技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组(Section Moutan)落叶亚灌木，是我国传统名花。牡丹花色形成的化学基础研究较为深入，花瓣中含有12种花青苷，即天竺葵素3-葡萄糖苷(Pg3G)、天竺葵素3,5-二葡萄糖苷(Pg3G5G)、矢车菊素3-葡萄糖苷(Cy3G)、矢车菊素3,5-二葡萄糖苷(Cy3G5G)、芍药花素3-葡萄糖苷(Pn3G)、芍药花素3,5-二葡萄糖苷(Pn3G5G)、矢车菊素3,5-二己糖苷(Cy-3,5-di-hexoside)、矢车菊素3-葡萄糖-5-阿拉伯糖苷(Cy3G5Ara)、矢车菊素3-阿拉伯糖苷(Cy3Ara)、矢车菊素3-没食子酰葡萄糖苷(Cy3galloylG)；芍药花素3-阿拉伯糖苷(Pn3Ara)和芍药花素5-没食子酰葡萄糖苷(Pn5galloylG)，其中Pg3G、Pg3G5G、Cy3G、Cy3G5G、Pn3G和Pn3G5G是主要的花青苷(Wang L S,Shiraishi A,Hashimoto F,Aoki N,Shimizu K,Sakata Y.2001.Analysis of petal anthocyanins to investigate flower coloration of Zhongyuan(Chinese)and Daikon Island(Japanese)tree peony cultivars.J Plant Res，114：33-43.；Wang L S,Hashimoto F,Shiraishi A,Aoki N,Li J J,Sakata Y.2004.Chemical taxonomy of the Xibei tree peony from China by floral pigmentation.J Plant Res，117：47-55.；李崇晖，2010.牡丹花瓣类黄酮成分分析及其对花色的影响，中国科学院植物研究所博士学位论文)，栽培品种尤其是西北牡丹品种群花瓣基部具有鲜艳、硕大的色斑，不仅增加了观赏价值，而且常作为品种分类的重要依据之一，这些非斑部分花青苷主要由Pn3G5G、Cy3G5G和Cy3G组成，Pn3G含量很低，几乎不含Pg型色素，推测花瓣基部Cy的糖苷化、甲基化和高含量是形成色斑的主要原因。Zhang et al.(2007)分析了35个西北牡丹品种花瓣的花青苷组成，斑中以Cy3G为主，非斑以Pn3G5G为主，斑中色素含量明显高于非斑中的色素含量(Zhang J J,Wang L S,Shu Q Y,Liu Z A,Li C H,Zhang J,Wei X L,Tian D K.2007.Comparison of anthocyanins in non-blotches and blotches of the petals of Xibei tree peony.Sci Hortic，114：104-111.)。可见花青苷的糖基化修饰在牡丹花色素的合成与积累过程中占有重要的地位(Wang L S,Shiraishi A,Hashimoto F,Aoki N,Shimizu K,Sakata Y.2001.Analysis of petal anthocyanins to investigate flower coloration of Zhongyuan(Chinese)and Daikon Island(Japanese)tree peony cultivars.J Plant Res，114：33-43.)。
类黄酮是植物中一类重要的次生代谢产物，通常需要在合成的最后一步进行糖苷化修饰，以增加其在细胞内的稳定性、溶解性并影响对花的显色(田鹏，刘占林.2011.糖基转移酶超家族[J].2011.生命的化学，31：732–736)。类黄酮糖苷化由糖基转移酶(UDP-glucose:flavonoid glycosyltransferases，UFGTs)完成，其糖基供体通常是核苷酸糖(nucleotide sugar,Uridine diphosphate,UDP)如UDP-葡萄糖等。最早发现的是控制玉米黑色素的基因Bronze1，其编码类黄酮UDP-糖基转移酶(Dooner H K,Nelson O E.1997.Controlling element-induced alterations in UDP glucose flavonoid glucosyltransferase,the enzyme specified by the bronze locus in maize.Proc Natl Acad Sci USA，74：5623-5627.)。之后，在很多植物中发现了类黄酮糖基转移酶基因(UFGT)如玉米、金鱼草、龙胆和牵牛等的UF3GT(Schiefelbein J W,Raboy V,Fedoroff N V,Nelson Jr O E.1985.Deletions within a defective suppressor-mutator element in maize affect the frequency and developmental timing of its excision from the bronze locus.Proc Natl Acad Sci USA，82：4783-4787.)及龙胆和葡萄的UF5GT等(Yang Y Z,Labate J A,Liang Z C,Cousins P,Prins B,Preece J E,Aradhya M,Zhong G Y.2014.Multiple loss-of-function5-O-glucosyltransferase alleles revealed in Vitis vinifera,but not in other Vitis species.Theor Appl Genet，127：2433-2451.)。此外，在月季中还有一种糖基转移酶先将花青苷5-O糖苷化后再继续将3-O修饰形成3,5-双-O-糖苷，聚类分析表明其与花青苷3GT-和5GT-糖基转移酶亚家族明显不同(Ogata J,Kanno Y,Itoh Y,Tsugawa H,Suzuki M.2005.Plant biochemistry:anthocyanin biosynthesis in roses.Nature，435：757-758.；Purkayastha A,Dasgupta I.2009.Virus-induced gene silencing:A versatile tool for discovery of gene functions in plants[J].Plant Physiol Biochem，47：967-976)，可见在不同物种中，类黄酮糖苷化修饰基因存在多样性并由超家族基因组成。牡丹花瓣中类黄酮(包括花青苷)合成途径中部分相关酶基因已有克隆和表达分析(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X,Liu Z A,Wang L S.2015.Methylation mediated by an anthocyanin O-methyltransferase,is involved in purple flower coloration in Paeonia.J Exp Bot，66：6563-77.)，而类黄酮糖基转移酶基因相关研究尚未见报道，因此开展相关基因功能研究对于理解其花色形成具有重要意义。
牡丹再生和遗传转化很困难，尚未见其遗传转化体系的报道，利用转基因技术验证牡丹基因的功能存在技术瓶颈。此外，牡丹从实生苗到开花需要3年左右的时间，开花相关基因的表型鉴定困难较大。
病毒诱导的基因沉默VIGS(Virus-induced gene silencing)是近年来发现的一种转录后基因沉默现象，可引起内源mRNA序列特异性降解(Ratcliff F,Martin-Hemandez A M,Baulcombe D C.2001.Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing.Plant J，25：237-245.)。
发明内容
为了弥补以上领域的缺陷，本发明提供了鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系。
本发明所提供的鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系，包含：在VIGS沉默载体上插入目的基因得到的重组载体；所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。
所述VIGS沉默载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。
本发明还提供了所述鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系的构建方法。
本发明所提供的所述鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系的构建方法，包括如下步骤：
(1)利用添加了BamH I酶切位点和Xho I酶切位点的特异性引物进行目的基因片段的PCR扩增，分别得到用于VIGS沉默的PsUF3GT靶片段、PsUF5GT靶片段；
所述PsUF3GT靶片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示；扩增所述PsUF3GT靶片段的特异性引物如下：
3GT-VF1：AAGGATCCCATGGCTCAATGACCAAAAGGCTAA；
3GT-VR1：TTACTCGAGCATTCTTCGTAAATACTCCACCGTCG；
所述PsUF5GT靶片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示；扩增所述PsUF5GT靶片段的特异性引物如下：
5GT-VF1：AAGGATCCTTTGGAAAAGCAAGGAATGGTGGTG；
5GT-VR1：ACGCTCGAGTCACAAATCACCACCTTTCCCCACC；
(2)用BamH I酶和Xho I酶将所述PsUF3GT靶片段或PsUF5GT靶片段和TRV2载体进行双酶切，酶切完成后将PsUF3GT靶片段或PsUF5GT靶片段与烟草脆裂病毒TRV2载体进行连接，连接之后转化E.coLi DH5α感受态细胞，筛选阳性单菌落，然后转化到农杆菌GV3101中，即得到所述VIGS沉默体系。
所述鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系在鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因PsUF3GT和/或PsUF5GT中的应用也属于本发明的保护范围。
一种鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的方法也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的使用鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的方法，使用所述的VIGS沉默体系。
所述方法包括如下步骤：
以牡丹带花柄的花朵为材料，浸没在含有所述VIGS沉默载体的菌液，真空渗透，负压处理，放气；
将真空渗透后的花瓣用去离子水漂洗，去除多余菌液；
将所述花柄采用水培方式进行培养，之后检测目的基因的表达水平以及花青苷积累量的变化。
所述带花柄的花朵的花发育时期为全开或花苞。
抽真空渗透的持续时间为10min-15min。
将所述花柄采用水培方式进行培养的条件为：将花柄浸于去离子水中，在温度为8℃、湿度60％的条件下暗培养1天；之后转移至温度为23-25℃、湿度60％的条件下正常光照培养3天。
所述含有权利要求1或2所述重组载体的菌液为：含有在烟草脆裂病毒TRV2载体上插入序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列得到的重组载体菌液以及含有烟草脆裂病毒TRV1载体的菌液。
本发明利用同源克隆技术克隆了牡丹类黄酮糖基转移酶基因PsUF3GT和PsUF5GT保守区段作为靶基因构建TRV2载体，成功建立了VIGS沉默体系，有效地降低了这两个基因的表达量和总花青苷含量。本研究结果对牡丹基因功能研究具有重要意义，也为解析牡丹色斑形成的分子机制奠定了基础。
影响VIGS沉默效果的因素很多。首先是沉默基因片段长度和位置的选择，本发明利用扩增保守区段长度在400-450bp的片段来沉默同源家族基因，取得了较好的沉默效果。如针对某一特异基因进行沉默时，则需考虑序列的特异性，可以通过沉默非翻译区或者特异区段的办法，确保沉默特异目标基因。本发明采用烟草脆裂病毒TRV为载体，其能有效地将目标基因在生长点或分生组织中沉默，并获得系统的沉默效果。此外，利用TRV沉默基因后的植物材料对温度比较敏感，本发明在光照培养箱控温(25℃)控湿(相对湿度60％)的条件下进行，获得了较好的实验结果。因此，成功沉默基因需要严格掌控好每个技术环节。
针对牡丹遗传转化困难、无法验证基因功能等问题，本发明通过VIGS技术，采用二因素三水平共9个试验处理，利用VIGS技术成功沉默了PsUF3GT和PsUF5GT基因。建立了PsUFGTs最佳VIGS体系，用PsUFGTs基因保守区段为靶片段，以S4或者S2期带花柄的花朵为材料，抽真空渗透10min-15min后置于去离子水中，暗培养1d(8℃，湿度60％)；之后转移至23-25℃、湿度60％的环境，正常光照培养3d后进行检测和分析。本结果为验证牡丹UFGTs基因的功能奠定了基础，也为验证牡丹中其他重要功能基因提供了研究思路和技术依据。
附图说明
图1为PsUF3GT靶片段核苷酸及推测编码的氨基酸序列；下划线表示PSPG-box。
图2为PsUF5GT靶片段核苷酸及推测编码的氨基酸序列；下划线表示UDPG特征序列。
图3为含有TRV载体的菌液凝胶电泳检测结果；M为分子量标准从上到下分别为1000bp、900、800、700、600、500、400、300、200、100bp。
图4不同处理沉默花瓣中PsUF3GT基因的表达量分析；小写字母表示显著性程度的差异。
图5不同处理沉默花瓣中PsUF5GT基因的表达量分析；小写字母表示显著性程度的差异。
图6不同处理沉默PsUFGTs的花斑中的花青苷含量和成分分析。
具体实施方式
用于本发明的紫斑牡丹品种‘青海湖银波’(P.suffruticosa‘Qing Hai Hu Yin Bo’)栽植于中国科学院植物研究所牡丹芍药种质资源圃，其斑为紫红色，非斑为白色，非斑部分未检测出花青苷，斑部花青苷有四种：Pn3G、Pn3G5G、Cy3G和Cy3G5G(记载过该紫斑牡丹品种‘青海湖银波’(P.suffruticosa‘Qing Hai Hu Yin Bo’)的非专利文献是：Zhang J J,Wang L S,Shu Q Y,Liu Z A,Li C H,Zhang J,Wei X L,Tian D K.2007.Comparison of anthocyanins in non-blotches and blotches of the petals of Xibei tree peony.Sci Hortic，114：104-111)。
本发明所用VIGS载体来自烟草脆裂病毒载体(tobacco rattle virus，TRV)，TRV1/TRV2为中国农业大学观赏植物采后和逆境生理实验室马男教授馈赠(记载过该载体的非专利文献是：Tian J,Pei H X,Zhang S,Chen J W,Chen W,Yang R Y,Meng Y L,You J,Gao J P,Ma N.2014.TRV-GFP:a modified Tobacco rattle virus vector for efficient and visualizable analysis of gene function.J Exp Bot，65：311-322.)，其带有卡那筛选标记和35S启动子，pTRV2带有BamH I和Xho I等多克隆位点。
所用标准品矢车菊素-3-葡糖苷(Cy3G)购自法国Extrasynthese公司(Genay，France)。
实施例1、
一、基因克隆
花瓣总RNA的提取参照试剂盒说明书进行(RNAprep Pure Plant Kit，FastQuant cDNA天根生化科技(北京)有限公司)。根据公共数据库中UF3GT和UF5GT序列设计上下游引物克隆靶片段。用于VIGS沉默的PsUF3GT和PsUF5GT片段设计上下游引物并添加BamH I和Xho I酶切位点。扩增引物见表1。
表1 本发明所用引物序列相关信息
注：下划线表示碱基酶切位点。
(1)PsUF3GT靶片段的克隆序列分析
根据上下游引物扩增PsUF3GT靶片段长度为413bp，其核苷酸序列如序列表中序列1所示。所用的PCR反应体系和程序见表2和表3，所扩增的片段利用凝胶回收试剂盒(Easy Pure Quick Gel Extraction，全式金生物技术有限公司)按照说明书进行回收，并连接到pEASY-T3载体(购自全式金生物技术有限公司)，转化大肠杆菌感受态细胞(Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell，购自全式金生物技术有限公司)。阳性克隆进行测序(由北京博迈德基因技术有限公司完成)。序列用DNAman5.0及在线网络软件(http://prosite.expasy.org/mydomains/)分析，其属于Glycosyltransferase_GTB_type超家族，含有PSPG基序(plant secondary product glycosyltransferase box，图1下划线表示)。PsUF3GT靶片段编码的PsUF3GT蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
表2：PCR反应体系
表3：PCR扩增程序
(2)PsUF5GT基因克隆和序列分析
克隆的PsUF5GT靶片段长度为418bp，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。所用的PCR反应体系和程序等方法同PsUF3GT。序列用DNAman5.0进行分析，并与公共数据可进行BlastP分析，其属于Glycosyltransferase_GTB_type超家族，其氨基酸在337-380处有UDPG(UDP-glycosyltransferases)特征序列即WcnQleVLshksvgCFLTHCGwnSsleSLvcgv.PvvafPqwaDQ(图2下划线所示)。PsUF5GT靶片段编码的PsUF5GT蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
二、制备重组载体
首先对含有TRV2和TRV1的菌液(为中国农业大学观赏植物采后和逆境生理实验室马男教授馈赠；记载过TRV1/TRV2的非专利文献是：Tian J,Pei H X,Zhang S,Chen J W,Chen W,Yang R Y,Meng Y L,You J,Gao J P,Ma N.2014.TRV-GFP:a modified Tobacco rattle virus vector for efficient and visualizable analysis of gene function.J Exp Bot，65：311-322.))进行PCR鉴定，鉴定引物见表1，扩增体系和程序见表4和表5。所扩增长度分别为500bp(TRV1)和200bp(TRV2)(图3)。
表4：PCR反应体系
PCR扩增程序如下表5：
表5：PCR扩增程序
含有TRV载体的菌液凝胶电泳检测结果见图3。TRV1所扩增片段大小为500bp左右，TRV2大小为200bp左右，证实扩增正确，可以用于后续研究。
上述所克隆的PsUF3GT/PsUF5GT序列上下游分别含有BamH I和Xho I酶切位点，含有目的片段和TRV2载体的菌液进行质粒提取，采用无内毒素质粒中提试剂盒(EndoFree Plasmind Midi Kit，购自康为世纪生物科技有限公司)，提取方法参照试剂盒说明书进行。同时用上述2个酶将靶片段和TRV2进行双酶切(内切酶购自NEB)，酶切反应根据试剂说明书进行，并见表6。酶切体系混匀后，置于37℃水浴过夜。
表6：双酶切体系
酶切完成后将PsUF3GT/PsUF5GT靶片段与TRV2载体进行连接，采用T4DNA连接酶，连接体系见表7。
表7：连接体系
连接之后转化E.coLi DH5α感受态细胞(购自康为世纪生物科技有限公司)，用含kan抗性的LB培养基筛选阳性单菌落，再进行PCR、质粒酶切鉴定。鉴定正确，将确定含有TRV2-PsUF3GT和TRV2-PsUF5GT大肠杆菌菌液进行测序(由北京博迈德基因技术有限公司完成)，确保序列的正确性。测序结果正确，然后转化到农杆菌GV3101中(农杆菌感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司)转化方法为常规冻融法，转化后的农杆菌培养2-3d后，将单菌落菌液进行测序验证，对验证正确的农杆菌进行培养，用于VIGS试验。
三、VIGS体系建立
采用二因素三水平试验体系(表8)进行VIGS试验。因素A：花发育时期，对应的A1(全开，S4)；A2(半开，S3)；A3(花苞，S2)。因素B：真空渗透时间，分别为10min(B1)、15min(B2)和20min(B3)。TRV2-3GT和TRV2-5GT为目标基因，相应的TRV2空载体为对照。转化方法参照文献Tian J,Pei H X,Zhang S,Chen J W,Chen W,Yang R Y,Meng Y L,You J,Gao J P,Ma N.2014.TRV-GFP:a modified Tobacco rattle virus vector for efficient and visualizable analysis of gene function.J Exp Bot，65：311-322.，采用抽真空法。主要细节包括重悬菌液的OD600＝1.0，且pTRV2-3/5GT、pTRV1和pTRV2菌液的OD600值相同。将pTRV2-3/5GT和pTRV1，pTRV2和pTRV1菌液按体积比1：1分别混合，暗处静置4h。牡丹花朵带5cm花柄剪下，随机分布于不同处理，浸没在菌液中，抽真空至0.7atm，负压处理，缓慢放气。每个处理三朵花即重复3次。将抽吸后的花瓣用去离子水漂洗，去除多余菌液。花柄浸于去离子水中，8℃，湿度60％左右，暗培养1d；之后转移至23-25℃，湿度60％左右，正常光照培养3d。侵染4d后采样，将花瓣的斑与非斑部分分开。选取花瓣作为RNA提取检测样本和色素抽提样本，RNA检测样本置于液氮中速冻并存于-80℃，色素抽提样本经冷冻干燥处理后保存于茶色干燥器中。之后检测目的基因的表达水平以及花青苷积累量相对于对照的变化。因非斑部分不积累花青苷，所以侵染后仅测斑部花青苷成分及含量。
表8 用于VIGS体系的二因素三水平试验处理
四、基因表达分析
基因表达分析参照文献(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X,Liu Z A,Wang L S.2015.Methylation mediated by an anthocyanin O-methyltransferase,is involved in purple flower coloration in Paeonia.J Exp Bot，66：6563-77)，将所有样品进行总RNA的提取，并反转录成cDNA，作为荧光定量PCR的模板。具体方法参照试剂盒说明进行(FastQuant cDNA和SYBR Green，天根生化科技(北京)有限公司)并参考文献(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X,Liu Z A,Wang L S.2015.Methylation mediated by an anthocyanin O-methyltransferase,is involved in purple flower coloration in Paeonia.J Exp Bot，66：6563-77)，荧光定量的反应体系和程序见表9和表10。本研究采用2-△△CT(Livak)法计算实时荧光定量PCR实验中基因的相对表达量，PsTubulin(accession no.EF608942)作为内参基因(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X,Liu Z A,Wang L S.2015.Methylation mediated by an anthocyanin O-methyltransferase,is involved in purple flower coloration in Paeonia.J Exp Bot，66：6563-77)。将花瓣斑与非斑分开进行表达量分析，分3次生物学和3次技术重复。
表9 荧光定量PCR扩增体系
表10 荧光定量PCR扩增程序
结果：花瓣中沉默UFGTs后基因的表达量分析
利用所扩增保守区片段长分别为413bp和418bp的PsUF3GT和PsUF5GT基因片段构建TRV2载体，用于沉默目的基因。通过二因素三水平9个试验，寻找UFGT基因沉默的最佳处理，对沉默后的基因表达量进行分析(图4和图5)。通过对不同处理的斑与非斑中PsUF3GT和PsUF5GT基因表达量分析发现，9个处理中PsUF3GT基因的表达量在处理2的斑中降低最多，比对照处理1、处理6和处理8分别降低了65.0％、45.0％和71.0％。PsUF5GT在处理7的非斑中表达量降低最多，比对照处理1和8分别降低了15.9％和85.0％。
五、斑部花青苷测定
将干燥后的花斑进行称重提取花青苷(Li C H,Du H,Wang L S,Shu Q Y,Zheng Y R,Xu Y J,Zhang J J,Zhang J,Yang R Z,Ge Y X.2009.Flavonoid composition and antioxidant activity of tree peony(Paeonia Section Moutan)Yellow Flowers.J Agric Food Chem，57：8496–8503.)，即称取干燥花瓣0.1-0.2g，用0.2％甲酸甲醇溶液超声20min，并黑暗放置2h后12,000rpm离心5min充分提取，各3个重复。使用HPLC分析前，取1mL提取液，用0.22μm尼龙微孔滤器过滤到样品瓶中。所用分析系统为Dionex HPLC-DAD系统，色谱柱为TSK gel ODS-80Ts QA，4.6mm(内径)×150mm(柱长)(日本Tosoh株式会社)。花青苷的定性和定量分析参照(Zhang J J,Wang L S,Shu Q Y,Liu Z A,Li C H,Zhang J,Wei X L,Tian D K.2007.Comparison of anthocyanins in non-blotches and blotches of the petals of Xibei tree peony.Sci Hortic，114：104-111.；Li C H,Du H,Wang L S,Shu Q Y,Zheng Y R,Xu Y J,Zhang J J,Zhang J,Yang R Z,Ge Y X.2009.Flavonoid composition and antioxidant activity of tree peony(Paeonia Section Moutan)Yellow Flowers.J Agric Food Chem，57：8496–8503.)，即液相色谱分析条件：色谱柱TSK gel ODS-80Ts QA，4.6mm(内径)×150mm(长)；柱温35℃，流速0.8mL/min，进样体积10μL。具体A相：10％甲醇水溶液；B相：1％甲酸水；C相：纯甲醇；D相：甲酸：乙腈(0.1:99.9V/V)溶液。线性梯度洗脱程序：0-50min，B相5％-20％，C相95％-80％；50-60min，B相20％-5％，C相80％-95％。流速0.8mL/min，柱温35℃，进样体积10μL，检测波长525nm(花青苷分析)。利用Agilent 1100LC/MSD Trap VL液质联用仪(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)进行HPLC-ESI-MS2分析。质谱分析条件：电喷雾离子化(ESI)，离子阱分析器，毛细管电压3.5kV，喷雾器压力241.3kPa，干燥温度350℃，干燥气(N2)流速6.0mL/min。用LC/MSD Trap软件(V5.2)分析结果。利用Agilent 1100LC/MSD Trap VL液质联用仪(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)进行HPLC-ESI-MS/MS2分析。标准品为矢车菊素3-O-葡萄糖苷(Cy3G)，通过标准品半定量法计算花青苷含量(Wang L S,Shiraishi A,Hashimoto F,Aoki N,Shimizu K,Sakata Y.2001.Analysis of petal anthocyanins to investigate flower coloration of Zhongyuan(Chinese)and Daikon Island(Japanese)tree peony cultivars.J Plant Res，114：33–43.)，即使用不同浓度包括0.015625mg/ml、0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.025mg/mL、0.05mg/mL、1.0mg/mL的标准品，制作的标准曲线公式为：花青苷含量TA(total anthocyanin)[mAU]＝0.0012[Cy3G(μg/mL)]+0.0121(R2＝0.994)。花青苷含量以mg/g干燥花瓣(DW)计。用Chameleon软件(Ver.6.60)分析结果。
数据分析方法：
本研究中的序列利用DNAMAN5.0进行序列分析。荧光定量PCR数据采用软件SPSS 13.0v(SPSS Inc.,Chicago,IL)进行显著性差异分析(P<0.05)，采用Excel 2007软件绘制图表。
结果：沉默后的花斑中花青苷含量的测定和分析
在对基因沉默后不同处理的花瓣斑与非斑中的表达量进行分析的基础上，对9个处理花斑中花青苷成分和含量进行了测定(图6)，检测结果与荧光定量结果基本一致，即：处理2中4种花青苷总量比对照处理1降低了24.2％，其中降低最多的是Pn3G占20.0％，其次为Cy3G、Pn3G5G、Cy3G5G，分别为2.3％、1.4％和0.1％；3G型糖苷降低了92.2％，3G5G型降低了7.8％。处理7中总花青苷比对照处理8降低了28.2％，其中降低最多的是Pn3G占12.5％，其次是Pn3G5G、Cy3G5G、Cy3G分别降低了9.3％、6.1％和0.01％；3G5G型糖苷降低54.9％而3G型糖苷降低45.1％。
<110> 中国科学院植物研究所
<120> 鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系
<130> P170440/ZWY
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 413
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PsUF3GT
<400> 1
catggctcaa tgaccaaaag gctgaatccg tcgcgtacat cagctttggc acggctgcga 60
ctccacctcc aaccgagatt ttagctatag cagaagcatt agaagcaagt ggggttgcct 120
ttttatggtc acttaaggac catttaaatg tgcatttgcc aaaagggttt ttagacaaaa 180
caagagcatg tggaatggtt gtgccatggg ctcctcaatt acaaatacta gcacatggtg 240
ctgttggggt gtttataacg cattgtggtt ggaactcggt actagagagt atcggaggtg 300
gagtgcctat gatttgtagg ccattcttcg gcgaccaaaa gttgaacgcg tgtatggtgg 360
aggacgtgtg ggaaattggt gtgaaaatcg acggtggagt atttacgaag aat 413
<210> 2
<211> 136
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PsUF3GT
<400> 2
Trp Leu Asn Asp Gln Lys Ala Glu Ser Val Ala Tyr Ile Ser Phe Gly
1 5 10 15
Thr Ala Ala Thr Pro Pro Pro Thr Glu Ile Leu Ala Ile Ala Glu Ala
20 25 30
Leu Glu Ala Ser Gly Val Ala Phe Leu Trp Ser Leu Lys Asp His Leu
35 40 45
Asn Val His Leu Pro Lys Gly Phe Leu Asp Lys Thr Arg Ala Cys Gly
50 55 60
Met Val Val Pro Trp Ala Pro Gln Leu Gln Ile Leu Ala His Gly Ala
65 70 75 80
Val Gly Val Phe Ile Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Val Leu Glu Ser
85 90 95
Ile Gly Gly Gly Val Pro Met Ile Cys Arg Pro Phe Phe Gly Asp Gln
100 105 110
Lys Leu Asn Ala Cys Met Val Glu Asp Val Trp Glu Ile Gly Val Lys
115 120 125
Ile Asp Gly Gly Val Phe Thr Lys
130 135
<210> 3
<211> 418
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PsUF5GT
<400> 3
tttggaaaag caaggaatgg tggtgccatg gtgtaatcaa ttagaggttc tgtctcataa 60
gtcagtgggt tgttttctga cacattgtgg gtggaattcg agtttggaga gtttggtttg 120
tggggtgccg gtggtggcgt ttcctcagtg ggcggatcaa gccaccaatg ccaagctgat 180
tgaagatgtg tggaagactg gggtgagaat ggtggtgaat gaagatggtg tggttgaagg 240
ttgtgagatt aagagatgtt tggaaatggt tatgggaggt ggagagagag gggaggaaat 300
gagaaggaat gttgagaaat ggaaggagtt ggcgagggaa gctgtcaagg atggtgagtc 360
ttctgacaaa aatctaaaag cttttgtcaa tgaggtgggg aaaggtggtg atttgtga 418
<210> 4
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PsUF5GT
<400> 4
Leu Glu Lys Gln Gly Met Val Val Pro Trp Cys Asn Gln Leu Glu Val
1 5 10 15
Leu Ser His Lys Ser Val Gly Cys Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn
20 25 30
Ser Ser Leu Glu Ser Leu Val Cys Gly Val Pro Val Val Ala Phe Pro
35 40 45
Gln Trp Ala Asp Gln Ala Thr Asn Ala Lys Leu Ile Glu Asp Val Trp
50 55 60
Lys Thr Gly Val Arg Met Val Val Asn Glu Asp Gly Val Val Glu Gly
65 70 75 80
Cys Glu Ile Lys Arg Cys Leu Glu Met Val Met Gly Gly Gly Glu Arg
85 90 95
Gly Glu Glu Met Arg Arg Asn Val Glu Lys Trp Lys Glu Leu Ala Arg
100 105 110
Glu Ala Val Lys Asp Gly Glu Ser Ser Asp Lys Asn Leu Lys Ala Phe
115 120 125
Val Asn Glu Val Gly Lys Gly Gly Asp Leu
130 135