用特殊的试剂及熟练的技术进行靶细菌的培养。病原菌的生长伴随有一定程度的危险，除此以外，设想具有多种可能性的病原菌时，需要在各种不同条件下进行培养。并且，为了鉴定细菌菌种，还需要详细地调查例如生化特性。因此，细菌的检测和鉴定，特别是病原细菌的检测和鉴定不仅具有某些危险性，而且需要花费很多的精力和时间。
另一方面，作为细菌的分类和鉴定的方法，已经开始使用16SrDNA的碱基序列。如果利用这样基因的碱基序列，则可以期待在较短的时间内检测和鉴定出细菌及细菌菌种。
但是，在16S rDNA的碱基序列积累的同时，当16S rDNA的碱基序列在独立且近缘的细菌菌种间有至少98％的相似性时，往往不能识别菌种(非专利文献1)。因此，如果不实施更复杂的测定全染色体基因的相似性水平的方法，则不能实现菌种的确定(非专利文献2)。为此，需要变异水平更高的序列的数据积累，GyrB或ropB等基因的碱基序列数据的累积正在进行(非专利文献3、4和5)。
一种这样的管家基因为热休克蛋白DnaJ。据报道，编码DnaJ的DnaJ基因可以用于对分枝杆菌属(Mycobacterium)菌的菌种进行分类(非专利文献6)。另外，据报道，在鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)的血清型中DnaJ基因多态性普遍(非专利文献7)并且虽然仅仅是有200碱基的短序列，但在血清型之间DnaJ基因非常保守，相同属的菌种水平中序列的差别大(非专利文献8)。另外，还据报道，在军团菌(Legionella)属中，DnaJ基因在嗜肺军团菌(L.pneumophila)的血清型之间保守，但在菌种水平多态性水平较高(非专利文献9)。
另一方面，在预防或治疗感染疾病，强烈地要求迅速且可靠地检测和鉴定从食品或动物中采集的样品中的病原微生物。为鉴定病原微生物，使用分别与多种病原微生物中的一种的特征性靶核酸相对应的多种引物对，实施PCR的多重PCR法是有用的。在多重PCR中，在一个管内使用多种引物来使靶核酸扩增。对于这样的多重PCR法，目前正在进行各种研讨(专利文献1～4)。多重PCR在治疗感染中鉴定病毒和细菌等病原微生物是很有用的。为了鉴定病原微生物，需要靶向病原微生物的基因组中的特异性序列。
非专利文献1：Fox、G.E.et al.1992.Int.J.Syst.Bacteriol.42：166-170
非专利文献2：Ezaki、T.et al.1989.Int.J.Syst.Bacteriol.Amano、M.et al.2005.Microbiol.Immunol.49：255-263
非专利文献3：Yamamoto、S.and S.Harayama.1995.Appl.Environ.Microbiol.61：1104-1109.、
非专利文献4：Yamamoto、S.and S.Harayama.1996.Int.J.Syst.Bacteriol.46：506-511
非专利文献5：Cheunoy、W.et al.2005.Diagn.Microbiol.Infect.Dis.51：165-171
非专利文献6：Takewaki、S.et al.1994.Int.J.Syst.Bacteriol.44：159-166
非专利文献7：Victor、TC.et al.1996.J.Med.Microbiol.44：332-339
非专利文献8：Morita、Y.et al.2004.J.Med.Microbiol.53：813-817
非专利文献9：Liu、H.et al.2003.Microbiol.Immunol.47：859-869
发明内容
通常，某一基因中的碱基序列相对于其它属的相关微生物有特异性，而且在同一属内的菌种水平中也有特异性，并且碱基序列在菌种内的菌株水平中在一定程度上保守，才可以仅使用此基因检测或鉴定特定的菌种。即，确定特定的基因是否可以用于检测和鉴定特定的微生物菌种，需要对包含在特定菌种中的多个菌株的该特定基因进行广泛的测序。
但是，对于DnaJ基因，仅仅是对于特定的菌种，并在血清型水平进行了测序，还未公开对这些菌种内的菌株水平的序列信息。DnaJ基因还没有进行如上所述的广泛的基因分析。因此，目前为止，还不清楚DnaJ基因是否具有可以单独用于检测或鉴定菌种的特定的碱基序列。并且，由于菌株之间的多态性的存在，要发现菌种之间保守的序列，需要对大量菌株进行测序。
另外，在鉴定细菌等病原微生物时，如果以与分别使用多种引物时相同的浓度(约0.2μM～0.8μM)使用多种(2～10种)引物，则产生引物间的相互竞争、扩增效率降低、扩增产物量减少，从而导致不能检测到扩增产物。另外，如果降低引物浓度，则扩增效率降低，这时，也同样不能检测扩增产物。因此，可以一次性组合的实用的引物的种类基本上为6种左右。
另外，为了利用多种引物来实施多重PCR，引物的特异性是很重要的。在对应于多种病原微生物的多重PCR中，需要靶向菌种特异的序列。但是，对于多种病原微生物，设计可以同时使用且扩增菌种特异的靶的引物是非常难的。
本发明的目的之一在于，提供能够容易地检测或鉴定细菌菌种的方法，及用于其中的核酸分子。另外，本发明的其它目的在于，提供高灵敏度地检测或鉴定细菌菌种的方法，及用于其中的核酸分子。另外，本发明的其它目的还在于，提供用于检测或鉴定2种以上细菌菌种的方法，及用于其中的核酸分子。另外，本发明的目的之一在于，提供适于迅速检测细菌等微生物的利用多重PCR的微生物的扩增方法，及用于其的试剂盒等。
本发明人对680个菌种和1250菌株进行了DnaJ基因的测序，通过比较其结果，发现，16S rDNA基因的菌种间的序列相似性为95％以上，DnaJ基因在基本上所有属中菌种间的相似性为75～90％，并且，从同一菌种内的菌株水平的序列信息出发，发明人发现可以提取出仅从DnaJ基因就能够对菌种进行鉴定的特异的碱基序列，基于上述发现完成了本发明。即，根据本发明，提供了以下方法。
根据本发明，提供一种检测细菌的菌种的方法，其中，对选自葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、军团菌属(Legionella)、弧菌属(Vibrio)、芽孢杆菌属(Bacillus)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、支原体属(Mycoplasma)、利斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌(Salmonella)及耶尔森氏菌属(Yersinia)的1种或2种以上的细菌菌种作为检测对象，该方法包括一下步骤：
(a)使可能含有检测对象细菌菌种的核酸的试验样品和与检测对象细菌菌种的DnaJ基因的至少一部分杂交的核酸分子接触的步骤、
(b)检测所述核酸分子和所述试验样品中的核酸是否杂交的步骤。
在本发明中，所述(a)步骤优选为使所述核酸样品和与2种以上菌种的DnaJ基因各自的至少一部分杂交的2种以上的所述核酸分子同时接触的步骤。另外，所述核酸分子可以包含通过将属于同一菌种的菌株的DnaJ基因的碱基序列比对提取出来的1种或多种菌种特异的碱基序列，或可以包含基本上与该碱基序列相同的1种或多种碱基序列。并且，所述作为检测对象的细菌可以为选自化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、Mycoplasma genitarium、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoae)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)及空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)中的1或多种菌种。在检测相应特定的细菌菌种时，可以使用特定的核酸分子。
所述检测对象细菌可以是选自链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、军团菌属(Legionella)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)和支原体属(Mycoplasma)的1种或多种菌种。这些细菌是肺炎和/或咽炎的病原微生物。所述细菌可以是选自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)及肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)中的任一菌种，这时，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO：1～42、SEQ ID NO：131～134及SEQ ID NO：89～116中的1种或多种碱基序列或与其基本上同一1种或多种碱基序列。
或者，所述细菌可以是选自弧菌属(Vibrio)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、利斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌(Salmonella)及耶尔森氏菌属(Yersinia)的1种或2种以上菌种。这些菌是腹泻和/或食物中毒的病原菌。所述细菌可以为选自霍乱弧菌(Vibriocholerae)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、河流弧菌(Vibriofluvialis)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)及大肠杆菌(Escherichia coli)中的任一菌种，在这种情况下所述核酸分子可以包含SEQ ID NO：43～70、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：87～88、SEQ ID NO：97～98、SEQ ID NO：101～102及SEQ ID NO：117～130中的1种或多种碱基序列或与其基本上相同的1种或多种碱基序列。所述细菌为单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)时，所述核酸分子可以包含选自SEQ ID NO：135～136或SEQ ID NO：137～138的碱基序列或与其基本上相同的碱基序列，所述细菌为肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)时，所述核酸分子可以包含选自SEQ ID NO：139～140的碱基序列或与其基本上相同的碱基序列，所述细菌为小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)时，所述核酸分子可以包含SEQ ID NO：143～144的碱基序列或与其基本上相同的碱基序列。
另外，所述细菌可以为选自奈瑟氏球菌属(Neisseria)、衣原体属(Chlamydia)及支原体属(Mycoplasma)中的1或多个种。这些细菌是性病的病原菌。所述细菌为淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)或Mycoplasma genitarium时，所述核酸分子可以包含选自SEQ ID NO：71～86、SEQ ID NO：105～106及SEQ ID NO：109～114中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的碱基序列。
根据本发明，还提供了一种鉴定细菌菌种的方法，其中，以选自链球菌属(Streptococcus)菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、肠球菌属(Enterococcus)菌、消化链球菌属(PeptoStreptococcus)菌、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、肠杆菌属(Enterobacter)菌、军团菌属(Legionella)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌、螺杆菌属(Helicobacter)菌、棒杆菌属(Corynebacterium)菌、假单胞菌属(Pseudomonas)菌、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)菌、嗜血菌属(Haemophilus)菌、拟杆菌属(Bacteroides)菌、肠球菌属(Enterococcus)菌、诺卡尔菌属(Nocardia)菌、普氏菌属(Prevotella)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)菌、黄杆菌属(Flavobacterium)属菌、梭菌属(Clostridium)菌、密螺旋体属(Treponema)菌、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)菌、钩端螺旋体属(Leptospira)菌、弯曲杆菌属(Campylobacter)菌、利斯特氏菌属(Listeria)菌、沙门氏菌(Salmonella)菌及耶尔森氏菌属(Yersinia)菌中的1种或2种以上细菌菌种做为鉴定对象的对象细菌，该方法包括以下步骤：
(a)获得可能含有对象细菌的核酸的试验样品中的DnaJ基因的至少一部分碱基序列。
该鉴定方法优选包括(b)步骤，即将从所述试验样品中获得的DnaJ基因的至少一部分碱基序列和待鉴定细菌的DnaJ基因的碱基序列对比，鉴定所述试验样品中的细菌的菌种的步骤。
根据本发明，还提供了一种细菌鉴定程序用于鉴定细菌，其中，以选自链球菌属(Streptococcus)菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、肠球菌属(Enterococcus)菌、消化链球菌属(PeptoStreptococcus)菌、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、肠杆菌属(Enterobacter)菌、军团菌属(Legionella)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌、螺杆菌属(Helicobacter)菌、棒杆菌属(Corynebacterium)菌、假单胞菌属(Pseudomonas)菌、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)菌、嗜血菌属(Haemophilus)菌、拟杆菌属(Bacteroides)菌、肠球菌属(Enterococcus)菌、诺卡尔菌属(Nocardia)菌、普氏菌属(Prevotella)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)菌、黄杆菌属(Flavobacterium)属菌、梭菌属(Clostridium)菌、密螺旋体属(Treponema)菌、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)菌、钩端螺旋体属(Leptospira)菌及弯曲杆菌属(Campylobacter)菌中的1种或2种以上细菌菌种作为鉴定对象的细菌菌种，该程序在1或2台以上计算机上执行以下步骤，即将从可能含有待鉴定细菌的核酸的试验样品中得到的DnaJ基因的至少一部分碱基序列和待鉴定细菌的DnaJ基因的碱基序列对比，鉴定所述试验样品中的细菌的菌种的步骤。
根据本发明，还提供了一种用于检测和鉴定细菌的核酸分子，其中，以选自链球菌属(Streptococcus)菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、肠球菌属(Enterococcus)菌、消化链球菌属(PeptoStreptococcus)菌、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、肠杆菌属(Enterobacter)菌、军团菌属(Legionella)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌、螺杆菌属(Helicobacter)菌、棒杆菌属(Corynebacterium)菌、假单胞菌属(Pseudomonas)菌、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)菌、嗜血菌属(Haemophilus)菌、拟杆菌属(Bacteroides)菌、肠球菌属(Enterococcus)菌、诺卡尔菌属(Nocardia)菌、普氏菌属(Prevotella)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)菌、黄杆菌属(Flavobacterium)菌、梭菌属(Clostridium)菌、密螺旋体属(Treponema)菌、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)菌、钩端螺旋体属(Leptospira)菌、弯曲杆菌属(Campylobacter)菌、利斯特氏菌属(Listeria)菌、沙门氏菌(Salmonella)菌及耶尔森氏菌属(Yersinia)菌中的1种或2种以上的细菌菌种为检测和鉴定的对象，并且所述核酸分子与待鉴定细菌的DnaJ基因的至少一部分杂交。所述核酸分子可以为基因扩增用引物，也可以为探针。另外，选自以上的核酸分子的1种或2种以上可以为该核酸分子固定化于固相中的固化体的形态，也可以为包含选自这些核酸分子中的1种或2种以上核酸分子的细菌鉴定和检测试剂盒的形态。
另外，本发明人还发现，通过将引物的功能分为2个，可以迅速且高灵敏度地检测微生物。即，本发明人发现，通过将第1引物组和第2引物组组合，即使在使针对多种靶的多个引物组同时作用的情况下，也可以充分的灵敏度检测靶序列，其中，第1引物组具有特异性退火到靶核酸的序列和不退火到靶核酸的标记序列，第2引物组具有与第1引物组的标记序列基本上相同的标记序列。另外，本发明人还发现，为了产生可以检测多种微生物的引物混合物(以下也称为混合引物(Cocktail primer)，通过靶向各微生物种的DnaJ基因，可以容易地设计菌种特异性引物、从而可以基本上单一的PCR反应循环扩增效率良好地扩增靶并能灵敏度良好地进行检测，由此最终完成本发明。根据本发明，还提供了以下方法。
另外，根据本发明，提供了扩增至少一种靶核酸的方法，其中，包括以下步骤，即，使用具有标记序列和对所述靶核酸有特异性的碱基序列的第1引物组、和至少1种具有与所述第1引物组的标记序列基本上相同的标记序列的第2引物组，实施聚合酶链反应的步骤。
所述聚合酶链反应步骤可以为实施利用所述第1引物组扩增所述靶核酸和利用所述第2引物组扩增利用所述第1引物组进行扩增而得到的扩增产物的步骤。并且，所述聚合酶链反应步骤可以为实施基本上单一的PCR反应循环的步骤。
所述聚合酶链反应步骤可以为实施单一的PCR反应循环的步骤，其中，所述第1引物组的引物浓度为0.005μM以上0.1μM以下，所述第2引物组的引物浓度为所述第1引物组的引物浓度的10倍以上50倍以下，利用所述第2引物组进行扩增而得到的的扩增产物为250碱基以下的核酸。
根据本发明，还提供了一种基于多重PCR诊断病原微生物的方法，所述病原微生物为选自葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、链球菌属(Streptococcus)菌、沙雷菌属(Serratia)菌、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、分枝杆菌属(Mycobacterium)菌、军团菌属(Legionella)菌、弧菌属(Vibrio)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、弯曲杆菌属(Campylobacter)菌、衣原体属(Chlamydia)菌、嗜衣原体属(Chlamydophila)菌、支原体属(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌属(Listeria)菌、沙门氏菌(Salmonella)菌及耶尔森氏菌属(Yersinia)菌中的1种或2种以上菌种，该方法包括使用至少一种第1引物组和至少一种第2引物组，对可能含有来自所述病原微生物的核酸的试验样品实施聚合酶链反应的步骤、和检测含有所述靶核酸的扩增产物的步骤，所述第1引物组具有标记序列和选择性退火到所述病原微生物所具有的靶核酸(优选在DnaJ基因上)的碱基序列，所述第2引物组具有与所述第1引物组的标记序列基本上相同的标记序列。在该方法中，所述聚合酶链反应步骤优选为实施单一的PCR反应循环的步骤。
根据本发明，还提供了一种试剂盒，其为包含用于通过多重PCR扩增至少1种微生物的靶核酸的引物组的试剂盒，其中，所述试剂盒包含第1引物组和第2引物组，所述第1引物组具有标记序列和选择性退火到所述病原微生物所具有的靶核酸(优选在DnaJ基因上)的碱基序列，所述第2引物组具有与所述第1引物组的标记序列基本上相同的标记序列。
附图说明
图1A是比较16S rDNA序列的图。两细菌菌种间，只有12碱基(1.2％)有差别。
图1B是显示DnaJ序列的多态性的图。两细菌菌种间，183碱基(20.6％)有差别。
图2是显示金黄色葡萄球菌(S.aureus)的DnaJ引物序列的图。
图3是显示利用单独的引物(引物溶液B)及多重引物(引物溶液A)进行扩增的结果的图。
图4是通过监测CYBR绿色荧光强度增强显示在Light Cycler(罗氏公司)毛细管中扩增的DNA获得的结果的图。
图5是显示用琼脂电泳确认PCR扩增产物的结果的图。
图6是用电泳法比较利用基因扩增获得的检测灵敏度的图。
图7是通过监测CYBR绿色荧光强度增强，显示在Light Cycler(罗氏公司)的毛细管中扩增的DNA的结果的图。
图8显示了DnaJ基因测序的分枝杆菌属(Mycobacterium)的55菌种和3个亚种的标准株。
图9是比较DnaJ基因和RpoB基因的序列的图。
图10是比较各种基因的碱基序列的图。
图11是比较16S rDNA基因的碱基序列及DnaJ基因的碱基序列的相似性的图。
图12显示了利用DnaJ基因对各种菌株进行鉴定的结果和利用生化特性对各种菌株进行鉴定的结果。
图13显示了基于DnaJ基因的碱基序列对统称为鸟分枝杆菌-细胞内分枝杆菌(M.avium-M.intracellulare)组(MAC组)的16株临床分离株(图中的KPM株)进行鉴定的结果。
图14是显示本发明的扩增方法中使用的第1引物组和第2引物组和靶核酸之间的关系的图。
图15显示了设计用于嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)GTC1279DNA作为靶核酸的引物序列。
图16是显示实施例8中实施的PCR步骤中的扩增监测结果的图。
图17是显示实施例9中实施的PCR步骤中的扩增监测结果的图。
图18显示了用于检测腹泻的细菌性病原体的引物序列。
图19显示了用于检测腹泻的病毒性病原体的引物序列。
图20显示了实施例10中固定化在硅基体上的探针序列。
图21显示了将实施例10中的PCR产物与硅基体的探针杂交时的荧光。
图22显示了用于检测STD病原微生物的引物序列。
图23显示了用于检测实施例11中的PCR产物中的扩增产物的探针序列。
图24显示了实施例11中获得的杂交产物的荧光强度。
图25显示了构成实施例12中制备的4种混合引物的引物。
图26显示了作为在实施例12中进行PCR的结果的CTm值。
具体实施方式
本发明公开的检测方法，通过使所述试验样品和与待检测的菌种的DnaJ基因的至少一部分杂交的核酸分子接触，检测是否存在杂交，由此能够检测特定的微生物菌种。DnaJ基因虽然在微生物菌种间相似性较低，但是在同一菌种的菌株间在一定水平或者一定水平以上保守。因此，可以容易地提取出菌种特异的碱基序列，并且通过使用该碱基序列而容易地检测特定的菌种。特别是由于菌种间的相似性低，因此，即使为在近缘种之间，也可以灵敏度良好地检测特定菌种。并且，由于菌种间相似性较低，因此，可以设计特异的引物等。其结果，即使使用多个引物组的混合物，也可以检测特定的菌种。因此，可以用含有多种引物组的1种引物混合物检测多个菌种。这里，因为DnaJ基因是维持生命不可或缺的管家基因且所有微生物株均具有DnaJ基因，所以DnaJ基因对微生物菌种的检测和鉴定是有利的。
另外，本发明的鉴定方法，鉴于DnaJ基因在细菌菌种间的相似性低，因此，通过例如测定待鉴定细菌中的DnaJ基因的碱基序列或与指定的探针杂交对DnaJ基因进行分析，然后通过与既有的近缘菌种的DnaJ基因的碱基序列的分析结果进行比较，可以检测待鉴定的微生物菌种。
以下对本发明的实施方式，针对例如本发明的细菌检测方法及鉴定方法以及这些方法中使用的核酸分子等进行详细描述。
(细菌的检测方法)
(待检测的细菌)
本发明的细菌检测方法靶向选自葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、链球菌属(Streptococcus)菌、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、分枝杆菌属(Mycobacterium)菌、军团菌属(Legionella)菌、弧菌属(Vibrio)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、弯曲杆菌属(Campylobacter)菌、衣原体属(Chlamydia)菌、嗜衣原体属(Chlamydophila)菌、支原体属(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌属(Listeria)菌、沙门氏菌(Salmonella)菌及耶尔森氏菌属(Yersinia)菌中的1种或2种以上的细菌菌菌种为检测对象种以上的细菌菌菌种的检测。在属于这些属的细菌菌种中，由于DnaJ基因的碱基序列的相似性比16S rDNA基因的碱基序列的相似性低，容易发现在同一菌种内的菌株之间保守的菌种特异性碱基序列，因此使得DnaJ基因适于使用DnaJ基因来适用于检测细菌菌种。例如，对于DnaJ基因，在葡萄球菌属(Staphylococcus)菌中，16S rDNA基因在菌种间的碱基序列相似性平均为97.4％、DnaJ基因在菌种间的碱基序列相似性平均为77.6％，在链球菌属(Streptococcus)菌中，16S rDNA基因在菌种间的碱基序列相似性平均为95.8％、DnaJ基因在菌种间的碱基序列相似性平均为76.4％，在分枝杆菌属(Mycobacterium)菌中，16S rDNA基因在菌种间的碱基序列相似性平均为93％、DnaJ基因在菌种间的碱基序列相似性平均为83.7％，在军团菌属(Legionella)菌中，16S rDNA基因在菌种间的相似性平均为96.1％、DnaJ基因在菌种间的碱基序列相似性平均为82.5％。对于弧菌属(Vibrio)菌，16S rDNA基因在菌种间的碱基序列相似性平均为97.4％、DnaJ基因在菌种间的碱基序列相似性平均为82％，对于气单胞菌属(Aeromonas)菌，16S rDNA基因在菌种间的碱基序列相似性平均为98.8％、DnaJ基因在菌种间的碱基序列相似性平均为89.8％，对于肠杆菌科(Family Enterobacteriaceae)菌，16S rDNA基因在菌种间的碱基序列相似性平均为97.1％、DnaJ基因在菌种间的碱基序列相似性平均为87.6％。
其中，待检测的菌种优选为克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、弧菌属(Vibrio)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、弯曲杆菌属(Campylobacter)菌、衣原体属(Chlamydia)菌、嗜衣原体属(Chlamydophila)菌、支原体属(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌属(Listeria)菌、沙门氏菌(Salmonella)菌及耶尔森氏菌属(Yersinia)菌的菌种。这是因为，利用基因工程技术难以检测和鉴定这些属的细菌菌种，但是利用DnaJ基因，可以通过基因工程学的方法进行检测和鉴定。
甚至在16S rDNA基因相似性较高的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)内，在单个属中的菌种间检测到差别时，克雷白氏杆菌属(Klebsiella)的4个菌种中，16S rDNA基因只存在1.4％的差别，DnaJ基因存在7.8％的差别。在沙雷菌属(Serratia)中，16S rDNA基因存在2.3％的差别，而DnaJ基因存在5.5％的差别。在沙门氏菌属(Salmonella)中，16S rDNA基因存在1.4％的差别，而DnaJ基因存在6.3％的差别，显示较高的多态性。由此，通过使用DnaJ基因，则可以更适当地检测细菌和鉴定菌种。
在本发明的检测方法中，通过使用分别检测多种微生物菌种的核酸分子的混合物，还可以靶向2种以上用于检测的菌种。这是因为，由于DnaJ基因的碱基序列在属间及微生物菌种间的相似性低，在菌株间具有相似性水平较高的序列位点，因此，可以设计互不干涉地杂交DnaJ基因的核酸分子。
(试验样品)
本发明的检测方法可以包括以下步骤：(a)使可能含有待检测细菌的核酸的试验样品、和与作为检测对象的细菌菌种的DnaJ基因至少一部分杂交的核酸分子接触。这里，试验样品可能含有待检测细菌菌种的核酸即可，没有特别限定。试验样品的示例性实例包括：血液、血清、从包含人在内的动物中收集的细胞或组织、粪便和尿等排泄物、痰、井水、食品等。试验样品可以为通过从这样收集的材料中提取核酸而得到的核酸提取样品，或者可以为包含DnaJ基因或其一部分(包含待检测的区域)的扩增产物的样品。
(核酸分子)
可以用于本发明方法的核酸分子，可以包含通过将属于同一菌种的菌株的DnaJ基因的碱基序列进行比对提取出来的1种或2种以上的细菌菌种特异性碱基序列。这样的核酸分子是菌种特异的，并且能够使得属于同一细菌菌种的菌株被可靠地检测出来。为了这样的比对及特征性序列的提取，可以利用诸如DNASIS pro版本(日立软件)、Beacon designer 5.1版本(Molecular Beacon公司)及Clustal W(自由软件)等软件。
核酸分子可以包含1个提取得到的菌种特异性碱基序列，也可以包含2个以上。或者，核酸分子可以包含与如上操作提取得到的菌种特异性碱基序列基本上相同的碱基序列。这里，所谓基本相同的序列，可列举出：基于上述碱基序列并在能够保持与DnaJ基因的杂交特异性的范围内进行修饰的碱基序列。示例性的实例包括上述碱基序列，与之互补的碱基序列，在上述碱基序列中1或2个以上的碱基以选自置换、插入、缺失及添加中的1种或2种以上的方式进行修饰而得到的碱基序列。另外，这样的修饰也可以对应于特定菌株的DnaJ基因的碱基序列的碱基序列来进行。
核酸分子具体而言是具有这样的特异性碱基序列或包含这样的碱基序列的引物和探针。核酸分子只要可以进行基于碱基序列的杂交就没有特别限定。核酸分子虽然典型情况下为DNA，也可以采用DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、含有修饰碱基的人工核酸、或肽核酸(PNA)。这样的核酸分子还可以用多种荧光色素，荧光色素淬灭剂等进行修饰。
下面给出了各细菌菌种的优选核酸分子的实例。细菌为化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ IDNO：1～4(引物)及SEQ ID NO：89～90(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。所述细菌菌种为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：5～8(引物)及SEQ ID NO：91～92(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：9～12(引物)及SEQ ID NO：93～94(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：13～16(引物)及SEQ ID NO：97～98(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：17～20(引物)及SEQ ID NO：109～110(引物)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的碱基序列的1种或2种以上核酸分子。细菌为大肠杆菌(Escherichia coli)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：21～24(引物)及SEQ ID NO：101～102(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：25～28(引物)及SEQ ID NO：103～104(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为分枝杆菌(Mycobacterium spp.)(其中，除结核分枝杆菌(M.tuberculosis)组以外)，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：29～30(引物)及SEQ ID NO：131～133(引物)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：35～38(引物)及SEQ ID NO：115～116(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为霍乱弧菌(Vibrio cholerae)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：43～46(引物)及SEQ ID NO：127～128(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为拟态弧菌(Vibrio mimicus)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：47～49(引物)及SEQ ID NO：125～126(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：50～52(引物)及SEQ ID NO：123～124(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为创伤弧菌(Vibrio vulnificus)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53～55(引物)及SEQ ID NO：119～120(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为河流弧菌(Vibrio fluvialis)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：56～57(引物)及SEQ ID NO：117～118(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQID NO：43、SEQ ID NO：58～60(引物)及SEQ ID NO：121～122(引物)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：61～66(引物)及SEQ ID NO：87～88(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：67～70(引物)及SEQ ID NO：129～130(引物)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：83～86(引物)及SEQ ID NO：111～112(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：79～82(引物)及SEQ ID NO：113～114(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：75～78(引物)及SEQ ID NO：109～110(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：39～42(引物)及SEQ ID NO：107～108(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为Mycoplasma genitarium时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：71～74(引物)及SEQ ID NO：105～106(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。细菌为肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：31～34(引物)及SEQ ID NO：95～96(探针)中的1种或2种以上碱基序列或与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。
在检测肺炎或咽炎的病原菌时，待检测生物体可以为来自链球菌属(Streptococcus)菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、分枝杆菌属(Mycobacterium)菌、军团菌属(Legionella)菌、衣原体属(Chlamydia)菌、嗜衣原体属(Chlamydophila)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌及支原体属(Mycoplasma)菌中的1种或2种以上细菌。这时，细菌选自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)及肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ IDNO：1～42、SEQ ID NO：131～133及SEQ ID NO：89～116(探针)中的1种或2种以上碱基序列或含有与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。其中，优选将对应于2种以上或3种以上细菌菌种的各DnaJ基因的引物组组合。
另外，在检测腹泻或食物中毒的病原菌时，待检测生物体可以是来自弧菌属(Vibrio)菌、弯曲杆菌属(Campylobacter)菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、利斯特氏菌属(Listeria)菌、沙门氏菌属(Salmonella)菌及耶尔森氏菌属(Yersinia)菌中的1种或2种以上细菌。这时，细菌为选自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、河流弧菌(Vibriofluvialis)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)及大肠杆菌(Escherichia coli)中的一种时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：43～70、SEQ IDNO：134、SEQ ID NO：87～88、SEQ ID NO：97～98、SEQ ID NO：101～102及SEQ ID NO：117～130中的1种或2种以上碱基序列或含有与其基本上相同的1种或2种以上碱基序列的核酸分子。另外，细菌为单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)时，示例性核酸分子可以包括含有SEQ ID NO：135和136或SEQ ID NO：137和138中碱基序列或含有与其基本上相同的碱基序列的核酸分子，所述细菌为肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)时，示例性核酸分子包括含有SEQ ID NO：139和140中碱基序列或含有与其基本上相同的碱基序列的核酸分子，所述细菌为小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)时，示例性核酸分子包括含有SEQ ID NO：143和144中碱基序列或含有与其基本上相同的碱基序列的核酸分子。其中，优选将对应于2种或3种或以上细菌菌种的各DnaJ基因的引物组组合。
在检测性病的病原菌时，待检测的生物体可以是来自奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、衣原体属(Chlamydia)菌或者支原体属(Mycoplasma)菌中的1种或2种以上细菌。在这种情况下，所述细菌为淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)及Mycoplasma genitarium时，示例性核酸分子包括含有选自SEQ ID NO：71～86、SEQ ID NO：105～106及SEQ ID NO：109～114中的1种或2种以上碱基序列或含有与其基本上相同的碱基序列的核酸分子。其中，优选将对应于2种或3种以上细菌菌种的各DnaJ基因的引物组组合。
将优选适用于核酸分子的碱基序列与待检测细菌的菌名一同列举于以下。另外，记载了用作引物的核酸分子基本按照由正向引物和反向引物的顺序组成的引物组。
(优选用作引物的核酸分子的碱基序列)
(呼吸道感染的病原菌的引物)
化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
SEQ ID NO：01：5-ATAAGGATGTTCAAGAAGCTTACG
SEQ ID NO：02：5-CACCAAAGCCGCCTTGAG
SEQ ID NO：03：5-TTTTGAAGAGGCTGTATTTGG
SEQ ID NO：04：5-GAGC GGTACCAGGTTTTG
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
SEQ ID NO：05：5-GCTTATGAAACCTTGAGTGATAC
SEQ ID NO：06：5-AAACCGCCACCATCGAAG
SEQ ID NO：07：5-GGAGATGACCTACAATATCG
SEQ ID NO：08：5-GGCTAGTACCTGGCTTAG
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
SEQ ID NO：09：5-GCCTATGAGACTTTGAGTGAC
SEQ ID NO：10：5-ACCAGCTCCACCAAAACC
SEQ ID NO：11：5-GCAATCCAAACGCTCCTC
SEQ ID NO：12：5-TGTACGACAGCCAGCTTC
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
SEQ ID NO：13：5-GGACAAGGATTCAATGGCTCT
SEQ ID NO：14：5-TTGCGGTGCATTTGGATCTCT
SEQ ID NO：15：5-GAAGCGGTATTTGGTACAAC
SEQ ID NO：16：5-GCCATTACAGTAACTACAAGTC
肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)
SEQ ID NO：17：5-CCCTGTCGGTTAAAATTCC
SEQ ID NO：18：5-CTCAAAGATAGCGTGCTG
SEQ ID NO：19：5-GCGTAGAAAAGACCAAAACC
SEQ ID NO：20：5-CAGGTTCAGGTGAAGCAG
大肠杆菌(Escherichia coli)
SEQ ID NO：21：5-TGTTGAGCGCAGCAAAAC
SEQ ID NO：22：5-CAAGACGGATGCGGTCTC
SEQ ID NO：23：5-CTCGAAGAAGCTGTACGTG
SEQ ID NO：24：5-CTGTGTACCTGGTTTTGC
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
SEQ ID NO：25：5-GTTCGACAGCGGCTTTGG
SEQ ID NO：26：5-GAACAAGTCGTTGAGGTTGAAC
SEQ ID NO：27：5-AAGACTTCTACCAGGAGCTG
SEQ ID NO：28：5-ACTTCCGATAGGCACGTTT
分枝杆菌(Mycobacterium spp.)(除结核分枝杆菌(M.tuberculosis)以外)
SEQ ID NO：29：5-CGIGARTGGGTYGARAARG
SEQ ID NO：30：5-GGIGAYYTITTCGGIGGIYT
SEQ ID NO：131：5-GTGARTGGGTCGARAARGACT
SEQ ID NO：132：5-CGIGTYTCGTCGTAYTCCTT
SEQ ID NO：133：5-CAGCGRTTACCYGCCCA
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
SEQ ID NO：31：5-AGCTTGCTATGCAGTACC
SEQ ID NO：32：5-CTCTTTAAACTTCTCTTCGTTTTG
SEQ ID NO：33：5-TTGAGATGACTAATGGTTGTACTC
SEQ ID NO：34：5-CCCTTCAGCCCCAAAACC
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
SEQ ID NO：35：5-ACTGTTTGTGAGGGATCG
SEQ ID NO：36：5-AAAACCTTGTTGAATTCTGAC
SEQ ID NO：37：5-TTGAAGAAGCGGCTATAGG
SEQ ID NO：38：5-CTCACAAACAGTACAAGTACC
肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)
SEQ ID NO：39：5-TCTCAGTGATCCTCAGAA
SEQ ID NO：40：5-CCAAAGGCTCCCATGAAAG
SEQ ID NO：41：5-TTTGGAATGCGCTCAGATC
SEQ ID NO：42：5-GCTTCTTCAAAAGTCAAATTAATATG
(引起腹泻或食物中毒的微生物的引物)
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
SEQ ID NO：43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
SEQ ID NO：44；5-AGCAGCTTATGACCAATACGCC
SEQ ID NO：45：5-AAACACGTCACCGAAAATATC
SEQ ID NO：46：5-TTATGACCAATACGGCCATG
拟态弧菌(Vibrio mimicus)
SEQ ID NO：43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
SEQ ID NO：47：5-YCTTGAAGAAGCGGTTCGTGCA
SEQ ID NO：48：5-ATATCGCCAAAGTCAG
SEQ ID NO：49：5-GCATCGGTCAGAATTTCATAC
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
SEQ ID NO：43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
SEQ ID NO：50：5-TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAG
SEQ ID NO：51：5-CCAAAGATGTCGCCGAAG
SEQ ID NO：52：5-CGAAGTTCTAACCGACTCTC
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)
SEQ ID NO：43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
SEQ ID NO：53：5-GTACGAAATTCTGACCGATCAA
SEQ ID NO：54：5-CCACCGCCTTGTTCAAAAG
SEQ ID NO：55：5-ACGAAATTCTGACCGATCC
河流弧菌(Vibrio fluvialis)
SEQ ID NO：43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
SEQ ID NO：134：5-GTACGAAATTCTGACCGATCAA
SEQ ID NO：56：5-CAATCTCTTTCGAGCAACCAC
SEQ ID NO：57：5-CAACGTGGTGCGGATCTG
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)
SEQ ID NO：43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
SEQ ID NO：58：5-GATCGAAGTRCCRACACTMGGA
SEQ ID NO：59：5-CCGAATACATCGCCAAAG
SEQ ID NO：60：5-ATGCTGCTTTTGAACAAGG
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
SEQ ID NO：61：5-GATCAATTTGGTCATGCTGGT
SEQ ID NO：62：5-GAAGCCACCACCGAAGTC
SEQ ID NO：63：5-AAAGCGTATCGTCGTTTGG
SEQ ID NO：64：5-ATCATCACTTAACACTTCATATGC
SEQ ID NO：65：5-CGCAGTACGATCAATTTGG
SEQ ID NO：66：5-CAAAGAAAGAACTAAATATATCTTC
空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
SEQ ID NO：67：5-TACTTATAAATGCTCTTGTAAAAC
SEQ ID NO：68：5-CTTTGGACAAGTTTGAAG
SEQ ID NO：69：5-TAGACTTTACTTATAAATGCTCTTG
SEQ ID NO：70：5-GACACTTTGGACAAGTTTG
(性病的病原菌的引物)
Mycoplasma genitarium
SEQ ID NO：71：5-GAAGGGTTAAATGCTTCTGG
SEQ ID NO：72：5-CACCATCCATTCCAAAGG
SEQ ID NO：73：5-AAGGGATTATTATGAAGTTCTAGGG
SEQ ID NO：74：5-CATTTTCTGCTTTATGACGATC
沙眼衣原体(Chlamydophila trachomatis)
SEQ ID NO：75：5-GGGATTTCCTTCTTGATCC
SEQ ID NO：76：5-CATGGGGATGATTTAGTTTTAG
SEQ ID NO：77：5-AAAGAAACCGCCTCCATTA
SEQ ID NO：78：5-GCATGGGGAATATGGAAGAC
淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoae)
SEQ ID NO：79：5-GGCGGGGAGTTAGAAGTG
SEQ ID NO：80：5-GACACCCTTACCTTTCACG
SEQ ID NO：81：5-CGGGCAAACATATTAAAGAACC
SEQ ID NO：82：5-CGGGAATATTGACTTCCAC
脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
SEQ ID NO：83：5-TTGGAAGTGCCGACCTTG
SEQ ID NO：84：5-GATTTGACACCCTTACCCTTCG
SEQ ID NO：85：5-GGGCAAACACATTAAAGAACC
SEQ ID NO：86：5-GCGGGAATATTGACTTCCA
(优选用作探针的核酸分子的碱基序列)
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)
SEQ ID NO：87：TTACCATCCAGACGTAAGTAAAGAAGAA
SEQ ID NO：88：TTAGCCACCGCCGAAGTCTCCTCC
化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)
SEQ ID NO：89：TTCGCCGTATTGATCATAAGCAGCA
SEQ ID NO：90：TTCCTGAGCCTAAACAAGTGCCG
无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)
SEQ ID NO：91：TTAAAACCGCCATTTGCCCCAG
SEQ ID NO：92：TCTTCCTGAACAAGTATGACATGATGAC
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)
SEQ ID NO：93：TTCGTGCTGCCTATGACCAGTATG
SEQ ID NO：94：TCGATGATACTTAACTTCCTTCTCAGT
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)
SEQ ID NO：95：TACAGTCTCACCCTCACCCTTATG
SEQ ID NO：96：TTCACAGGCACTACAGGTCACC
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)
SEQ ID NO：97：TTCAATCCGTAAAGATGTAACATGCG
SEQ ID NO：98：TTCAATCCGTAAAGATGTAACATGCGAA
肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)
SEQ ID NO：99：TTCGTACAGATCGCCTGCCG
SEQ ID NO：100：CGCGCCGGCAGGCGATCTGTACGT
大肠杆菌(Escherichia coli)
SEQ ID NO：101：AAGAGATCCGCATTCCGACTCTGGAAG
SEQ ID NO：102：TTAAGAGATCCGCATTCCGACT
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
SEQ ID NO：103：TCGGGGTCGGTGGAGACGGCG
SEQ ID NO：104：TTCTCCTCTGATGCCAGTCCTGAAGA
Mycoplasma genitarium
SEQ ID NO：105：TAGCAGGGTTTAATCCTTTTGACATCT
SEQ ID NO：106：TAAACGCTAGTTCTCAAGACATAAA
肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)
SEQ ID NO：107：TTCGCAAGGCATCTTCCATGTTCC
SEQ ID NO：108：TTTCTTACTGGCTCCTTGACGA
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)
SEQ ID NO：109：TTAGCCGCATCAACAAATCCAATAGG
SEQ ID NO：110：TTACCGAAATCGCCGCCAAA
脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)
SEQ ID NO：111：TTCTTGACCGCCTTATTCCGCC
SEQ ID NO：112：TGCCGTGGCGCGGGGCGGAATA
淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)
SEQ ID NO：113：TTCTTGACCGCCTTATTCCGCC
SEQ ID NO：114：TGCCGTGGCGTGGGGCGGAATA
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)
SEQ ID NO：115：TAAGAAGTTGAAATTACCGTTCCAAGAC
SEQ ID NO：116：AAAGAAGTTGAAATTACCGTTCC
河流弧菌(Vibrio fluvialis)
SEQ ID NO：117：TTCCAGCGTCAGTTCCATGTTG
SEQ ID NO：118：TCGAGCAGCCGCGTACCGCTTCT
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)
SEQ ID NO：119：TCCATATTGATCGTAAGCCGCT
SEQ ID NO：120：TCGAGACACCACGAACGGCCTCT
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)
SEQ ID NO：121：TTAATCAGCACCGCCGCCAC
SEQ ID NO：122：TCGTTACACCACGAACCGCTTCT
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)
SEQ ID NO：123：TTCAGCACCGCCTCCACCAA
SEQ ID NO：124：TAGTTACACCACGAACGGCTTCT
拟态弧菌(Vibrio mimicus)
SEQ ID NO：125：TTCGAAGCCGCCGCCACCAA
SEQ ID NO：126：TCGAACATCCACGAACCGCTTCT
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)
SEQ ID NO：127：TTAATCAGCACCGCCACCGC
SEQ ID NO：128：TCGAGCAGCCGCGAACCGCTTCT
空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)
SEQ ID NO：129：TGTAATGGAACAGGGGCTA
SEQ ID NO：130：TCCATCTTTAGCCCCTGTTCCAT
为了使试验样品和核酸分子接触，使试验样品中可能含有的待检测微生物的DnaJ基因与核酸分子应处于可进行杂交的状态。例如，可以使DnaJ基因与核酸分子共存于液相内，也可以使其中之一结合在固相中、另一个包含在与固相接触的液相中。如后所述，实现这样的接触的步骤可以基于诸如PCR、RT-PCR法、转录介导扩增法(TMA法)、分支DNA法(bDNA法)、实时PCR法、连接酶链反应法(LCR法)的基因扩增法，或者基于诸如southern印迹法、微阵列法、微珠法、核酸(DNA)色谱法的核酸杂交的碱基测序法的一部分来实施。在该步骤中采用的技术也可以根据例如所使用的核酸分子被设计为引物还是被设计为探针来进行适当的选择。
本发明方法可以包括检测核酸分子与试验样品中的核酸是否杂交的步骤。为了检测是否发生这样的杂交，例如，可以通过以下方法来进行：(1)直接检测核酸分子和试验样品中的核酸有无特异性杂交，(2)基于核酸分子和试验样品中的核酸之间有无特异性杂交，检测基因扩增反应是否存在，以及(3)检测基因扩增反应产物中有无特定碱基序列。
上述(1)的情况下，例如，通过向核酸分子和/或从试验样品中提取的核酸中添加产生可以检测信号的标记化合物或者添加产生信号的变化的信号形成化合物，可以检测杂交，其中，所述产生信号的变化是通过借由杂交的插入等而产生的。为了有效地检测杂交产物，优选将核酸分子或试验样品中的核酸结合于固相。这样的检测可以基于诸如southern印迹法、微阵列法、微珠法(流式细胞术)或核酸(DNA)色谱法的核酸杂交，作为碱基测序技术来实施。核酸分子可以采用探针的形式。
上述(2)的情况下，例如，可以使核酸分子作为引物发挥作用，并将DnaJ基因作为模板，诱导使与DnaJ基因特异性杂交的核酸分子延伸，通过电泳等检测是否获得指定的扩增产物。这样的基因扩增及检测可以通过诸如PCR、RT-PCR法、转录介导扩增法(TMA法)、分支DNA法(bDNA法)、实时PCR法或连接酶链反应法(LCR法)的基因扩增法或扩增产物的检测法来实施。使用PCR的方法将在后面说明书中详细叙述。
上述(3)的方法，可以通过组合上述(2)和上述(1)来实施。例如，可以通过使用对一定范围的属或者菌种有特异性的引物作为核酸分子，得到基因扩增产物，并也可以使用对特定菌种有特异性的探针作为核酸分子，对所产生的基因扩增产物检测有无杂交。
(细菌的鉴定方法)
本发明的细菌的鉴定方法可以包括以下步骤：获得诸如可能含有待鉴定细菌或者其核酸的临床样品的试验样品中的DnaJ基因的至少一部分碱基序列。通过获得DnaJ基因的至少一部分碱基序列，可能鉴定待鉴定细菌的菌种。另外，可以制作其系统发生树。本发明的细菌检测方法中，优选作为检测靶的细菌菌种包括链球菌属(Streptococcus)菌、葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、肠球菌属(Enterococcus)菌、消化链球菌属(PeptoStreptococcus)菌、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、肠杆菌属(Enterobacter)菌、军团菌属(Legionella)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌、螺杆菌属(Helicobacter)菌、棒杆菌属(Corynebacterium)菌、假单胞菌属(Pseudomonas)菌、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)菌、嗜血菌属(Haemophilus)菌、拟杆菌属(Bacteroides)菌、肠球菌属(Enterococcus)菌、诺卡尔菌属(Nocardia)菌、普氏菌属(Prevotella)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)菌、黄杆菌属(Flavobacterium)菌、梭菌属(Clostridium)菌、密螺旋体属(Treponema)菌、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)菌、钩端螺旋体属(Leptospira)菌、弯曲杆菌属(Campylobacter)菌、利斯特氏菌属(Listeria)菌、沙门氏菌属(Salmonella)菌及耶尔森氏菌属(Yersinia)细菌。由于DnaJ基因在这些细菌中为多样性的基因，因此其对于鉴定细菌菌种是有用的。得到DnaJ基因的碱基序列时，也可以得到将上述核酸分子作为引物使用而得到的PCR扩增产物的碱基序列或将上述核酸分子作为探针使用而得到的杂交产物的碱基序列。
可通过得到碱基序列，对由PCR法等得到的基因的至少一部分，利用采用公知的方法进行定序的定序器来测定碱基序列的方法或与具有指定的碱基序列的探针杂交的方法(利用微阵列法等)。
基于从试验样品中获得的DnaJ基因的至少一部分碱基序列来鉴定菌种时，优选将得到的碱基序列和预先得到的鉴定对象细菌的DnaJ基因的碱基序列进行对比。即，鉴定细菌菌种时，优选首先制备各细菌菌种的DnaJ基因的全部或一部分碱基序列的数据库。预先制备这样的数据库，可以迅速地鉴定细菌菌种。另外，优选预先制备包含涉及细菌菌种内的各种菌株的DnaJ基因的碱基序列的信息的数据库。利用这样的数据库，可以容易地提取出菌株通用的菌种特异性的碱基序列。通过使用如上操作提取得到的碱基序列，可以容易且准确地鉴定细菌菌种。另外，同时也适合于制作系统发生树。
尤其是，在利用DnaJ基因鉴定细菌菌种时，首先进行获得试验样品的16S rDNA基因的碱基序列的步骤是有用的。这是因为，即使16SrDNA基因的碱基序列与近缘菌种的相似性高，DnaJ基因的相似性也低。例如，通过首先测定16S rDNA基因的相似性最高的候选菌种(这样的菌种可以为1种，也可以为2种以上)，然后测定试验样品中候选菌种的DnaJ基因的碱基序列和分离株等的DnaJ基因的碱基序列，可以容易且迅速地鉴定分离株的菌种。另外，可通过16S rDNA基因进行鉴定时，就不需要通过DnaJ基因进行鉴定。采用这样的方法时，虽然与既有菌种的16S rDNA基因的相似性没有特别限定，在分离株与既有细菌菌种的16S rDNA基因的碱基序列至少98％的相似性时，优选对该既有的细菌菌株和分离株的DnaJ基因的碱基序列进行对比。
在得到16S rDNA基因的碱基序列时，与得到DnaJ基因的碱基序列同样，可以适当使用公知的方法。另外，优选通过将试验样品中的16S rDNA基因的至少一部分碱基序列与既有细菌菌株的16S rDNA基因的碱基序列进行对比，得到这些碱基序列之间的相似性水平。需要预先制备各种细菌菌种或菌株的16S rDNA基因的碱基序列的数据库。
在分析试验样品中的DnaJ基因等的碱基序列时，虽然待鉴定细菌的取样源没有特别限定，可以使用如上所述的包含例如临床样品的试验样品。另外，与以上描述的细菌的检测方法同样，可以将细菌的核酸提取物或者细菌基因的指定区域的扩增产物作为试验样品。
另外，从以上所述出发，根据本发明，还可以提供一种用于获得DnaJ基因的至少一部分碱基序列的细菌鉴定程序，其中，以与上述鉴定方法中的细菌相似的细菌作为待鉴定细菌，在1或2台以上的计算机上执行以下步骤，即通过将从可能含有待鉴定细菌的核酸的试验样品中得到的DnaJ基因的至少一部分碱基序列和待鉴定细菌的DnaJ基因的碱基序列对比，鉴定所述试验样品中的细菌的菌种的步骤。根据该程序，可以通过从DnaJ基因的序列数据库中检索可以从试验样品中得到的DnaJ基因的序列与碱基序列一致的序列，从而鉴定试验样品的细菌的种。在该程序中，在上述步骤之前，还可以进行以下步骤，即将从上述试验样品中得到的16S rDNA基因的至少一部分碱基序列与待鉴定细菌的16S rDNA基因的碱基序列进行对比，确定具有与所得的碱基序列相似性最高的16S rDNA基因的碱基序列的候选菌种，并将这些候选菌种的DnaJ基因的碱基序列与来自试验样品的DnaJ基因的碱基序列相对比。
这里，程序的形式没有特别的考虑。程序可以为借由因特网下载的形式，也可以为存储于适当的存储介质中的形式。或者，所述程序还可以存储于计算机或其他合适装置的ROM等中。而且，根据本发明，还可以提供以能够执行的方式存储这样的程序的装置。该装置的控制器可具有能够执行这样的程序的CPU、存储该程序的诸如ROM或硬盘的存储装置及适当的输入序列的装置。另外，还可以在装置内的硬盘等存储装置中装备DnaJ基因的序列数据库，并且，如果为可连接因特网的环境，则还可以通过访问存储有这样的序列数据库的服务器进行必要的处理。并且，对比序列的步骤即测定序列间的相似性水平、或进行比对的步骤可以使用DNASIS pro版本(日立软件)、Beacon designer版本5.1(Molecular Beacon公司)及Clustal W(自由软件)等软件的全部或一部分。
(核酸分子及包含核酸分子的细菌的检测和鉴定试剂盒)
本发明的核酸分子可以包含上述各种类型的核酸分子。另外，还可以作为用于检测或鉴定包含1种或2种以上上述各种核酸分子的细菌的检测和鉴定试剂盒制备这样的核酸分子。所选的用于这样的检测和鉴定试剂盒中所含的核酸分子可以为作为探针和/或引物起作用的核酸分子。检测和鉴定试剂盒中的核酸分子的组合没有特别限定，虽然试剂盒优选为组合有可以检测或鉴定优选3种以上、更优选4种以上、进一步优选5种以上的细菌菌种的核酸分子的试剂盒。优选的靶菌种的组合的实例为包含2种嗜衣原体属(Chlamydophila)菌、1种衣原体属(Chlamydia)菌、1种柯克斯体属(Coxiella)菌、1种嗜血菌属(Haemophilus)菌、4种军团菌属(Legionella)菌、2种链球菌属(Streptococcus)菌、3种分枝杆菌属(Mycobacterium)菌、1种假单胞菌属(Pseudomonas)菌、1种支原体属(Mycoplasma)、1种葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、1种博德特菌属(Bordetella)菌、1种棒杆菌属(Corynebacterium)菌、1种博德特菌属(Bordetella)菌、1种克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、1种沙雷菌属(Serratia)菌及1种埃希氏杆菌属(Escherichia)菌的组合。这样的核酸分子的试剂盒优选用于检测和鉴定肺炎及咽炎的病原菌。另一种优选组合的实例为包含1种衣原体属(Chlamydia)菌、2种奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、2种支原体属(Mycoplasma)菌、2种尿素支原体(Ureaplasma)菌、1种念珠菌属(Candida)菌、1种密螺旋体属(Treponema)菌、1种毛滴虫属(Trichomonasa)菌及2种嗜血菌属(Haemophilus)菌的组合。这样的核酸分子的试剂盒优选用于检测和鉴定性病和尿道感染的病原菌。优选组合的其他实例为包含2种耶尔森氏菌属(Yersinia)菌、4种埃希氏杆菌属(Escherichia)-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)菌、1种弯曲杆菌属(Campylobacter)菌、1种沙门菌属(Salmonella)菌、4种弧菌属(Vibrio)菌、3种气单胞菌属(Aeromonas)菌、1种邻单胞菌属(Plesiomonas)菌、1种贾第虫属(Giardia)菌、1种内阿米巴属(Entamoeba)菌及4种梭菌属(Clostridium)菌的组合物。这样的核酸分子的试剂盒优选用于检测和鉴定食物中毒和腹泻的病原菌。
以上优选的组合也可以与特别是将16S rDNA作为靶、通过PCR等对试验样品中的核酸进行扩增的产物鉴定细菌菌种的方法组合使用。例如，可以利用包含能够扩增16S rDNA基因的引物组的引物混合物(组合物)，也可以首先尝试通过16S rDNA的方式鉴定菌种，在不能这样鉴定的情况下，再尝试通过DnaJ进行鉴定。由此，可以同时检测或鉴定多个细菌菌种，或有效地进行检测或鉴定细菌菌种。
这样的检测和鉴定试剂盒可以仅仅制备为例如包含核酸分子作为引物的基因扩增的形式的1种或2种以上核酸分子的试剂盒，也可以制备为其中1种或2种以上核酸分子作为探针可固定于诸如微珠或基体的固相上的试剂盒。
(固定化体)
本发明的固定化体可以通过将上述核酸分子的1种或2种以上固定于诸如微珠或基体的固相而获得。固定于固相上的核酸分子通过基体等中其序列的位置信息或通过微珠中其颜色而被识别。已固定于固相上的核酸分子也可以结合其上杂交后发射信号的化合物。另外，核酸分子可固定于固相表面上能够进行引物延长反应。固相的形式没有特别限定，并且其材质也没有特别限定，例如，可以使用玻璃、塑料或陶瓷。
另外，本发明的固定化体可以为用过将作为探针的核酸分子固定于诸如过滤器的色谱基材上获得的核酸色谱装置。
本发明还涉及用于扩增或检测至少1种靶核酸的扩增方法及其应用。这些发明除了可用于扩增和检测非特异性的靶核酸以外，还可用于将上述DnaJ基因或其一部分作为靶核酸，利用DnaJ基因的碱基序列的细菌检测和鉴定。即，通过使用基于DnaJ基因的碱基序列的细菌菌种特异性引物，可以进一步地提高本发明在对1种或2种以上(优选2种以上)细菌菌种的检测及鉴定的有用性。
本发明的靶核酸的扩增方法为扩增至少1种靶核酸的方法，该方法可以包括以下步骤，即，使用至少1种分别具有标记序列和对所述靶核酸有特异性的碱基序列的第1引物组，和使用至少1种具有与所述第1引物组的标记序列基本上相同的标记序列的第2引物组，实施聚合酶链反应的步骤。
利用本发明的靶核酸扩增方法，通过第1引物组扩增靶核酸，通过第2引物组扩增包含靶核酸序列的第1引物组获得的扩增产物。即，即使利用第1引物组扩增靶核酸的效率低，利用第2引物组进行扩增，能够容易地获得包含检测所需要的量的靶核酸的扩增产物。因此，即使多种第1引物组为低浓度，也可以通过弥补利用第1引物组进行扩增的低效率，而利用第1引物组可以扩增一个以上靶核酸。另外，由于主要利用第2引物组来扩增靶核酸，因此，可以使扩增效率容易均一。
可以使上述聚合酶链反应步骤为同时实施利用上述第1引物组扩增所述靶核酸和利用所述第2引物组扩增利用所述第1引物组进行扩增而得到的扩增产物的步骤。这样的聚合酶链反应步骤可以容易地检测靶核酸。
本发明中，可以将第1引物组设计为具有对微生物的DnaJ基因上的靶核酸有特异性的碱基序列。通过使用DnaJ基因，即使存在不同属以及相同属不同种的微生物，也可以容易地在菌种水平检测微生物。本发明人明确了，DnaJ基因具有在菌种间相似性低，但在同一菌种保守的碱基序列。因此，DnaJ基因对因菌种不同而毒性或恶性度水平不同的病原微生物的检测是有利的。另外，通过使用DnaJ基因，可以将扩增产物容易地设计在能够有效避免扩增产物的竞争的250碱基以下的长度。
以下参照适当的图的本发明的实施方式，对本发明的靶核酸的扩增方法及用于这种扩增的试剂盒进行详细说明。图14显示了本发明的扩增方法中使用的第1引物组和第2引物组与靶核酸的关系。
(聚合酶链反应)
本发明中，聚合酶链反应(PCR)是在试管内通过酶反应而将特定的DNA序列扩增的反应。既有的PCR方法包括RT-PCR法、实时PCR法，及其多样改良法及其与其它的分析技术的组合，本发明使用的PCR中可以包含所有的这些方法。
(靶核酸)
本发明中，术语“靶核酸”是指通过聚合酶链反应而扩增的碱基序列的全部或其一部分的核酸。靶核酸只要是可以通过聚合酶链反应而扩增的靶核酸就没有特别限定，实例包括除了作为基因组，生物体遗传信息媒介物的DNA或RNA，还有mRNA、cDNA和cRNA。另外，靶核酸可以为单链或双链的。
靶核酸可以从生物体或其一部分组织中提取而得到并且可以为多种形式，诸如通过在对表达分析而得到的mRNA、cDNA及基因组上进行PCR反应而得到的扩增产物，所述形式没有特别的限定。作为其来源的生物体或组织也没有特别限定，除包括人类及非人类哺乳类动物的动物之外，诸如细菌、真菌和病毒的微生物也可作为来源。从感染症的预防和治疗以及卫生的观点考虑，靶核酸的来源生物体优选为微生物，更优选为由于卫生或治疗的原因，被检测或鉴定的微生物，进一步优选为病原微生物。
靶核酸所来源的微生物的实例包括葡萄球菌属(Staphylococcus)菌、链球菌属(Streptococcus)菌、沙雷菌属(Serratia)菌、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)菌、埃希氏杆菌属(Escherichia)菌、分枝杆菌属(Mycobacterium)菌、军团菌属(Legionella)菌、弧菌属(Vibrio)菌、芽孢杆菌属(Bacillus)菌、奈瑟氏球菌属(Neisseria)菌、弯曲杆菌属(Campylobacter)菌、衣原体属(Chlamydia)菌、嗜衣原体属(Chlamydophila)菌、支原体属(Mycoplasma)菌、利斯特氏菌属(Listeria)菌、沙门氏菌属(Salmonella)菌及耶尔森氏菌属(Yersinia)菌。1种或2种以上的细菌菌种的微生物选自属于这些属的菌。属于这些属的菌种具有在DnaJ基因上的优选的靶核酸。这是因为，在属于这些属的微生物中，菌种间的DnaJ基因的碱基序列的相似性比16S rDNA基因的碱基序列的相似性低，因此容易发现在同一菌种的菌株之间保守的菌种特异性碱基序列。
其中，优选为葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、军团菌属(Legionella)及弧菌属(Vibrio)的细菌菌种。这是因为，属于这些属的细菌在属间及同一属内的菌种间DnaJ基因的相似性低，因此适于通过DnaJ基因的方式检测细菌菌种。例如，对于DnaJ基因，在葡萄球菌属(Staphylococcus)菌中，16S rDNA基因在菌种间的相似性平均为97.4％，DnaJ基因在菌种间的相似性平均为77.6％，在链球菌属(Streptococcus)的菌中，16SrDNA基因在菌种间的相似性平均为95.8％，DnaJ基因在菌种间的相似性平均为76.4％，在分枝杆菌属(Mycobacterium)菌中，16S rDNA基因在菌种间的相似性平均为93％、DnaJ基因在菌种间的相似性平均为83.7％，在军团菌属(Legionella)的菌中，16S rDNA基因在菌种间的相似性平均为96.1％、DnaJ基因在菌种间的相似性平均为82.5％，对于弧菌属(Vibrio)的菌，16S rDNA基因在菌种间的相似性平均为97.4％、DnaJ基因在菌种间的相似性平均为82％。
这样的靶核酸以例如血液、血清、从包含人在内的动物收集的细胞或组织、诸如粪便和尿的排泄物、痰、井水、食品等试验样品的方式提供。试验样品可以为通过从这样收集的材料提取核酸获得的核酸提取样品，或者可以为包含DnaJ基因或其一部分(包含待检测的区域)的扩增产物的样品。
(第1引物组)
本发明的扩增方法中使用具有标记序列和选择性退火到靶核酸的碱基序列的第1引物组。第1引物组由正向引物和反向引物构成。如图1所示，正向引物及反向引物均在其5’侧具有标记序列，在3’侧具有退火到靶核酸的序列。
第1引物组(引物对)根据靶核酸的种类进行选择。通常，相对于单个靶核酸选择单个第1引物组。然而，有时也可以对两个以上靶核酸选择单个第1引物组。
选择性退火到与第1引物组(对)各自的引物所具有的靶核酸的碱基序列(以下也称为退火序列)优选选择仅与靶核酸杂交、可退火特异性高的序列。这里，将为同一基因设计作为靶核酸的引物时，不同的引物组之间，退火序列可以部分或全部匹配。退火序列可以根据对靶核酸的特异性以及避免引物二聚体的形成、PCR步骤中的反应温度来确定。优选该碱基序列和靶核酸之间的反应温度Tm为50℃以上70℃以下，更优选为55℃以上65℃以下。
在以微生物的检测或鉴定为目的而实施扩增方法时，这样的退火序列可以选择对待检测或鉴定的微生物有特异性的序列，虽然，优选如上所述使用DnaJ基因上的碱基序列作为靶核酸。对于多个微生物，将同一基因的碱基序列用作靶核酸时，可以通过比对多个微生物的DnaJ基因的碱基序列，选择微生物特异性碱基序列。这样的退火序列是菌种特异性的，并可以可靠地检测属于该菌种的菌株。为了这样的比对及特征性序列的提取，可以利用诸如DNASIS pro版本(日立软件)、Beacon designer 5.1版本(Molecular Beacon公司)及Clustal W(自由软件)的软件。
标记序列可以选自不与待扩增的靶核酸杂交的序列。标记序列的长度优选为12碱基以上40碱基以下，更优选为18碱基以上30碱基以下。
构成第1引物组的正向引物和反向引物可以分别具有在标记序列和退火序列之间的接头序列，虽然优选仅由2种序列构成。另外，正向引物和反向引物序列均优选整体为30碱基以上80碱基以下，更优选为35碱基以上。
另外，利用这样的第1引物组而扩增获得的扩增产物优选为80以上280以下的碱基。这是因为，在该范围内时，病原微生物等的基因中包含的通用保守序列的可能性减少，检测灵敏度提高。更优选扩增产物为250碱基以下。这是因为，为250碱基以下时，扩增区域包括的不同细菌菌种的通用保守序列的可能性减少，扩增效率和灵敏度提高。进一步优选扩增产物为200碱基以下。这是因为，为200碱基以下时，容易设计菌种特异性引物及探针。特别是将微生物的DnaJ基因作为靶核酸时，DnaJ基因的结构，扩增产物的长度超过200碱基时，菌种特异性引物和探针的设计变难，为200碱基以下时，菌种特异性引物的设计变容易。另外，为DnaJ基因时，基因的结构，即使扩增产物为该长度，特异性探针的设计也比16S rDNA容易。即，通过在DnaJ基因上配置靶核酸，可以在多个微生物中设计可以得到优选250碱基以下、更优选200碱基以下的扩增产物的第1引物组。在本发明中，由于可以这样的一定范围的碱基长度得到利用第1引物组进行扩增的产物，因此，可以将用于利用第2引物组进一步扩增该扩增产物的PCR循环和利用第1引物组的PCR反应循环设定为同一循环。
使用至少一种第1引物组，本发明的扩增方法在利用多重PCR实施的扩增步骤时等，可以使用多种第1引物组。优选使用6种以上第1引物组，更优选使用10种以上第1引物组。甚至更优选使用15种以上第1引物组。然而，优选使用50种以下第1引物组。在扩增微生物的靶核酸时，特别优选将DnaJ基因上的序列作为靶核酸。通过使用该基因，可以设计菌种特异且扩增产物间难以产生竞争的引物，从而可以通过多重PCR而容易地检测多种微生物的靶核酸。
(第2引物组)
本扩增方法中，可以使用至少1种具有与第1引物组中使用的标记序列基本上相同的标记序列的第2引物组。第2引物组通过借由标记序列与第1引物组和靶核酸退火而得到的扩增产物退火，可以进一步将扩增产物扩增。
构成第2引物组的第2正向引物及第2反向引物分别具有与第1正向引物的标记序列及第1反向引物的标记序列基本上相同的标记序列。第2正向引物及第2反向引物优选包含分别与第1正向引物及第1反向引物的标记序列基本上相同的标记序列。
这里，与标记序列基本上相同的标记序列，例如为与第1正向引物的标记序列相同的标记序列，在可以维持第1标记序列与互补的碱基序列的杂交特异性的范围内进行修饰的碱基序列。示例性实例包括与该碱基序列互补的碱基序列，或在该碱基序列中，以选自置换、插入、缺失及添加1或2以上的碱基中的1种或2种以上的方式进行修饰而得到的碱基序列。优选使用与分别添加在第1引物组上的标记序列相同的标记序列。
第2引物组不是对应特定的第1引物组而使用的，而是对应于可在第1引物组中使用的标记序列而使用的。因此，在扩增反应中使用的2种以上的第1引物组使用1种标记序列对时，第2引物组为1种。或者，2种以上的第1引物组使用2种以上的标记序列时，使用2种以上的第2引物组。
这样的第1引物组和第2引物组优选以使第1引物组的各引物浓度低、使第2引物组的各引物浓度比第1引物组的每个引物浓度高的方式来使用。这是因为，由于使用第2引物组，因此，第1引物组只要可以产生能够作为第2引物组的模板的程度的扩增产物即可。
PCR反应溶液中的第2引物组的每个引物的浓度优选为PCR反应溶液中的每个第1引物组的每个引物的浓度的10倍以上50倍以下。在该范围内时，即使使用多种第1引物组，也可以得到与用单独的引物组进行扩增时同样的检测灵敏度。这里，第1引物组的引物浓度和第2引物组的引物浓度的比率优选根据所使用的第1引物组的种类数来决定。例如，所使用的第1引物组的种类为10种时，优选将第2引物组的每个引物的浓度设为每个第1引物组的引物浓度的10倍以上。同样，所使用的第1引物组的种类为20种时，优选将第2引物组的每个引物的浓度设为每个第1引物组的引物浓度的20倍以上。
第1引物组的每个引物的浓度优选为0.005μM以上0.2μM以下。在该范围内时，可以利用第2引物组以可扩增的水平产生扩增产物。更优选引物浓度为0.1μM以下。另一方面，第2引物组的引物浓度优选为0.1μM以上，更优选为0.25μM以上。
本发明中使用的第1引物组和第2引物组优选具备以下特征中的任一种：
(a)：利用所述第1引物组进行扩增而得到的产物为具有250以下个碱基的核酸
(b)：所述第1引物组的引物使用时的浓度为0.005μM以上0.2μM以下(优选0.1μM以下)；或者
(c)：所述第2引物组的引物使用时的浓度为所述第1引物组的引物使用时的浓度的10倍以上50倍以下。
通过具备这些特征，即使使用多种第1引物组，也可以维持特异性并扩增所需量的靶序列。另外，还可以如后所述通过简单的PCR步骤实施使用多种第1引物组的扩增步骤。
这里，构成这些第1引物组和第2引物组的核酸分子只要是可以进行基于碱基序列的杂交的核酸分子就没有特别限定。虽然典型的核酸分子为DNA，可以采用DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、含有修饰碱基的人工核酸或肽核酸(PNA)中的任一种形态。另外，这样的核酸分子还可以用多种荧光染料，荧光染料的淬灭剂等进行修饰。
(PCR步骤)
使用第1引物组和第2引物组的PCR步骤中的反应条件等没有特别限定，只要可以利用第2引物组扩增利用第1引物组进行扩增的靶核酸的扩增产物即可。利用第1引物组的靶核酸的扩增步骤和利用第2引物组对第1引物组的扩增产物进行扩增的步骤可以分别以不同的“变性-退火-延伸”的循环来实施。例如，利用第1引物组的扩增步骤可以在90℃以上97℃以下10秒～60秒，在55℃以上65℃以下10秒～60秒，在70℃以上75℃以下1秒～30秒的顺序实施。另外，例如，循环数优选为1个循环以上数个循环以下。这是因为，超过10个循环，最终的扩增产物的量的增加程度停止变大。优选为1或2个循环，更优选为1个循环。另外，例如，利用第2引物组的扩增步骤可以在90℃以上97℃以下实施0.5秒～5秒，在55℃以上65℃以下实施0.5秒～5秒，在70℃以上75℃以下实施1秒～20秒。另外，循环数优选为20循环以上70循环以下。更优选为30循环以上，进一步优选为40循环以上60循环以下。
另外，利用第1引物组的扩增步骤和利用第2引物组的扩增步骤可以单一的“变性-退火-延伸”的PCR循环来实施。在将利用第1引物组进行扩增而得到的扩增产物的长度设定为优选250碱基以下、更优选200碱基以下时，特别优选将利用第2引物组的PCR反应循环的条件设定为与利用第1引物组的PCR循环相同的条件。在这样的情况下，可以通过同一条件的PCR循环使第1引物组和第2引物组分别有效地发挥作用，其结果，可以有效地得到利用第2引物组的扩增产物。因此，没有必要另外实施用于第1引物组的PCR循环。
如以上所述，通过将靶核酸置于DnaJ基因上，当将利用多个第1引物组对多个靶核酸进行扩增而得到的扩增产物的长度为250碱基以下、优选200碱基以下时，实施单一的PCR循环时，特别优选实施多重PCR。通过将第1引物组的扩增产物设计在这样的碱基长度上，不仅可以在利用第1引物组进行扩增时抑制竞争，而且由于可以对所有的靶核酸赋予均等的扩增条件，因此任一核酸均可以相同的检测灵敏度进行检测。另外，通过在单一的PCR循环中使第1引物组和第2引物组都发挥作用，也适于诸如实时PCR的定量分析。
使用单一的PCR循环，利用第1引物组及第2引物组实施扩增步骤时，可以在90℃以上97℃以下0.5秒～5秒，在55℃以上65℃以下0.5秒～5秒，在70℃以上75℃以下1秒～20秒的顺序实施。另外，循环数优选为20循环以上70循环以下。更优选为30循环以上60循环以下。
另外，在这样的PCR步骤中，第1引物组的引物浓度优选为0.005μM以上0.2μM以下，所述第2引物组的引物浓度优选为所述第1引物组的引物浓度的10倍以上50倍以下。在这样的浓度范围内时，可以有效地扩增靶核酸。另外，利用第1引物组进行扩增而得到的扩增产物为250碱基以下的核酸时，包含具有相似序列的区域的可能性减少，并且可以在不引起扩增的竞争的情况下增大灵敏度。
将本发明适用于先前说明的细菌菌种的检测方法时，优选将所述(a)步骤设定为如下步骤，即，使用至少1种具有标记序列和选择性退火到所述DnaJ基因的一部分的碱基序列的第1引物组、和至少1种具有与第1引物组的所述标记序列基本上相同的标记序列的第2引物组，进行利用所述第1引物组扩增所述DnaJ基因的至少一部分和利用第2引物组扩增利用所述第1引物组进行扩增而得到的扩增产物的步骤实施聚合酶链反应。由此，即使在有存在多个细菌菌种的可能性时，也可以少数实验广泛地检测多个菌种是否存在。该情况下，通过将PCR步骤设定为实施单一的PCR反应循环的步骤，可以将实验进一步简略化。
(利用多重PCR诊断病原微生物的方法)
本发明的基于多重PCR诊断病原微生物的方法以选自葡萄球菌属(Staphylococcus)细、链球菌属(Streptococcus)细、沙雷菌属(Serratia)细、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)细、埃希氏杆菌属(Escherichia)细、分枝杆菌属(Mycobacterium)细、军团菌属(Legionella)细、弧菌属(Vibrio)细、芽孢杆菌属(Bacillus)细、奈瑟氏球菌属(Neisseria)细、弯曲杆菌属(Campylobacter)细、衣原体属(Chlamydia)细、嗜衣原体属(Chlamydophila)细、支原体属(Mycoplasma)细、利斯特氏菌属(Listeria)细、沙门氏菌(Salmonella)细及耶尔森氏菌属(Yersinia)细中的2种以上病原微生物为对象，该方法具备使用至少一种第1引物组和至少一种第2引物组对可能含有来自所述病原微生物的核酸的试验样品实施聚合酶链反应的步骤，和检测含有所述靶核酸的扩增产物的步骤，所述第1引物组具有标记序列和选择性退火到所述病原微生物所具有的DnaJ基因上的靶核酸的碱基序列，所述第2引物组具有与所述第1引物组的标记序列基本上相同的标记序列。PCR步骤可以与上述类似操作来实施。特别优选将PCR步骤为实施单一的PCR反应循环的步骤。由此，可以迅速地诊断病原微生物。检测步骤中，检测扩增产物的方法没有特别限定。例如，可以通过使用诸如电泳的技术基于分子量进行分离而检测扩增产物，也可以使第2引物连接标记化合物，然后利用Southern印迹法、微阵列法、微珠法(流式细胞术)、核酸(DNA)色谱法基于杂交检测靶核酸。
根据本发明的诊断方法，通过具有所述PCR步骤，即使仅存在少量的靶核酸，也可以特异且检测灵敏度良好地检测靶核酸。即使使用多种引物组，利用多重PCR检测靶核酸时，可以特异性良好，灵敏度良好且容易地检测靶核酸。另外，由于靶核酸在DnaJ基因上，因此，在将尽可能地在不同的微生物的DnaJ基因上保守的序列选作退火序列，设计第1引物组时，第1引物组均匀地扩增不同的DnaJ基因上的靶核酸，第2引物组均匀地扩增所得的扩增产物，可以定量地扩增靶核酸，因此可以定量靶核酸即微生物的量。该种定量分析也可以适用于其它靶核酸。例如，也适用于作为表达分析的产物的诸如mDNA或cDNA的靶核酸。
(包含用于通过多重PCR扩增至少1种病原微生物的靶核酸的引物组的试剂盒)
本发明的试剂盒可以包括第1引物组和第2引物组，所述第1引物组具有标记序列和选择性退火到所述病原微生物中的靶核酸的碱基序列，所述第2引物组具有与所述第1引物组的标记序列基本上相同的标记序列。该检测试剂盒中的第1引物组和第2引物组均可以适用已说明的本发明的扩增方法中的第1引物组和第2引物组的实施方式。
并且，本发明的试剂盒优选具备以下特征中的任一种，所述特征为：
(a)：利用所述第1引物组进行扩增而得到的产物为250碱基以下的核酸
(b)：所述第1引物组的引物使用时的浓度为0.005μM以上0.2μM以下(优选0.1μM以下)；或者
(c)：所述第2引物组的引物使用时的浓度为所述第1引物组的引物使用时的浓度的10倍以上50倍以下。
通过具备这些特征，不仅可以容易地扩增或检测少量的靶核酸，而且即使同时使用多种引物对，也可以可靠且高灵敏度地检测靶核酸。
本发明的试剂盒优选在DnaJ基因上具有靶核酸。通过在DnaJ基因上具有靶核酸，即使利用第1引物组进行扩增的产物为200碱基以下的核酸，也可以设计不与其它扩增产物竞争的扩增产物。本检测试剂盒优选用于微生物的DnaJ基因上的靶核酸。如前面的解释，这些微生物具有以下的表中所示的任一种微生物的DnaJ基因上的靶核酸时，优选使用同一表中所示的正向引物和反向引物。
表1

  结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis)DnaJ 肺炎引物F  5-TAGCAGGATCCCTCTAAG-TTGTT  CGGTGGCTTGTTC  结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis)DnaJ 肺炎引物R  5-AATTCTAATACGACTCACTATAG  GGAG-CCTCCACGAAATCCAACTC  大肠杆菌(Escherichia coli)DnaJ 肺炎引物F  5-TAGCAGGATCCCTCTAAG-TGTT  GAGCGCAGCAAAAC  大肠杆菌(Escherichia coli)DnaJ 肺炎引物R  5-AATTCTAATACGACTCACTATAG  GGAG-CAAGACGGATGCGGTCTC
  淋病奈瑟氏球菌(Neisseria  gonorrhoeae)DnaJ STD引物F  5-TAGCAGGATCCCTCTAAGTTGGA  TTTGCATTGCGAACTG  淋病奈瑟氏球菌(Neisseria  gonorrhoeae)DnaJ STD引物R  5-AATTCTAATACGACTCACTATAG  GGAG-CCAAGGTCGGCACTTCTAA  C  霍乱弧菌(Vibrio cholerae)DnaJ 腹泻引物F  5-TAGCAGGATCCCTCTAAGCAGGT  TTGYTGCACGGCGAAGA  霍乱弧菌(Vibrio cholerae) 腹泻引物R  5-AATTCTAATACGACTCACTATAG  GGAG-AGAAGCGGTTCGCGGCTGC  TCG  副溶血弧菌(Vibrio  parahaemolyticus)DnaJ 腹泻引物F  5-TAGCAGGATCCCTCTAAGCAGGT  TTGYTGCACGGCGAAGA  副溶血弧菌(Vibrio  parahaemolyticus) 腹泻引物R  5-AATTCTAATACGACTCACTATAG  GGAG-GAAGCCGTTCGTGGTGTAA  CT
DnaJ基因的一部分序列是公知的。为了将DnaJ基因用作本发明中的靶核酸，需要得到高多态性的DnaJ基因中在菌种水平保守的序列和SNP多态性位点，但是这些序列和位点是未知的。本发明人等通过测定大量野生株的DnaJ基因的序列，以及鉴定菌种特异性保守的区域和SNP的位点，由此可以首先确定用于第1引物组的特异性探针的序列。另外，可以确定用于扩增产物的特异性探针的序列。本发明人从上述的内容知晓了对于DnaJ基因，在分枝杆菌属(Mycobacterium)中的菌种的菌株之间的多态性小于1％，在肠内细菌科的菌种之间或链球菌属(Streptococcus)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的菌种之间的多态性为1～3％，另一方面，独立的近缘菌种间存在5％以上的序列差异。
本发明的试剂盒可以为用于检测选自葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、沙雷菌属(Serratia)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、军团菌属(Legionella)、弧菌属(Vibrio)、芽孢杆菌属(Bacillus)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、支原体属(Mycoplasma)、利斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌(Salmonella)及耶尔森氏菌属(Yersinia)的1种或2种细菌菌种的引物对的试剂盒。优选以将这些微生物的DnaJ基因上的一部分序列作为靶核酸的方式设计引物。引物的设计可以利用扩增属于上述这些属的各种细菌菌种的菌种特异性部分的引物序列。本发明的试剂盒优选组合对应于这些待检测对象中2种以上或3种以上细菌菌种的各DnaJ基因的引物对。
本发明的试剂盒可以制备为用于检测选自上述肺炎或咽炎的各种病原菌中的1种或2种以上细菌菌种的试剂盒。另外，本发明的试剂盒还可以制备为用于检测选自上述腹泻和食物中毒的各种病原菌中的1种或2种以上细菌菌种的试剂盒。另外，本发明的试剂盒还可以制备为用于检测选自上述性病的各种病原菌中的1种或2种以上细菌菌种的试剂盒。本发明的试剂盒优选使用这些待检测的微生物中的部分DnaJ基因作为靶核酸。引物的设计可以利用属于上述这些属的各种病原菌的特定的引物序列。本发明的试剂盒优选组合对应于这些待检测微生物中2种以上或3种以上菌种的各DnaJ基因的引物组。
本发明的试剂盒可以能够同时扩增优选3种以上、更优选4种以上、进一步优选5种以上的微生物的靶核酸的方式构成。例如，这样的检测试剂盒中优选的靶菌种的组合，可以包含嗜衣原体属(Chlamydophila)、衣原体属(Chlamydia)、Coxiella属、嗜血菌属(Haemophilus)、军团菌属(Legionella)、链球菌属(Streptococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、支原体属(Mycoplasma)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、Bordetella属、棒杆菌属(Corynebacterium)、Bordetella属、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、沙雷菌属(Serratia)及埃希氏杆菌属(Escherichia)的细菌。这样的试剂盒优选用于检测和鉴定肺炎及咽炎的病原菌。另外，这样的检测试剂盒可以包含衣原体属(Chlamydia)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、支原体属(Mycoplasma)、尿素支原体(Ureaplasma)、念珠菌属(Candida)、密螺旋体属(Treponema)、毛滴虫属(Trichomonasa)及嗜血菌属(Haemophilus)的细菌。这样的试剂盒优选用于检测和鉴定性病和尿道感染的病原菌。进一步，这样的检测试剂盒可以包含耶尔森氏菌属(Yersinia)、埃希氏杆菌属-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、沙门氏菌(Salmonella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、贾第虫属(Giardia)、内阿米巴属(Entamoeba)、梭菌属(Clostridium)及利斯特氏菌属(Listeria)的细菌。这样的试剂盒优选用于检测和鉴定食物中毒和腹泻的病原菌。
从以上所述出发，根据本发明，提供了一种方法，该方法用于检测选自葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、军团菌属(Legionella)、弧菌属(Vibrio)、芽孢杆菌属(Bacillus)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、支原体属(Mycoplasma)、利斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌(Salmonella)及耶尔森氏菌属(Yersinia)的细菌中的2种以上的细菌菌种，该检测方法包括以下步骤：(a)使可能含有待检测细菌的核酸的试验样品和与待检测的2种以上细菌菌种的DnaJ基因的至少一部分杂交的2种以上核酸分子接触；以及b)检测所述核酸分子是否与所述试验样品中的核酸杂交，其中，所述(a)步骤为如下步骤，即，使用至少1种具有标记序列和选择性退火到所述DnaJ基因的一部分的碱基序列的第1引物组、和至少1种具有与所述第1引物组的标记序列基本上相同的标记序列的第2引物组，实施聚合酶链反应的聚合酶链反应，以及实施利用所述第1引物组扩增所述DnaJ基因的至少一部分和利用所述第2引物组扩增所述第1引物组获得的扩增产物的步骤。所述聚合酶链反应步骤可以实施单一的PCR反应循环。
本发明还提供了一种用于检测和鉴定2种以上细菌菌种的核酸分子试剂盒，其中所述2种以上细菌菌种选自链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、消化链球菌属(PeptoStreptococcus)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、军团菌属(Legionella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、芽孢杆菌属(Bacillus)、螺杆菌属(Helicobacter)、棒杆菌属(Corynebacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)、嗜血菌属(Haemophilus)、拟杆菌属(Bacteroides)、肠球菌属(Enterococcus)、诺卡尔菌属(Nocardia)、普氏菌属(Prevotella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭菌属(Clostridium)、密螺旋体属(Treponema)、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)、钩端螺旋体属(Leptospira)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、利斯特氏菌属(Listeria)、沙门氏菌(Salmonella)及耶尔森氏菌属(Yersinia)的细菌，所述试剂盒包含与所述待鉴定细菌的DnaJ基因的至少一部分杂交的核酸分子。另外，在该试剂盒中，所述核酸分子包含至少1种具有标记序列和选择性退火到所述DnaJ基因的一部分的碱基序列的第1引物组、和至少1种具有与所述第1引物组的标记序列基本上相同的标记序列的第2引物组。并且，本发明还可以采用构成这样的核酸分子试剂盒的2种以上核酸分子被固定的固相体的形式。
实施例1
葡萄球菌属(Staphylococcus)的金黄色葡萄球菌(S.aureus)是导致食物中毒的重要菌种，已知对于16S rDNA而言，与近缘菌表皮葡萄球菌(S.epidermides)的相似性为99.5％(图1A)，从而不可能设计菌种特异性的引物，但是对于DnaJ基因而言，这两个菌种的相似性仅有81.1％(图1B)。因此，可以容易地针对DnaJ基因设计引物。并且，该引物序列在已经确定序列的11株金黄色葡萄球菌(S.aureus)间较保守(图2)。在本实施例中，以引起食物中毒的9种病原菌种的已测定的DnaJ序列为基础，制备这些病原体的引物。各病原体的引物序列如下。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)用引物
SEQ ID NO：13：5-GGACAAGGATTCAATGGCTCT
SEQ ID NO：14：5-TTGCGGTGCATTTGGATCTCT
空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)用引物
SEQ ID NO：67：5-TACTTATAAATGCTCTTGTAAAAC
SEQ ID NO：68：5-CTTTGGACAAGTTTGAAG
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)用引物
SEQ ID NO：43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
SEQ ID NO：44：5-AGCAGCTTATGACCAATACGCC
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)用引物
SEQ ID NO：43：5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA
SEQ ID NO：50：5-TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAG
大肠杆菌(Escherichia coli)用引物
SEQ ID NO：21：5-TGTTGAGCGCAGCAAAAC
SEQ ID NO：22：5-CAAGACGGATGCGGTCTC
单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes)用引物
SEQ ID NO：135：GTACAAGCTACATTAGGTGAC
SEQ ID NO：136：GTTCGTTTGAAAATTCCAAGT
(或者
SEQ ID NO：137：GGACAACACCTGAAAAATGT
SEQ ID NO：138：AATGGGGTATTTTGTTCCACGT)
肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)用引物
SEQ ID NO：139：AAATCAAAAAGGCGTACAAG
SEQ ID NO：140：GAGATTAAAGCAGCCTACGA
耶尔森氏菌(Yersinia spp)用引物
SEQ ID NO：141：CGTTCAGGTACAAGTCAAGG
SEQ ID NO：142：GTGAGGTTCCTATTAACTTTGC
(或者
小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)用引物
SEQ ID NO：143：TACGCGGTGTGACTAAAGAA
SEQ ID NO：144：TATGTACCTGACCTGCACCA)
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)用引物(其中，以16S rDNA作为靶核酸)
SEQ ID NO：145：GGTGCTTCAGATGATGAG
SEQ ID NO：146：GGAGATAAGGAAGCGGAA
将上述各种引物按以下方式混合，制备包含这9种个菌种的所有引物组的引物溶液A，再制备以下的PCR反应溶液。
引物溶液A(各引物1μM)                 ：2μl
2×CYBER预混合Hotstart Ex Taq(Takara) ：10μl
金黄色葡萄球菌(S.aureus)DNA(GTC 250株)：5ng
加蒸馏水使总量为20μl。
这里，作为对照，仅使用金黄色葡萄球菌(S.aureus)的引物，制备引物溶液B，再制备以下的PCR反应溶液。
引物溶液B(各引物1μM)                 ：2μl
2×CYBER预混合Hotstart Ex Taq(Takara) ：10μl
金黄色葡萄球菌(S.aureus)DNA(GTC 250株)：5ng
加蒸馏水使总量为20μl。
在各个Light Cycler(罗氏公司)的毛细管中加入上述各PCR反应溶液连同试剂，用Light Cycler对上述基因进行扩增(95℃：1秒钟，55℃：1秒钟，72℃：10秒钟，进行50个循环)。结果示于图3。
以引物溶液A进行扩增的PCR产物和以引物溶液B进行扩增的PCR产物确认最终以几乎相同的扩增效率扩增。即，利用包含9种引物组的引物混合物和单独的引物组进行扩增的扩增效率的水平相同，表明各个引物组可以分别不相互干涉地扩增目的菌的DnaJ基因的特定序列。
实施例2
代替实施例1中使用的金黄色葡萄球菌(S.aureus)的DNA，使用下述菌株的DNA，在同样的条件下使用混合的引物组。用CYBR绿色荧光强度的增加监测用Light Cycler(罗氏公司)的毛细管进行扩增的DNA。结果示于图4。
[使用的菌株]
1.空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)     GTC 0259型株
2.霍乱弧菌(Vibrio cholerae)              GTC 0037 01 E1 Tol型
3.副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)    GTC 0056(＝CDC A3308)
4.大肠杆菌(Escherichia coli)             GTC 1061 0157(VT1和VT2阳性)
5.单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)GTC0149(＝ATCC15313)型株
6.Salmonella enterica var.Typhimurium  GlFU 11566 ST-1
7.小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)GTC 0127型株
8.产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)GTC 0785(＝ATCC13124)
如图4所示，确认，各菌的DNA利用混合引物溶液A中的菌种特异性引物组进行扩增。证实了这各个引物组可以分别不相互干涉地扩增目的菌的DnaJ基因的特定序列。
实施例3
(弧菌属(Vibrio)菌的DnaJ基因的扩增)
弧菌属(Vibrio)细菌的通用正向引物(SEQ ID NO：43)和同一属内的下述以外的菌种特异性反向引物混合而得到的引物溶液按以下方式制备。
弧菌属(Vibrio)通用的引物(SEQ ID NO：43)     2μM
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(SEQ ID NO：44)          1μM
拟态弧菌(Vibrio mimicus)(SEQ ID NO：47)           1μM
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)(SEQ ID NO：53)        1μM
河流弧菌(Vibrio fluvialis)(SEQ ID NO：134)        1μM
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)(SEQ ID NO：50)1μM
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)(SEQ ID NO：58)     1μM
此外，将该引物溶液按以下方式制备PCR反应溶液。
引物混合溶液(正向μM 、反向各1μM)   ：2μl
2×CYBER预混合Hotstart Ex Taq(Takara)：10μl
各弧菌的DNA(单独)                    ：5ng
加水使总量为20μl。
[所使用的弧菌的菌株]
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)GTC 0037 01 El Tol型
拟态弧菌(Vibrio mimicus)GTC 0334型株
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)GTC 0116型株
河流弧菌(Vibrio fluvialis)GTC 0315型株
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)GTC 0056(＝CDC A3308)
溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)GTC 0057(＝ATCC 17449)型株
在各个Light Cycler(罗氏公司)用的毛细管中加入上述PCR反应溶液连同试剂，用Light Cycler对基因进行扩增(95℃：1秒钟，55℃：1秒钟，72℃：10秒钟，进行50循环)。用琼脂电泳确认PCR扩增产物的结果示于图5。
如图5所示，可以得到各个菌种所预期大小的扩增产物。即，这证实各个引物可以不相互干涉地扩增目的菌的DnaJ基因的特定序列。
实施例4
(弧菌属(Vibrio)细菌中的DnaJ基因扩增的检测灵敏度和特异性扩增)
使用实施例3中制备的引物溶液，与使用用粪便稀释的样品比较霍乱弧菌(Vibrio cholerae)GTC 0037株的检测灵敏度。将霍乱弧菌(Vibrio cholerae)GTC 0037株的菌液与生理盐水及10％的粪便混悬液混合，用酚-氯仿法提取DNA。连续稀释提取的核酸，代替实施例3的PCR反应溶液中的DNA，使用该核酸实施PCR反应，用电泳法比较基因扩增的灵敏度。结果示于图6。
如图6所示，定量稀释DNA，测定检测灵敏度，在图中所示的检测水平检测到扩增产物。另外，将霍乱弧菌的DNA与从正常人的粪便中提取得到的DNA混合，测定检测灵敏度，其结果证实检测灵敏度达到与用蒸馏水进行稀释时相同的水平。由以上可知，该引物溶液中的各引物组即使在来自粪便的夹杂物的存在下，也可以特异性地扩增各目的菌种的DnaJ基因的特定区域，并且可以高灵敏度检测菌种。
实施例5
(性病的病原菌种的DnaJ基因的扩增及鉴定)
混合基于性病诊断中使用的菌种的DnaJ基因的特定区域而设计的引物，制备引物溶液。
Mycoplasma genitarium用引物(SEQ ID NO：71、72)
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)用引物(SEQ ID NO：75、76)
淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoae)用引物(SEQ ID NO：79、80)
这里，对于以下菌种，基于不是DnaJ基因的基因的特定区域设计引物。
尿素支原体(Ureaplasma spp.)用引物(Tuf基因)
SEQ ID NO：147：GGATGGTGCAATCTTAGTTATT
SEQ ID NO：148：ACTTGACGCGCTAATAGG
苍白密螺旋体(Treponema pallidum)用引物(16S rDNA基因)
SEQ ID NO：149：TGGGGATAGCCTCTAGAAATAG
SEQ ID NO：150：CCCTTTCCTCTCAAAGACCT
单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)用引物(糖蛋白(Glycoprotein)B蛋白基因)
SEQ ID NO：151：CTGGTCAGCTTTCGGTACG
SEQ ID NO：152：CCGCAGCTCGTTGTTCTC
乳头瘤病毒(Papilloma virus)用引物(蛋白E6基因)
SEQ ID NO：153：TCAAAAGCCACTGTGTCCT
SEQ ID NO：154：CGACCCCTTATATTATGGAATCTT
白色念珠菌(Candida albicans)用引物(26S rDNA基因)
SEQ ID NO：155：TCAGTAGCGGCGAGTGAA
SEQ ID NO：156：GCCCAAAGATACCTTCTTCAAAT
阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)用引物(18S rDNA基因)
SEQ ID NO：157：GAAATCATAGTTCTTGGGCTCTG
SEQ ID NO：158：CCTTCCGTCAATTCCTTCAAG
将上述各引物按下述要点进行混合，制备PCR反应溶液。
引物溶液(各引物1μM)                 ：2μl
2×CYBER预混合Hotstart Ex Taq(Takara)：10μl
各菌株的DNA                          ：5ng
加水使总量为20μl。
在各个Light Cycler(罗氏公司)用的毛细管中加入上述PCR溶液连同试剂，用Light Cycler进行基因扩增(95℃：1秒钟，55℃：1秒钟，72℃：10秒钟，进行50个循环)。该实验中使用下述菌株。通过CYBR绿色荧光强度的增加监测Light Cycler(罗氏公司)的毛细管中扩增的DNA，结果示于图7。
[所使用的菌株]
1Mycoplasma genitarium GGS 2289(来自临床样品的克隆)
2沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)GGS 922(来自临床样品的克隆)
3淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoae)GTC 02085(＝ATCC49226)
4，尿素支原体(Ureaplasma spp.)GGS 1699(来自临床样品的克隆)
5苍白密螺旋体(Treponema pallidum)GGS 745(来自临床样品的克隆)
6单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus)GGS 1943(来自临床样品的克隆)
7乳头瘤病毒(Papilloma virus)GGS 1944(来自临床样品的克隆)
8白色念珠菌(Candida albicans) GTC 00654(＝IFM 5801)
9阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)GGS 1941(来自临床样品的克隆)
GTC：岐阜典型培养物保藏中心
GGS：岐阜重组株保藏中心
ATCC：美国典型培养物保藏中心，美国
NCTC：英国国家典型培养物保藏中心，英国
IFM：致病真菌与微生物毒素症研究中心，千叶大学)
如图7所示，扩增了各菌株的DNA。即，可知这各个引物可以不相互干涉地扩增目的菌的DnaJ基因的特定序列。
实施例6
(肺炎和咽炎的病原体菌种的DnaJ基因的扩增及鉴定)
将基于引起肺炎和咽炎的病原体菌种的DnaJ基因的特定区域而设计的引物混合在一起，制备引物溶液。
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)用引物(SEQ ID NO：9、10)
化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)用引物(SEQ ID NO：1、2)
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)用引物(SEQ ID NO：13、14)
肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)用引物(SEQ ID NO：17、18)
大肠杆菌(Escherichia coli)用引物(SEQ ID NO：21、22)
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)用引物(SEQ ID NO：25、26)
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)用引物(SEQ ID NO：39、40)
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)用引物(SEQ ID NO：35、36)
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)用引物(SEQ ID NO：31、32)
分枝杆菌属(Mycobacterium)组用引物(SEQ ID NO：29、30)
[所使用的菌株]
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)GTC 01147(＝NCTC 7465)
化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)GTC 01839
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)GTC 02805
肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)GTC 00107(＝NCTC9633)
大肠杆菌(Escherichia coli)GTC 09975(＝ATCC 25868)
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)GTC 12850(＝ATCC27294)
肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)ATCC VR 145
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)GTC 00702(＝ATCC 33737)
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)GTC 00666(-ATCC 15531)
鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)GTC 00603(＝ATCC 25291)
GTC：岐阜典型培养物保藏中心
GGS：岐阜重组株保藏中心
ATCC：美国典型培养物保藏中心，美国
NCTC：英国国家典型培养物保藏中心，英国
IFM：致病真菌与微生物毒素症研究中心，千叶大学)
将上述各引物按下述要点进行混合，制备PCR反应溶液。
引物溶液(各引物1μM)                 ：2μl
2×CYBER预混合Hotstart Ex Taq(Takara)：10μl
各菌株的DNA                          ：5ng
加水使总量为20μl。
在各个Light Cycler(罗氏公司)用的毛细管中加入试剂，用LightCycler对上述PCR反应溶液进行基因扩增(95℃：1秒钟、55℃：1秒钟、72℃：10秒钟，进行50循环)。该实验中使用上述菌株DNA。用琼脂电泳确认PCR扩增产物，其结果，可知，这些引物对可以分别特异性地扩增目的菌种的DnaJ基因的特定区域，并且可以高灵敏度地检测菌种。
实施例7
(分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌的菌种的DnaJ基因的扩增及通过测序进行的鉴定)
用Primer working法对分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌55个菌种3个亚种的标准株的DnaJ基因的几乎整个区域进行测序(示于图8)，并且将利用SEQ ID NO：29、30、131、132及133获得的386bp的扩增序列和几乎整个区域的188bp二者来比较序列。将其结果与已分析了的既有基因RpoB进行比较。结果示于图9和10。
如图9和10所示，对于16S rDNA序列平均相似性为96.6％的，dnaJ基因序列平均相似性为80.7％，相比rpoB、hsp65的相应值90.0～90.7％的相似性，多态性最高。
另外，堪萨斯氏分枝杆菌-胃分枝杆菌(M.kansasii-M.gastri)的16SrDNA序列的相似性为100％，不能区别开来(图11)，比较DnaJ基因时，堪萨斯氏分枝杆菌-胃分枝杆菌(M.kansasii-M.gastri)具有95.5％的相似性。因此，基于生化特性，用上述SEQ ID NO：29、30、131、132及133扩增23个堪萨斯氏分枝杆菌(M.kansasii)(20株)和胃分枝杆菌(M.gastri)(2株)的临床分离株(KPM号株)，使用已经测序的所有标准株的序列，制作系统发生树。其结果，如图12所示，所有的株与用生化特性进行鉴定的结果相同。
另外，由于鸟分枝杆菌(M.avium)与胞内分枝杆菌(M.intracellulare)的生化特性相似，难以识别，因此，与统称为鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌(M.avium-M.intracellulae)组(MAC组)的16株临床分离株(图中的KPM株)进行类似的测定序列并进行比较。其结果示于图13。
如图13所示，9株为鸟分枝杆菌(M.avium)，3株为胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，3株被鉴定为新分类的M.chimaera、1株被鉴定为淋巴结核分枝杆菌(M.scrofulaceum)。由以上可知，以该全部碱基序列及部分序列进行鉴定的方法对于以生化特性不能识别的菌群的正确鉴定是有效的。
实施例8
本实施例中，以嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)GTC1279DNA作为靶核酸，实施多重PCR。作为引物，准备18组带有标记的退火引物的混合物(正向引物(SEQ ID NO：1～18)及反向引物(SEQID NO：19～36)(均带有标记)各最终浓度为0.1μM)和具有与这些退火引物带有的各个标记相同的序列的扩增引物组的混合物(含有正向引物(SEQ ID NO：37)及反向引物(SEQ ID NO：38)(均仅为标签)各最终浓度为0.1μM)。这些引物的序列示于图15。
使用这些引物混合液及DNA溶液(嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)GTC 1279DNA 1μg/ml)，按照以下组成制备PCR反应溶液，使用Light Cycler(罗氏公司)，按照以下条件实施PCR反应。作为比较例，制备含有将从上述18种引物组的正向引物中5’末端除去18碱基的标记序列的退火引物、和从反向引物的5’末端除去了27碱基的标记序列的退火引物的没有标签的退火引物的混合液(正向引物及反向引物(均没有标签)各最终浓度为0.1μM)，按照以下组成制备PCR反应溶液，与实施例同样操作进行PCR。扩增监测结果示于图16。
(实施例8的PCR反应溶液的组成)
2×SYBR预混合Ex Taq(Takara)                          ：10μl
引物混合液(正向引物、反向引物各1μM)                 ：2μl
扩增引物混合液(正向引物、反向引物各10μM)            ：2μl
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)GTC 1279DNA(1ng/ml)：1μl
dH₂O                                                 ：5μl
总量                                                 ：20μl
(比较例的PCR反应溶液的组成)
2×SYBR预混合Ex Taq(Takara)                          ：10μl
引物混合液(正向引物、反向引物各1μM)                 ：2μl
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)GTC 1279DNA(1ng/ml)：1μl
dH₂O                                                 ：7μl
总量                                                 ：20μl
(反应条件)
95℃：1秒钟，60℃：1秒钟，72℃：5秒钟  60个循环
如图16所示，利用实施例8的带标签的引物组和扩增引物组，对嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)GTC 1279DNA而言，在大约35循环后扩增信号开始增加，在40大约循环后表现出良好的检测灵敏度。相对于此，在未使用扩增引物的比较例中，即使50循环后，靶核酸也完全不扩增。由以上可知，通过使用具有选择性退火到靶核酸的退火序列的退火引物和标记序列和具有与该退火引物的标记序列相同的标记序列的扩增用引物，即使使用多种引物组，也可以充分地扩增特定的靶核酸。
实施例9
本实施例中，使实施例8中制作的带标记的退火引物与扩增引物的配合比率如表2所示在1∶1～1∶50内进行变化，在如以下所示制备PCR反应溶液的同时按照以下条件实施PCR。这里，作为靶核酸，使用肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)GTC 2987DNA。作为比较例，使用现有技术的单独的引物溶液(4μm、8μM)，按照以下组成制备PCR反应溶液，在与实施例相同的条件下实施PCR。结果示于图17。这里，单独的引物是从肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)16S rDNA的正向引物及反向引物中除去标记序列后的序列。
表2
引物  混合物                                    混合比率
No.1  退火0.5μM∶2μl  扩增标记(0.5μM)2μl    1∶1
No.2  退火0.5μM∶2μl  扩增标记(2.5μM)2μl    1∶5
No.3  退火0.5μM∶2μl  扩增标记(5μM)2μl      1∶10
No.4  退火0.5μM∶2μl  扩增标记(10μM)2μl     1∶20
No.5  退火0.5μM∶2μl  扩增标记(20μM)2μl     1∶40
No.6  退火0.5μM∶2μl  扩增标记(25μM)2μl     1∶50
(实施例9的PCR反应溶液的组成)
2×SYBR预混合Hot Start(Takara)                      ：10μl
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)GTC 2987DNA(1ng/ml)：1μl
引物混合液                                          ：4μl
dH₂O                                                ：5μl
总量                                                ：20μl
(比较例的PCR反应溶液的组成)
2×SYBR预混合Hot Start(Takara)                      ：10μl
肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)GTC 2987DNA(1ng/ml)：1μl
单独引物*(4μM、8μM)混合液                         ：4μl
dH₂O                                                ：5μl
总量                                                ：20μl
(反应条件)
95℃：1秒钟，60℃：1秒钟，72℃：5秒钟60个循环
如图17所示，伴随着扩增引物与退火引物的比率的上升，扩增效率增大，当该比率为10倍以上时，表现出与使用0.4μM浓度的单独的引物进行扩增时相同的扩增效率。
实施例10
本实施例中，以将图18及图19所示的腹泻的细菌性病原微生物及病毒性病原体所具有的基因的指定区域作为靶核酸的退火引物和扩增引物的混合比率设定为1∶50的方式，按照以下组成制备PCR反应溶液，同时在以下反应条件下实施PCR。实施PCR后，使PCR产物与装载有图20所示的探针的硅片(东洋钢板制)在55℃下杂交30分钟。杂交后，洗涤硅片，用激光扫描Scan Array 4000(GSI Lumonics社制)测定Cye5的荧光强度。结果示于图21。这里，图21还表示出了点化的探针的位置信息。
(实施例10的PCR反应溶液的组成)
2×SYBR预混合Hot Start(Takara)              ：10μl
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)DNA(1ng/ml)        ：1μl
腺病毒(Adenovirus)DNA(1ng/ml)   ：1μl
退火引物混合液(各0.2μM)        ：2μl
扩增引物混合液(各10μM)         ：2μl
dH₂O                            ：4μl
总量                            ：20μl
(反应条件)
95℃：1秒钟，60℃：1秒钟，72℃：5秒钟60个循环
如图21所示，即使包含49种退火引物组，也可以分别特异性良好且灵敏度良好地检测2种靶核酸。
实施例11
本实施例中，制备图22所示的16种性病(STD)用退火引物组的混合物(各引物最终浓度0.02μM)及扩增引物组混合液(各10μM)，如以下所示，以扩增引物与退火引物的比率为20的方式，按以下组成制备PCR反应溶液，按照以下条件实施PCR。扩增反应后，向PCR产物加入结合有图23所示的探针的Luminax公司的荧光珠及抗生蛋白链菌素-藻红蛋白(Streptavidin-phycoerythrin)，并在室温下反应30分钟，用Luminax公司的Luminax 100荧光测定系统测定荧光强度。结果示于图24。
如图24所示，PCR反应溶液中所含的唯一的靶核酸与Chlamydiatoracomatis的探针以高特异性结合。由以上可知，PCR产物中，该靶核酸特异性地扩增。
实施例12
本实施例中，制备图25所示的4种引物混合物。图25所示并在本实施例中使用的各引物为具有已提及的序列的引物。使引物PCR反应溶液中包含图25所示的各菌种的DNA各200pg/ml、各退火引物0.075μM、各扩增引物0.8μM、16S rDNA通用引物0.2μM。这里，DNA聚合酶使用SYBR预混合Hot Start(TaKaRa)。对于该PCR反应溶液，每个循环在95℃下加热1分钟后，进行95℃：1秒钟，55℃：1秒钟，72℃：10秒钟的循环50次。结果(CTm值)示于图26。这里，CTm值是达到进行一次微分时变为扩增曲线的一半峰值的荧光强度等信号时的PCR循环数。可以说CTm值越小，扩增效率越好。
如图26所示，相对于以16S rDNA基因作为靶核酸、用包含退火引物和扩增引物的引物混合物A实施PCR时CTm值为约40～46，用以16S rRNA的通用序列作为反向引物的引物混合物B实施PCR时，观察到CTm值有降低的倾向。即，以16S rRNA作为靶核酸来设计退火引物时，即使混合8种系统发生不同的菌种的引物，扩增效率与对照例相比反而也具有降低的倾向。因此，可知16S rRNA是不适合作为本发明的多重PCR的靶核酸的。
相对于此，由混合引物C及D的结果可以明确，在以DnaJ基因为靶核酸、使用退火引物和扩增引物时，即使存在多个其它的引物(共18种)，也可以特异性地将引物退火到靶序列而有效地扩增。因此，可知DnaJ基因作为这样的多重PCR的靶核酸是有用的。
序列表
SEQ ID NO：1～86、131、132、133、135～158、159～294及326～357：引物
SEQ ID NO：87～130、134、295～325及358～367：探针
序列表
<110>国立大学法人岐阜大学(Gifu University)
     AMR株式会社(AMR，Inc.)
<120>利用DnaJ基因的细菌检测及其应用(Detection Of Bacterium By Utilizing DnaJ and
use Thereof)
<130>SCT091067-00
<160>367
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>1
ataaggatgt tcaagaagct tacg                                       24
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>2
caccaaagcc gccttgag                                              18
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>3
ttttgaagag gctgtatttg g                        21
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>4
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<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>5
gcttatgaaa ccttgagtga tac                      23
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>6
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<210>7
<211>20
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<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>7
ggagatgacc tacaatatcg                      20
<210>8
<211>18
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<213>Artificial
<220>
<223>primer
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ggctagtacc tggcttag                        18
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>9
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<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>10
accagctcca ccaaaacc                        18
<210>11
<211>18
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<213>Artificial
<220>
<223>primer
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<210>12
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>12
tgtacgacag ccagcttc                            18
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<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
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<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>14
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<210>15
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<213>Artificial
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<400>15
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<210>16
<211>22
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<213>Artificial
<220>
<223>primer
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<210>17
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>primer
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<211>18
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<220>
<223>primer
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<210>19
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<212>DNA
<213>Artificial
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<223>primer
<400>19
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<210>20
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
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<212>DNA
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<210>24
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<212>DNA
<213>Artificial
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<213>Artificial
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<400>25
gttcgacagc ggctttgg                        18
<210>26
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<212>DNA
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<220>
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<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>28
acttccgata ggcacgttt                        19
<210>29
<211>19
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<213>Artificial
<220>
<223>primer
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>inosine
<400>29
cgngartggg tygaraarg                        19
<210>30
<211>20
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<213>Artificial
<220>
<223>primer
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>inosine
<220>
<221>misc_feature
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<223>inosine
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>inosine
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(18)
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<213>Artificial
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<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>129
tgtaatggaa caggggcta                            19
<210>130
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<213>Artificial
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<223>probe
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<213>Artificial
<220>
<223>primer
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<220>
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<222>(3)..(3)
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<223>primer
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aattctaata cgactcacta tagggagctt gtatttctca gcatcattaa c    51
<210>228
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>228
aattctaata cgactcacta tagggagagc gttagttggg aacttgcatt ta    52
<210>229
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>229
aattctaata cgactcacta tagggagaac cacactaact acttgctaa        49
<210>230
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>230
aattctaata cgactcacta tagggagctc ctgatgaaat agtctgtaat g    51
<210>231
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>231
aattctaata cgactcacta tagggagcag ttatctgaca ttctggttg       49
<210>232
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>232
aattctaata cgactcacta tagggagctt catcactctg acagtatagg t    51
<210>233
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>233
aattctaata cgactcacta tagggagagc aggattacaa cacaatt         47
<210>234
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>234
aattctaata cgactcacta tagggagttt gtagtccttc catgacac        48
<210>235
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>235
aattctaata cgactcacta tagggagtgt tttatgtatt caagagcaat      50
<210>236
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>236
aattctaata cgactcacta tagggaggta tcatttgatg ctgattctat t    51
<210>237
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>237
aattctaata cgactcacta tagggagaaa gctctctacg gaagaatcta      50
<210>238
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>238
aattctaata cgactcacta tagggaggtt caagtcctag ttttaaagga t    51
<210>239
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>239
aattctaata cgactcacta tagggaggat ttttacgcct tattttacga c    51
<210>240
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>240
aattctaata cgactcacta tagggagctt tataggacat ccctgatact t    51
<210>241
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>n is a，c，g，or t
<400>241
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<210>242
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>242
tagcaggatc cctctaagcg ctggatgcgc ttccatga   38
<210>243
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>243
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<210>244
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>244
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<210>245
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>245
tagcaggatc cctctaagca atgtttaggt ggatgag    37
<210>246
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>246
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<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>247
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<210>248
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>248
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<210>249
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>249
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<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>250
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<210>251
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>251
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<210>252
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>252
tagcaggatc cctctaagtt ttccagcaac ttyatgt     37
<210>253
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>253
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<210>254
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>254
tagcaggatc cctctaaggc agtctttcgt acttttgct    39
<210>255
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>255
tagcaggatc cctctaaggc tagtgtgacc acrctacct    39
<210>256
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>256
tagcaggatc cctctaaggc tagtgtgacc acgctccct    39
<210>257
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>257
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<210>258
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>258
tagcaggatc cctctaagac caactttggc cagctttcct    40
<210>259
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>259
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<210>260
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>260
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<210>261
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>261
tagcaggatc cctctaagra gaagtgtgat ggctagcaag t    41
<210>262
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>262
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<210>263
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>263
tagcaggatc cctctaaggg stataaaatg gcttcgctca t    41
<210>264
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>264
tagcaggatc cctctaaggg ctataaaatg ckttcgctca t    41
<210>265
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>265
tagcaggatc cctctaaggg ctataaaatg gcttctctta t    41
<210>266
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>266
tagcaggatc cctctaaggt agagatcgat ggcgtctt        38
<210>267
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>267
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<210>268
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>268
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<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>269
aattctaata cgactcacta tagggagtcg acgccatctt cattcaca    48
<210>270
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>270
aattctaata cgactcacta tagggagtca tcagaatgat tgtaatttgc  50
<210>271
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>271
aattctaata cgactcacta tagggagtca tcagagtgat tgtaatttgc   50
<210>272
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>272
aattctaata cgactcacta tagggagtat tacmaggtgt caaattac     48
<210>273
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>273
aattctaata cgactcacta tagggagtgt tgccaggtgt caaattac     48
<210>274
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>274
aattctaata cgactcacta tagggagtgt  tcccgggtgt cagattcc    48
<210>275
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>275
aattctaata cgactcacta tagggagcct cgatgacgcc gcggt     45
<210>276
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>276
aattctaata cgactcacta tagggagcct cgatgatgcc gcggt     45
<210>277
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>277
aattctaata cgactcacta tagggagtac tgggcttctc gaagta    46
<210>278
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>278
aattctaata cgactcacta tagggagtac tgggtttctc gaagta    46
<210>279
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>279
aattctaata cgactcacta tagggagagc agtgtacggg ttaatgtt    48
<210>280
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>280
aattctaata cgactcacta tagggagtgc agtgtagggg ttaatgcgt    49
<210>281
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>281
aattctaata cgactcacta tagggagtgc ggtgtaggga ttgatgcgt    49
<210>282
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>282
aattctaata cgactcacta tagggagcca ggctttgaag ttgccgaa      48
<210>283
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>283
aattctaata cgactcacta tagggagaaa ttaatacgat tggatcaga     49
<210>284
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>284
aattctaata cgactcacta tagggagaaa ttgaaaatat  tggatacgc    49
<210>285
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>285
aattctaata cgactcacta tagggagaat agagcagatt ggatcaga      48
<210>286
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>286
aattctaata cgactcacta tagggagtct gayccaattt gctctattt    49
<210>287
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>287
aattctaata cgactcacta tagggagtcc gatccaatct gttctattt    49
<210>288
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>288
aattctaata cgactcacta tagggagtct gatccaattg ttttaattt    49
<210>289
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>289
aattctaata cgactcacta tagggagtct gatccaatct gctctattt    49
<210>290
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>290
aattctaata cgactcacta tagggagtcc gatccaatct gttctattt    49
<210>291
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>291
aattctaata cgactcacta tagggaggtt gatccaatct cttgtatct    49
<210>292
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>292
aattctaata cgactcacta tagggagttc ctgcatccac atagtct      47
<210>293
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>293
aattctaata cgactcacta tagggagaga ctatgtggat gcaggaa    47
<210>294
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer
<400>294
aattctaata cgactcacta tagggagtgg tatttttgac cttagc     46
<210>295
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>295
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tgcgcgattg gatatgccca ggtg       44
<210>296
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>296
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttcgcgattg gatgaaccca ggtg       44
<210>297
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>297
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa taataccaaa tacgacccat gagg      44
<210>298
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>298
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tggaggaagg agaagtcgta ac        42
<210>299
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>299
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa acctgatcca tcgcaagcgt cacagt    46
<210>300
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>300
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa accgctaccg tcacaagagt cacagt    46
<210>301
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>301
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<210>302
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>302
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<210>303
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>303
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<210>304
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>304
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<210>305
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>305
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<210>306
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>306
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<210>307
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>307
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gttatactga attgccatca tcagg         45
<210>308
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>308
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agattaaggc tgataaaaca acagc       45
<210>309
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>309
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa sctcaggatg ctaaaccagt agag        44
<210>310
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>310
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atccagttat  gcatcgtgca tatggt     46
<210>311
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>311
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa acattttgta tggataggtg gagaagtc    48
<210>312
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>312
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atgcattttt gataaacaca ttgaaa    46
<210>313
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>313
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tcaataagag caatgatttg atcaac    46
<210>314
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>314
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gttcatttgg agaatttgaa gata      44
<210>315
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>315
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atgctgttcg atgatatttt gcac    44
<210>316
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>316
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gagaacttgg tattggtctt aat      43
<210>317
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>317
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gcacttggga gggggatcgc gatct    45
<210>318
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>318
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tctacatttg gattggtttc tattc    45
<210>319
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>probe
<400>319
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa tctacattcg gattggtttc tattc    45
<210>320
<211>45
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