用于定量测定小而密LDL的试剂 【技术领域】
本发明涉及用于测定小而密脂蛋白(LDL)中胆固醇的试剂，这对于动脉硬化的诊断是重要的。
背景技术
低密度脂蛋白(LDL)在血液中的胆固醇运输中起主要作用并且是动脉硬化的危险因素。已知小而密的脂蛋白(小而密LDL(小颗粒低密度脂蛋白))，其在LDL中粒度特别小，与标准LDL相比，其比重更高，具有以高于标准LDL几倍的水平引发动脉硬化的能力。小而密LDL的增加是动脉硬化的主要危险因素之一，因此在临床上对该小而密LDL进行分级测定是很非常重要的。
用于小而密LDL的常规测量的方法的例子包括超速离心方法、电泳方法、以及使用高效液相色谱的方法。然而，由于这些方法需要昂贵的设备和大量的测量时间，因此并不方便。
一种利用自动分析仪测量小而密LDL的方法例子是以下方法(参见日本专利公布(Kokai)号2003-28882A)，该方法涉及利用在离子强度方面的差异，将小而密LDL混合并悬浮或溶解，然后利用在吸光度方面的差异测量小而密LDL。然而，根据该方法，在吸光度方面差异是基于浊度进行测量的，因此特异性和准确度不足。
此外，已知一种方法(参见WO2004/053500)，该方法涉及通过使用分离剂的组合(其包括聚阴离子和二价阳离子以及适合于自动分析仪的试剂)来测量小而密LDL中的胆固醇或甘油三酸酯。该方法能够比超速离心方法或电泳方法更方便地测量小而密LDL中的脂质成分。此外，该方法的特异性和准确度极好，但是该方法需要预处理试样并需要将小而密LDL从除这种LDL之外的LDL中分离出来的步骤。
本发明公开
本发明要达到的目的
本发明的一个目的是提供一种用于无需预处理试样的分级测量小而密LDL的试剂，其适用于迅速而方便的自动分析仪。
达到该目的的方法
作为追求该目的而集中研究的结果，本发明人发现，当利用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶测量含各种脂蛋白的试样中的胆固醇时，酶和小而密LDL的反应速率与该相同的酶和除小而密LDL之外的脂蛋白的反应速率相比能够被改变。这种改变是通过以特定浓度使用特定表面活性剂来达到的，所以除小而密LDL之外的脂蛋白能够被导向反应系统之外。当具有特定浓度的表面活性剂被用于自动分析仪的试剂的第一步中时，与小而密LDL的酶反应速率被降低，并且小而密LDL与酶之间的反应被延迟了。同时，上述具有特定浓度的特定表面活性剂作用于除小而密LDL之外的脂蛋白，所以导致该脂蛋白与酶反应并因此能够将其导向反应系统之外。本发明人此外还已发现酶与除小而密LDL之外的脂蛋白的反应速率增加，同时胆固醇酯酶与小而密LDL的反应速率被降低了，并且酶反应由于指定酶的浓度而被延迟了。通过在如上所述第一步中将除小而密LDL之外的脂蛋白导向反应系统之外，然后在第二步中使剩余的小而密LDL与酶反应，本发明人已经在测量小而密LDL中的胆固醇方面取得了成功，因此本发明人已经完成了本发明。
本发明如下所述。
[1]一种用于定量测定试样中小而密LDL中胆固醇的方法，该方法包括：第一步：在胆固醇酯酶和0.05g/L-1.0g/L的表面活性剂(该表面活性剂作用于除小而密LDL外的脂蛋白)的存在下消除试样中除小而密LDL之外的脂蛋白；以及第二步：定量测定在第一步之后剩余的小而密LDL中的胆固醇。
[2]根据[1]所述地用于定量测定小而密LDL中胆固醇的方法，其中在第一步中，作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂是一种选自以下的非离子型表面活性剂：聚氧化乙烯烷基醚、聚氧化乙烯烷基苯基醚、聚氧化乙烯烷基胺和烷氧基化月桂醇；一种选自以下的阴离子型表面活性剂：聚氧化乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、酰胺醚硫酸盐、烷基牛磺酸盐和磷酸盐型表面活性剂；一种选自以下的阳离子型表面活性剂：烷基甲基铵盐、季铵盐和单线性烷基型表面活性剂或选自以下的两性表面活性剂：月桂基甜菜碱、二甲基烷基甜菜碱、酰胺甜菜碱型表面活性剂、咪唑啉型表面活性剂，以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠。
[3]根据[1]或[2]所述的用于定量测定小而密LDL中胆固醇的方法，其中在第一步中采用的胆固醇酯酶的浓度范围为0.6U/mL-3.0U/mL。
[4]根据[1]-[3]中任一项所述的用于定量测定小而密LDL中胆固醇的方法，其中在第一步中还添加胆固醇氧化酶和过氧化氢酶。
[5]根据[1]-[3]中任一项所述的用于定量测定小而密LDL中胆固醇的方法，其中在第一步中还添加胆固醇氧化酶和4-氨基安替比林。
[6]根据[1]-[5]中任一项所述的用于定量测定试样中小而密LDL中胆固醇的方法，其中在第二步中在至少作用于小而密LDL的表面活性剂的存在下添加用于胆固醇测量的酶。
[7]根据[6]所述的用于定量测定小而密LDL中胆固醇的方法，其中在第二步中采用的至少作用于小而密LDL的表面活性剂是作用于所有脂蛋白的表面活性剂。
[8]根据[6]或[7]所述的用于定量测定小而密LDL中胆固醇的方法，其中在第二步中采用的至少作用于小而密LDL的表面活性剂是聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物、或聚氧化烯衍生物。
[9]根据[6]-[8]中任一项所述的用于定量测定小而密LDL中胆固醇的方法，其中在第二步中采用的至少作用于小而密LDL的表面活性剂是在脂蛋白脂肪酶的存在下被使用的。
[10]一种用于消除试样中除小而密LDL之外的脂蛋白的试剂，其包括胆固醇酯酶和0.05g/L-1.0g/L的作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂的组合。
[11]根据[10]所述的用于消除除小而密LDL之外的脂蛋白的试剂，其中所述胆固醇酯酶的浓度范围为0.6U/mL-3.0U/mL。
[12]一种用于定量测定小而密LDL的试剂，其包括胆固醇酯酶、0.05g/L-1.0g/L的作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂以及聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物、或聚氧化烯衍生物的组合。
[13]根据[12]所述的用于定量测定小而密LDL的试剂，其包括第一试剂组合物和第二试剂组合物，其中所述第一试剂组合物包括胆固醇酯酶和0.05g/L-1.0g/L的作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂，并且所述的第二试剂组合物包括聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物、或聚氧化烯衍生物。
本发明的效果
通过将含有本发明的特定表面活性剂的试剂加入含有脂蛋白的试样中，在没有利用过滤器或离心过滤进行分离的情况下，能够直接并且选择性地测量脂蛋白中的小而密LDL。
本说明书包括日本专利申请号2007-49533的说明书和/或附图所公开的部分或全部内容，它是本申请的优先权文件。
附图的简要说明
图1示出了在实施例1中在第一试剂反应中各脂蛋白的反应性，使得在引起小而密LDL选择性地作用之前，在除小而密LDL之外的脂蛋白中的胆固醇被导向反应系统之外，以便定量测定小而密LDL的胆固醇。
图2示出了在第一步中小而密LDL和大LDL关于表面活性剂浓度的反应性。
图3示出了当胆固醇酯酶的活性变化时，大颗粒LDL和小而密LDL的反应性。
实施本发明的最佳方式
本发明将被详细说明如下。
可将脂蛋白粗略分级为VLDL、LDL和HDL。进一步将LDL分级为小而密LDL及其它亚级分。小而密LDL也被称为小颗粒LDL、SLDL(小LDL)、致密性LDL、或sd LDL。除它们之外的LDL也可被称为LLDL(大LDL)或轻LDL。根据粒度或比重，可将这些级分与亚级分区别开。VLDL的粒度(或粒径)范围为30nm-80nm(30nm-75nm)，LDL的粒度(或粒径)范围为22nm-28nm(19nm-30nm)，而HDL的粒度(或粒径)范围为7nm-10nm，虽然该数字可随研究人员的变化而变化。VLDL的比重为1.006或更小，LDL的比重范围为1.019-1.063，而HDL比重范围为1.063-1.21。LDL颗粒的直径可通过梯度凝胶电泳(GGE)(JAMA，260，p.1917-21，1988)或NMR(脂蛋白测试手册，第二版，编者Nader Rifai等人，HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTINGsecond Edition，Edited by Nader Rifai et al.p.609-623，AACC PRESS：TheFats of Life Summer 2002，LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE，Volume AVI No.3，p.15-16)进行测量。比重可根据超速离心法分析进行测量(Atherosclerosis，106，p.241-253，1994：Atherosclerosis，83，p.59，1990)。
由本发明方法测量的小而密LDL通常是LDL级分中直径范围约为22.0nm-25.5nm和比重范围为1.040-1.063的亚级分。为什么要基于粒度对LDL进行亚分级的原因是LDL中的小LDL需要分级测量，因为这种具有小粒度的LDL具有引发动脉硬化的严重倾向并且比其它LDL具有特别更高程度的恶性。LDL的直径和比重分布是连续的。因此，不可能清楚地确定比重为前述水平或更高的LDL导致了特别高程度的恶性。因此，范围为1.040-1.063的比重不是构成小而密LDL的确定特征，然而却是通过将范围为1.019-1.063的比重在中心点处分开而得到的值，这是一种已经广泛使用并且为大家所接受的方法。例如，在另一报告中，将小而密LDL在1.044-1.060的范围内分级(Atherosclerosis：106，241-253，1994)。关于如何设定小而密LDL的比重范围，在研究人员中有一些不同。在所有情形中，当利用该比重范围进行分级时，小而密LDL的存在与临床恶性相关。
在本发明中，术语“小而密LDL”是指在LDL中具有低的比重并且在临床上具有比其它LDL更高的引发动脉硬化的倾向的LDL。优选地，小而密LDL的比重高于在LDL的整个比重范围内的中心点。更优选地，小而密LDL的比重在1.040-1.063范围内。
本发明的方法通常在自动分析仪内进行。在本发明方法的第一步中，使作用于除小而密LDL之外的LDL(以下也可称为大LDL或L LDL)或其它脂蛋白例如VLDL和HDL的表面活性剂在胆固醇酯酶的存在下作用于试样，由此由于从脂蛋白释放出来而产生的胆固醇与在以下酶例如胆固醇氧化酶和胆固醇脱氢酶的存在下正在和胆固醇反应的酶反应，以将反应产物导向反应系统之外。这里，短语：“作用于...的表面活性剂”是指表面活性剂使脂蛋白降级以致脂蛋白中的胆固醇被释放出来。在“作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂”的情形中，不要求该表面活性剂从不作用于小而密LDL，但要求其主要作用于除小而密LDL的脂蛋白。例如，作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂对小而密LDL的影响低于其对除小而密LDL之外的脂蛋白的影响。
在第一步中与除小而密LDL之外的LDL(以下称为大LDL)或其它脂蛋白例如VLDL和HDL反应的表面活性剂的例子包括非离子型表面活性剂例如聚氧化乙烯烷基醚、聚氧化乙烯烷基苯基醚、聚氧化乙烯烷基胺和烷氧基化月桂醇；阴离子型表面活性剂例如聚氧化乙烯烷基醚硫酸盐、烷基硫酸盐、酰胺醚硫酸盐、烷基牛磺酸盐和磷酸盐类表面活性剂；阳离子型表面活性剂例如烷基甲基铵盐、季铵盐和单线性烷基型表面活性剂以及两性表面活性剂例如月桂基甜菜碱、二甲基烷基甜菜碱；酰胺甜菜碱型表面活性剂、咪唑啉型表面活性剂，以及烷基二氨基乙基甘氨酸钠。以上表面活性剂的具体例子包括非离子型表面活性剂例如EMULGEN 120、EMULGEN 920、EMULGEN B-66和EMULGEN A-90(Kao公司)，以及NONION HS-220、NONION HS-215、NONION K-230、NONION NS-220、NONION NS-230、NYMEEN F-215、NYMEEN L-207和ADEKA TOL LB-1520(ADEKA公司)，阴离子型表面活性剂例如EMAL 20CM、EMAL 20T、EMAL E27C和LEVENOL WX(Kao公司)，以及SUNAMIDE CF-3、SUNAMIDE CF-10、DIAPON K、DIAPON F、DIAPON K-SF、PERSOFT EF、PERSOFT EFT、PERSOFT EL、PERSOFTEP、PERSOFT EK、PERSOFT SL、POLYSTAR OMP、ADEKA COLPS-440E和TRAX K-40(ADEKA公司)，阳离子型表面活性剂例如QUARTAMIN 24P(Kao公司)、ADEKA MINE MAC-30(ADEKA公司)，以及两性表面活性剂例如AMPHITOL 24B(Kao公司)、NISSAN ANONLG、NISSAN ANON BDF-R、NISSAN ANON BF、NISSAN ANON BL、NISSAN ANON BL-SF和NISSAN ANON GLM-R-LV。当使用浓度在特定范围内的该表面活性剂时，其选择性地作用于除小而密LDL之外的脂蛋白，以便抑制胆固醇酯酶对小而密LDL中的胆固醇的作用。
指定用于将小而密LDL与其它脂蛋白区分开和用于除小而密LDL之外的脂蛋白的选择性反应的以上表面活性剂的浓度是有效的。在第一步中，以上表面活性剂的浓度优选范围为0.05g/L-1.0g/L，更优选范围为0.1g/L-0.8g/L，以及进一步优选范围为0.3g/L-0.6g/L。当在第一步中该表面活性剂的浓度为1.5g/L或更大时，该表面活性剂作用于小而密LDL，以致难于将小而密LDL与除小而密LDL之外的脂蛋白区分开。
使在第一步中由于表面活性剂的作用和与胆固醇酯酶反应而产生的脂蛋白中的胆固醇与胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶等在该酶的存在下反应。然后能够将该胆固醇导向该反应系统之外。在本发明中，短语“导向反应系统之外”是指HDL、VLDL、大LDL等等中含有的胆固醇被消除、聚集或抑制以避免其在随后的步骤中反应，例如为了防止HDL、VLDL、大LDL等等中含有的该胆固醇影响小而密LDL胆固醇的定量测定。通过将大LDL或其它脂蛋白如VLDL和HDL中的胆固醇导向反应系统之外，小而密LDL单独保留在随后的步骤中。在本发明中，将除小而密LDL之外的脂蛋白导向反应系统之外以便防止在随后步骤中检测到除小而密LDL之外的脂蛋白中的胆固醇的这种程序也可被描述为“将小而密LDL与除小而密LDL之外的脂蛋白区分开”。
在本发明中，术语“消除”是指使试样中的物质降解，然后防止降解产物在随后的步骤中被检测到。即，短语“在第一步中消除试样中除小而密LDL之外的脂蛋白”是指使试样中的除小而密LDL之外的脂蛋白降解，然后防止降解产物即来自除小而密LDL之外的脂蛋白的胆固醇在随后的第二步中被检测到。清除方法的例子包括(但不限于)以下方法：一种包括利用过氧化氢酶使过氧化氢(通过使胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶发生作用来产生)降解成水和氧的方法和一种涉及利用过氧化物酶使氢给体与过氧化氢反应的方法，以进行转化成为无色醌。
此外，通过指定在上述表面活性剂的存在下的胆固醇酯酶浓度可选择性地消除除小而密LDL之外的脂蛋白。由于在第一步中试剂中含有的胆固醇酯酶浓度增加，特别大LDL(在LDL之中)与酶的反应性提高，反应产物被导向反应系统之外；然而，小而密LDL与酶的反应性并未提高。当该浓度进一步增加时，小而密LDL与酶的反应性提高。因此，采用一定浓度的胆固醇酯酶，使大LDL对于该酶的反应性提高并且小而密LDL对于该酶的反应性降低，使得选择性测量小而密LDL成为可能。因此，通过指定胆固醇酯酶的浓度，能够更有选择性地测量小而密LDL。在第一步中，反应系统内胆固醇酯酶浓度的优选范围为0.6U/mL-3.0U/mL，更优选范围为0.9U/mL-2.4U/mL，特别优选范围为1.2U/mL-1.5U/mL。对于本发明中所采用的胆固醇酯酶没有特别的限制，只要它是可水解胆固醇酯的酶。动物或微生物衍生的胆固醇酯酶能够被采用。
对于在此使用的胆固醇氧化酶没有特别的限制，只要它是能够将胆固醇氧化的酶。动物或微生物衍生的胆固醇氧化酶是能够采用的。胆固醇氧化酶浓度的优选范围为0.01U/mL-20U/mL，并且特别优选范围为0.1U/mL-1U/mL。
对于在此使用的胆固醇脱氢酶没有特别的限制，只要它是能够将胆固醇氧化以使氧化型辅酶减少的酶。动物或微生物衍生的胆固醇脱氢酶能够被采用。胆固醇脱氢酶浓度的优选范围为0.01U/mL-200U/mL，并且特别优选范围为0.1U/mL-100U/mL。
另外，为了调节对于各种脂蛋白的作用，在第一步中也可任意地将脂蛋白酶加入反应溶液中。作为这种脂蛋白酶，可采用磷脂酶或脂蛋白脂肪酶。
作为磷脂酶，可采用磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D、溶血磷脂酶等等，其浓度优选范围为0.01U/mL-10U/mL，更优选范围为0.01U/mLto 5U/mL，并且特别优选范围为0.01U/mL-1U/mL。
对于将要在此使用的脂蛋白脂肪酶没有特别的限制，只要它是能够使脂蛋白降解的酶。动物或微生物衍生的脂蛋白脂肪酶是能够采用的。在此使用的这种脂蛋白脂肪酶浓度的优选范围为0.01U/mL-10U/mL，更优选范围为0.01U/mL-5U/mL，并且特别优选范围为0.1U/mL-1U/mL。
在本发明的第二步中，在第一步中定量测定了未反应的小而密LDL中的胆固醇量。为了定量测定第一步中残留的未反应的小而密LDL中的胆固醇，可采用用于定量测定的常规方法。该方法的例子包括以下方法：一种涉及添加LDL凝结剂并然后通过比浊测定来定量测定由此形成的LDL-特异性聚集体含量的方法、一种包括具有LDL-特异性抗体的抗原抗体反应的方法以及一种包括利用酶定量测定降解产物的方法。在这些方法中，此处优选的方法涉及加入用于胆固醇测量的酶，例如胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶并且然后定量测定反应产物。将至少作用于小而密LDL的表面活性剂用于小而密LDL中的胆固醇的定量测定中。至少作用于小而密LDL的这种表面活性剂可以是只作用于小而密LDL的表面活性剂、也作用于除小而密LDL之外的其它脂蛋白的表面活性剂、或者作用于所有脂蛋白的表面活性剂。
作为与小而密LDL反应的表面活性剂，可适当地采用聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物。聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物的例子包括基于Pluronic(商标)的表面活性剂(例如BASF和ADEKA公司)例如Pluronic 17R-4、Pluronic L-64、Pluronic PE3100、Pluronic P-85、Pluronic F-88、Pluronic P-103和Pluronic F-127。
作为作用于所有脂蛋白的表面活性剂，可采用任何表面活性剂，只要其是用于所有胆固醇测量的试剂等中所采用的。该表面活性剂的优选实例是HLB值为11或更大并且小于13，优选为12或更大并且小于13的聚氧化烯衍生物。
此外，与除小而密LDL之外的LDL(此后称为大LDL)或其它脂蛋白如VLDL和HDL反应的表面活性剂可以在给定浓度或更高浓度，例如1.5g/L或更高下被使用。
在第二步中所采用的表面活性剂浓度优选范围为约0.1g/L-100g/L，并且更优选范围为约1g/L-50g/L。
当采用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶作为用于胆固醇测量的酶(与胆固醇反应)时，由酶反应而产生过氧化氢。通过利用在过氧化物酶的存在下氢给体与氢受体的偶合反应所形成的染料(有色醌)在400-700nm波长下测量可定量测定由此产生的过氧化氢。
作为氢供体化合物，优选苯胺衍生物。该苯胺衍生物的实例包括N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺基丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羟基-3-磺基丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N-(3-磺基丙基)苯胺(HALPS)和N-(3-磺基丙基)-3-甲氧基-5-苯胺(HMMPS)。在此所采用的该氢给体浓度优选最终浓度范围为0.1mmol/L-1.5mmol/L。
作为氢受体，可采用4-氨基安替比林、甲基苯并噻唑酮腙等等。
当采用胆固醇酯酶和胆固醇脱氢酶作为用于胆固醇测量的酶时，通过酶反应由NAD(P)产生NAD(P)H，可通过在330nm-400nm处测量吸光度来定量测定由此产生的NAD(P)H。
在本发明中，单价阳离子和/或二价阳离子或其盐可以被用作离子强度调节剂。添加该离子强度调节剂可促进小而密LDL与大LDL的区分。具体地，可采用氯化钠、氯化钾、氯化镁、二氯化锰、氯化钙、氯化锂、氯化铵、硫酸镁、硫酸钾、硫酸锂、硫酸铵、醋酸镁等等。在此所采用的浓度范围为0mmol/L-100mmol/L。
进行该反应的温度范围优选为2℃-45℃，更优选为25℃-40℃。
进行该反应的时间优选为1-30分钟，更优选为3-15分钟。
血清和血浆可以被用作本发明的试样，但其例子不限于此。
本发明采用的自动分析仪的例子包括TBA-120FR·200FR(Toshiba)、JCA-BM1250·1650·2250(JEOL有限公司)、HITACHI 7180·7700(Hitachi)和AU2700(OLYMPUS)。
当实施本发明的测量方法时，可将在此所采用的试剂分成多种试剂组合物。本发明所采用试剂的例子包括与除小而密LDL之外的LDL或其它脂蛋白如VLDL和HDL反应的表面活性剂，聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物，用于胆固醇测量的酶，例如胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，表面活性剂，降解过氧化氢的过氧化氢酶，用于通过偶合反应由过氧化氢形成染料的过氧化物酶，氢给体，以及缓冲剂。考虑到试剂的稳定性等，适当地将这些试剂分成不同的试剂组合物。例如，将各试剂分成两种组合物：第一试剂组合物和第二试剂组合物。第一试剂组合物可包括与除小而密LDL之外的LDL或其它脂蛋白如VLDL和HDL反应的表面活性剂、用于胆固醇测量的酶，例如胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶等等，而第二试剂组合物可包括与小而密LDL反应的表面活性剂或与所有脂蛋白反应的表面活性剂，例如聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物或其衍生物，用于提高用于胆固醇测量的这种酶的活性的表面活性剂，等等。第二试剂组合物还可包括磷脂酶或脂蛋白脂肪酶。当采用这两种试剂组合物时，将第一试剂组合物加入试样中，紧接着反应1-10分钟，并且优选为约5分钟，然后加入第二试剂组合物，紧接着反应1-10分钟，并且优选为约5分钟，可定量测定由此形成的染料。在这种情形中，第一步包括加入第一试剂组合物以使除小而密LDL之外的LDL(以下称为大LDL)或其它脂蛋白如VLDL和HDL作用于表面活性剂，用于与酶的反应。第二步包括加入第二试剂组合物以使小而密LDL作用于表面活性剂，用于与酶的反应，然后测量小而密LDL中的胆固醇。
实施例
下面将参考以下实施例来详细描述本发明，虽然本发明并不限于此。
[实施例1]
制备具有以下组成的第一试剂组合物，作为含有作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂的试剂例子。
第一试剂组合物
PIPES缓冲液(pH 7.0) 50mmol/L 胆固醇酯酶 0.6U/mL 胆固醇氧化酶 0.5U/mL 聚氧化乙烯-联苯乙烯苯基醚EMULGEN A-90 0.3g/L 牛血清白蛋白 0.5％ TOOS 2.0mmol/L 4-氨基安替比林 4.0mmol/L 过氧化物酶 12.0unit/mL
在以上试剂组合物中，EMULGEN A-90(聚氧化乙烯-联苯乙烯苯基醚)是作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂。
在该实施例中，为了揭示除小而密LDL之外的脂蛋白中的胆固醇被导向反应系统之外，该反应系统用于利用第一试剂组合物来进行定量测定，将用于形成醌染料所需的组分例如显色底物、TOOS和4-氨基安替比林以及过氧化物酶加入第一试剂组合物中，然后测量吸光度。因此，在该实施例中，在本发明测量方法的第一步中小而密LDL试剂的反应状态被证实了。
将第一试剂(300mL)加入乳糜微粒-IDL级分、小而密LDL级分、除小而密LDL之外的LDL级分和HDL级分中每一种的4μL试样中，每一种具有100mg/dL的通过超速离心方法分离的胆固醇含量，然后在37℃反应5分钟。在各时间点测量吸光度(反应时间过程)。
图1显示了结果。
如图1中所示，在该实施例中，由于表面活性剂的作用，反应组合物在反应溶液中在第一个5分钟内对乳糜微粒-IDL级分、除小而密LDL之外的LDL(大LDL)级分和HDL级分表现出高反应性，但是对于小而密LDL表现出低反应性。当对小而密LDL胆固醇进行定量测定时，在第一步(该步骤是选择性地作用于小而密LDL的反应的初始步骤)中，通过将表面活性剂(在该实施例中所采用的)和与胆固醇反应的酶等一起使用，使除小而密LDL之外的脂蛋白预先与酶反应，这使得消除胆固醇并将其导向反应系统之外成为可能。
[实施例2]
制备了第一和第二试剂组合物，每一种在第一试剂组合物中含有作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的表面活性剂，并且具有如下所示的组成。
第一试剂组合物
PIPES缓冲液(pH 7.0) 50mmol/L 胆固醇酯酶 [Asahi Kasei公司] 0.6U/mL 胆固醇氧化酶[Toyobo] 0.5U/mL 过氧化氢酶 600U/mL 聚氧化乙烯苯甲基苯基醚 0-1.2g/L 牛血清白蛋白 1.0％ TOOS 2.0mmol/L
第二试剂组合物
PIPES缓冲液(pH 7.0) 50mmol/L 聚氧化乙烯烷基苯基醚 10g/L 4-氨基安替比林 4.0mmol/L 过氧化物酶 4.0unit/mL 叠氮化钠 0.05％
在第一试剂组合物中，表面活性剂聚氧化乙烯苄基苯基醚作用于除小而密LDL之外的脂蛋白。证实了是否以0g/L-1.2g/L的浓度范围使用的聚氧化乙烯苯甲基苯基醚在各浓度下作用于小而密LDL。
此外，在第二试剂组合物中，所含有的浓度高达10g/L的聚氧化乙烯烷基苯基醚对小而密LDL起作用。
将第一试剂组合物(300mL)加入通过超速离心法分离的胆固醇含量为100mg/dL的小而密LDL级分或大LDL级分中，紧接着在37℃反应5分钟(第一步)。在第一步之后，加入100μL的第二试剂组合物，然后反应5分钟(第二步)，然后在600nm测量吸光度。采用LDL-EXN“SEIKEN”作为与小而密LDL和大LDL两者反应的对照试剂。
图2显示了结果。
当加入低浓度的表面活性剂时(图2)，所得的小而密LDL的吸光度高于大LDL的吸光度。随着表面活性剂浓度的增大，大LDL的吸光度也增大，并且所吸收的小而密LDL的量与所吸收的大LDL量之间的差值减小。该结果提示，当表面活性剂的浓度低时，在第一步中除小而密LDL之外的脂蛋白被导向反应系统之外，允许对小而密LDL进行精确测量。如实施例1中所述，当在本发明方法的第一步中采用低浓度的表面活性剂时，大LDL被选择性地消除并然后被导向反应系统之外，但小而密LDL不是这样。当表面活性剂的浓度增大时，被消除的大LDL量减少直至其等量于小而密LDL。结果，通过在第一步中采用浓度优选范围为0.05g/L-0.9g/L、更优选范围为0.3g/L-0.6g/L的表面活性剂，能够选择性地测量小而密LDL中的胆固醇。
[实施例3]
制备了第一和第二试剂组合物，在第一试剂组合物中含有作用于除小而密LDL之外的脂蛋白的各种表面活性剂，并且具有如下所示的组成。
第一试剂组合物
PIPES缓冲液(pH 7.0) 50mmol/L 胆固醇酯酶 [Asahi Kasei公司] 1.2U/mL 胆固醇氧化酶[Toyobo] 0.5U/mL 过氧化氢酶 600U/mL 各种表面活性剂 0.3g/L or 0.6g/L 牛血清白蛋白 1.0％ TOOS 2.0mmol/L
第二试剂组合物
PIPES缓冲液(pH 7.0) 50mmol/L 聚氧化乙烯烷基苯基醚 10g/L 4-氨基安替比林 4.0mmol/L 过氧化物酶 4.0unit/mL 叠氮化钠 0.05％
将第一试剂组合物(300μL)加入通过超速离心法分离的胆固醇含量为100mg/dL的小而密LDL级分或大LDL级分中，紧接着在37℃反应5分钟(第一步)。在第一步后，加入100μL的第二试剂组合物，然后反应5分钟(第二步)，然后在600nm处测量吸光度。采用LDL-EXN“SEIKEN”作为与小而密LDL和大LDL两者反应的对照试剂。
第一试剂组合物中含有的各种表面活性剂和结果被示于表1中。当在第一步中表面活性剂特异性地作用于大LDL并然后被导向反应系统之外时，如表1所示，大LDL的吸光度减小。此外，当在第一步中表面活性剂对小而密LDL不起作用时，如表1所示，小而密LDL的吸光度增大。
如表1中所示，在该实施例中所采用的表面活性剂在第一步中特异性地作用于大LDL，将大LDL导向反应系统之外，使得小而密LDL被选择性地测量。
表1显示了当采用各种表面活性剂时，对于小而密LDL或大LDL的反应性。
表1
在第一步中 表面活性剂 的浓度(g/L) 小而密 LDL (mAbs) 大LDL (mAbs) sdLDL/L LDL％ 组合物 LDL-EXN - 71.5 71.6 100％ EMULGEN 120 0.3 58.8 41.2 143％ 聚氧化乙烯月桂基醚 EMULGEN 920 0.3 37.8 18.8 201％ 聚氧化乙烯壬基苯基醚 EMULGEN B66 0.3 34.9 14.2 246％ 聚氧化乙烯三苄基苯基醚 EMULGEN A90 0.3 57.8 31.5 183％ 聚氧化乙烯联苯乙烯苯基 醚 NONION HS215 0.3 33.8 17.6 192％ 聚氧化乙烯辛基苯基醚 NONION 0.6 55.7 32.6 171％ 聚氧化乙烯辛基苯基醚
HS-220 NONION K230 0.3 56.9 41.7 136％ 聚氧化乙烯月桂基醚 NONION NS220 0.3 34.5 18.0 192％ 聚氧化乙烯壬基苯基醚 NONION NS230 0.6 62.0 40.3 154％ 聚氧化乙烯壬基苯基醚 NYMEEN L-207 0.3 62.9 51.6 122％ 聚氧化乙烯十二烷基胺 NYMEEN F215 0.3 61.1 47.0 130％ 聚氧化乙烯烷基胺 ADEKA TOL LB-1520 0.3 78.5 65.9 119％ 烷氧基化月桂醇 EMAL 20CM 0.6 27.5 18.1 152％ 聚氧化乙烯烷基醚硫酸钠 EMAL 20T 0.6 36.0 24.4 148％ 三乙醇胺聚氧化乙烯烷基 醚硫酸盐 EMAL E27C 0.6 26.8 19.0 141％ 聚氧化乙烯月桂基醚硫酸 钠 LEVENOL WX 0.3 19.1 12.2 157％ 聚氧化乙烯烷基醚硫酸钠 SUNAMIDE C-3 0.6 29.6 20.3 146％ 酰胺醚硫酸盐 SUNAMIDE CF-10 0.6 36.5 24.2 151％ 酰胺醚硫酸盐 SUNAMIDE CF-3 0.3 18.5 12.5 148％ 酰胺醚硫酸盐 DIAPON K 0.6 45.2 34.3 132％ 酰基甲基牛磺酸钠 DIAPON F 0.3 19.3 15.2 127％ 酰基甲基牛磺酸钠 DIAPON K-SF 0.3 14.7 11.0 134％ 酰基甲基牛磺酸钠 PERSOFT EF 0.6 29.3 20.7 142％ 烷基醚硫酸盐
PERSOFT EFT 0.6 39.1 28.9 135％ 烷基醚硫酸盐 PERSOFT EL 0.3 25.6 17.4 147％ 烷基醚硫酸盐 PERSOFT EP 0.6 31.0 21.4 145％ 烷基醚硫酸盐 PERSOFT EK 0.3 21.9 15.4 142％ 烷基醚硫酸盐 PERSOFT SL 0.6 43.2 32.4 133％ 烷基硫酸盐 POLYSTAR OMP 0.3 41.6 31.2 133％ 高分子型阴离子 ADEKA COL PS-440E 0.3 56.2 27.1 207％ 脂族磷酸酯 TRAX K-40 0.3 18.6 13.6 137％ 特定阴离子 QUARTAMIN 24P 0.6 60.8 43.8 139％ 月桂基三甲基氯化铵 ADEKA MINE 4MAC-30 0.6 57.2 44.4 129％ 单线性烷基型 AMPHITOL 24B 0.3 65.1 51.1 127％ 月桂基甜菜碱 NISSAN ANONLG 0.6 58.9 38.7 152％ 月桂基二氨基乙基甘氨酸 钠 NISSAN ANON BDF-R 0.3 23.0 16.7 138％ 酰胺甜菜碱型 NISSAN ANONBF 0.3 62.3 48.6 128％ 二甲基烷基甜菜碱 NISSAN ANONBL 0.3 56.0 45.2 124％ 二甲基烷基甜菜碱 NISSAN ANON BL-SF 0.3 64.6 54.2 119％ 二甲基烷基甜菜碱 NISSAN ANON GLM-R-LV 0.6 25.0 14.7 170％ 咪唑啉型
[实施例4]
制备了将要使其作用于脂蛋白的具有不同胆固醇酯酶活性(酶浓度)的以下试剂组合物，。
第一试剂组合物
PIPES缓冲液(pH 7.0) 50mmol/L 胆固醇酯酶 [Asahi Kasei公司] 0.6-3.0U/mL 胆固醇氧化酶[Toyobo] 0.5U/mL 过氧化氢酶 600U/mL 聚氧化乙烯-联苯乙烯苯基醚 [Kao公司] 0.03％ 牛血清白蛋白 0.5％ TOOS 2.0mmol/L
第二试剂组合物
PIPES缓冲液(pH 7.0) 50mmol/L 聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物 Pluronic 17R-4[ADEKA公司] 0.3％ 4-氨基安替比林 4.0mmol/L 过氧化物酶 4.0unit/mL 叠氮化钠 0.05％
将第一试剂(300mL)加入通过超速离心法分离的胆固醇含量为100mg/dL的小而密LDL级分或大LDL级分中每一种的4μL试样中，然后在37℃反应5分钟(第一步)。反应后，加入100μL的第二试剂，然后反应5分钟(第二步)，然后在600nm处测量吸光度。
图3显示了结果。
如图3中所示，随着试剂中胆固醇酯酶活性的增加，大LDL的吸光度首先减小，然而，当试剂中胆固醇酯酶的活性进一步增加时，小而密LDL的吸光度随后减小，因此，通过指定适当的胆固醇酯酶浓度，能够有效地测量小而密LDL中的胆固醇。在第一步中采用浓度优选范围为0.6U/mL-3.0U/mL，更优选范围为0.9U/mL-2.4U/mL，以及还更优选范围为0.9U/mL-1.5U/mL的胆固醇酯酶，能够选择性地测量小而密LDL中的胆固醇。
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