鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710607382.8 (22)申请日 2017.07.24 (71)申请人 中国科学院植物研究所 地址 100093 北京市海淀区香山南辛村20 号 (72)发明人 舒庆艳王亮生朱瑾 (74)专利代理机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 11129 代理人 高芬芳 (51)Int.Cl. C12N 15/83(2006.01) C12N 15/66(2006.01) C12N 15/54(2006.01) (54)发明名称 鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉 默

2、体系 (57)摘要 本发明公开了鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶 基因的VIGS沉默体系。 本发明所提供的鉴定牡丹 类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系， 包含： 在VIGS沉默载体上插入目的基因得到的重组载 体； 所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸 序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。 本发 明利用同源克隆技术克隆了类黄酮糖基转移酶 基因PsUF3GT和PsUF5GT保守区段作为靶基因构 建TRV2载体， 成功建立了VIGS沉默体系， 有效地 降低了这两个基因的表达量和总花青苷含量。 本 发明结果对牡丹基因功能研究具有重要意义， 也 为解析牡丹色斑形成的分子机制奠定了基础。 权利要求书2页

3、 说明书11页 序列表3页 附图3页 CN 107245497 A 2017.10.13 CN 107245497 A 1.鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系， 其特征在于： 包含： 在VIGS沉默载 体上插入目的基因得到的重组载体； 所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序列和/或 序列表中序列3所示核苷酸序列。 2.鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系， 其特征在于： 所述VIGS沉默载体 为烟草脆裂病毒TRV2载体。 3.权利要求2所述鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系的构建方法， 包括 如下步骤： (1)利用添加了BamH I酶切位点和Xho I酶切位

4、点的特异性引物进行目的基因片段的 PCR扩增， 分别得到用于VIGS沉默的PsUF3GT靶片段、 PsUF5GT靶片段； 所述PsUF3GT靶片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示； 扩增所述PsUF3GT靶片段的 特异性引物如下： 3GT-VF1： AAGGATCCCATGGCTCAATGACCAAAAGGCTAA； 3GT-VR1： TTACTCGAGCATTCTTCGTAAATACTCCACCGTCG； 所述PsUF5GT靶片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示； 扩增所述PsUF5GT靶片段的 特异性引物如下： 5GT-VF1： AAGGATCCTTTGGAAAAGCAAGGAATGGTG

5、GTG； 5GT-VR1： ACGCTCGAGTCACAAATCACCACCTTTCCCCACC； (2)用BamH I酶和Xho I酶将所述PsUF3GT靶片段或PsUF5GT靶片段和TRV2载体进行双 酶切， 酶切完成后将PsUF3GT靶片段或PsUF5GT靶片段与烟草脆裂病毒TRV2载体进行连接， 连接之后转化E.coLi DH5 感受态细胞， 筛选阳性单菌落， 然后转化到农杆菌GV3101中， 即 得到所述VIGS沉默体系。 4.权利要求1或2所述的鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系在鉴定牡丹 类黄酮糖基转移酶基因PsUF3GT和/或PsUF5GT中的应用。 5.一种鉴定牡

6、丹类黄酮糖基转移酶基因的方法， 其特征在于： 使用权利要求1或2所述 的VIGS沉默体系。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 所述方法包括如下步骤： 以牡丹带花柄的花朵为材料， 浸没在含有权利要求1或2所述重组载体的菌液中， 真空 渗透， 负压处理， 放气； 将真空渗透后的花瓣用去离子水漂洗， 去除多余菌液； 将所述花柄采用水培方式进行培养， 之后检测目的基因的表达水平以及花青苷积累量 的变化。 7.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 所述带花柄的花朵的花发育时期为全开或 花苞。 8.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 抽真空渗透的持续时间为10min-15min。 9

7、.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 将所述花柄采用水培方式进行培养的条件 为： 将花柄浸于去离子水中， 在温度为8、 湿度60的条件下暗培养1天； 之后转移至温度 为23-25、 湿度60的条件下正常光照培养3天。 10.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 所述含有权利要求1或2所述重组载体的 菌液为： 含有在烟草脆裂病毒TRV2载体上插入序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表 权利要求书 1/2 页 2 CN 107245497 A 2 中序列3所示核苷酸序列得到的重组载体菌液以及含有烟草脆裂病毒TRV1载体的菌液。 权利要求书 2/2 页 3 CN 107245497 A

8、3 鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 特别涉及鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默 体系。 背景技术 0002 牡丹(Paeonia suffruticosa)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)牡丹组 (Section Moutan)落叶亚灌木， 是我国传统名花。 牡丹花色形成的化学基础研究较为深入， 花瓣中含有12种花青苷， 即天竺葵素3-葡萄糖苷(Pg3G)、 天竺葵素3 ,5-二葡萄糖苷 (Pg3G5G)、 矢车菊素3-葡萄糖苷(Cy3G)、 矢车菊素3,5-二葡萄糖苷(Cy3G5G)、 芍药花素3

9、-葡 萄糖苷(Pn3G)、 芍药花素3,5-二葡萄糖苷(Pn3G5G)、 矢车菊素3,5-二己糖苷(Cy-3,5-di- hexoside)、 矢车菊素3-葡萄糖-5-阿拉伯糖苷(Cy3G5Ara)、 矢车菊素3-阿拉伯糖苷 (Cy3Ara)、 矢车菊素3-没食子酰葡萄糖苷(Cy3galloylG)； 芍药花素3-阿拉伯糖苷(Pn3Ara) 和芍药花素5-没食子酰葡萄糖苷(Pn5galloylG)， 其中Pg3G、 Pg3G5G、 Cy3G、 Cy3G5G、 Pn3G和 Pn3G5G是主要的花青苷(Wang L S,Shiraishi A,Hashimoto F,Aoki N,Shimizu

10、K,Sakata Y.2001.Analysis of petal anthocyanins to investigate flower coloration of Zhongyuan(Chinese)and Daikon Island(Japanese)tree peony cultivars.J Plant Res， 114： 33-43.； Wang L S,Hashimoto F,Shiraishi A,Aoki N,Li J J ,Sakata Y.2004.Chemical taxonomy of the Xibei tree peony from China by floral

11、pigmentation.J Plant Res， 117： 47-55.； 李崇晖， 2010.牡丹花瓣类黄酮成分分析及其对 花色的影响， 中国科学院植物研究所博士学位论文)， 栽培品种尤其是西北牡丹品种群花瓣 基部具有鲜艳、 硕大的色斑， 不仅增加了观赏价值， 而且常作为品种分类的重要依据之一， 这些非斑部分花青苷主要由Pn3G5G、 Cy3G5G和Cy3G组成， Pn3G含量很低， 几乎不含Pg型色 素， 推测花瓣基部Cy的糖苷化、 甲基化和高含量是形成色斑的主要原因。 Zhang et al. (2007)分析了35个西北牡丹品种花瓣的花青苷组成， 斑中以Cy3G为主， 非斑以Pn3G

12、5G为主， 斑中色素含量明显高于非斑中的色素含量(Zhang J J,Wang L S,Shu Q Y,Liu Z A,Li C H,Zhang J,Wei X L,Tian D K.2007.Comparison of anthocyanins in non-blotches and blotches of the petals of Xibei tree peony.Sci Hortic， 114： 104-111.)。 可见 花青苷的糖基化修饰在牡丹花色素的合成与积累过程中占有重要的地位(Wang L S, Shiraishi A,Hashimoto F,Aoki N,Shimizu K

13、,Sakata Y.2001.Analysis of petal anthocyanins to investigate flower coloration of Zhongyuan(Chinese)and Daikon Island(Japanese)tree peony cultivars.J Plant Res， 114： 33-43.)。 0003 类黄酮是植物中一类重要的次生代谢产物， 通常需要在合成的最后一步进行糖苷 化修饰， 以增加其在细胞内的稳定性、 溶解性并影响对花的显色(田鹏， 刘占林.2011.糖基 转移酶超家族J.2011.生命的化学， 31： 732736)。 类黄酮

14、糖苷化由糖基转移酶(UDP- glucose:flavonoid glycosyltransferases， UFGTs)完成， 其糖基供体通常是核苷酸糖 (nucleotide sugar,Uridine diphosphate,UDP)如UDP-葡萄糖等。 最早发现的是控制玉米 说明书 1/11 页 4 CN 107245497 A 4 黑色素的基因Bronze1， 其编码类黄酮UDP-糖基转移酶(Dooner H K ,Nelson O E.1997.Controlling element-induced alterations in UDP glucose flavonoid gluc

15、osyltransferase,the enzyme specified by the bronze locus in maize.Proc Natl Acad Sci USA， 74： 5623-5627.)。 之后， 在很多植物中发现了类黄酮糖基转移酶基因 (UFGT)如玉米、 金鱼草、 龙胆和牵牛等的UF3GT(Schiefelbein J W,Raboy V,Fedoroff N V,Nelson Jr O E.1985.Deletions within a defective suppressor-mutator element in maize affect the frequen

16、cy and developmental timing of its excision from the bronze locus.Proc Natl Acad Sci USA， 82： 4783-4787.)及龙胆和葡萄的UF5GT等 (Yang Y Z,Labate J A,Liang Z C,Cousins P,Prins B,Preece J E,Aradhya M,Zhong G Y.2014.Multiple loss-of-function5-O-glucosyltransferase alleles revealed in Vitis vinifera,but not in o

17、ther Vitis species.Theor Appl Genet， 127： 2433- 2451.)。 此外， 在月季中还有一种糖基转移酶先将花青苷5-O糖苷化后再继续将3-O修饰形 成3,5-双-O-糖苷， 聚类分析表明其与花青苷3GT-和5GT-糖基转移酶亚家族明显不同 (Ogata J ,Kanno Y ,Itoh Y ,Tsugawa H ,Suzuki M .2005 .Plant biochemistry: anthocyanin biosynthesis in roses.Nature， 435： 757-758.； Purkayastha A,Dasgupta I.20

18、09.Virus-induced gene silencing:A versatile tool for discovery of gene functions in plantsJ.Plant Physiol Biochem， 47： 967-976)， 可见在不同物种中， 类 黄酮糖苷化修饰基因存在多样性并由超家族基因组成。 牡丹花瓣中类黄酮(包括花青苷)合 成途径中部分相关酶基因已有克隆和表达分析(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X,Liu Z A,Wang L S.2015.Methylation med

19、iated by an anthocyanin O-methyltransferase,is involved in purple flower coloration in Paeonia.J Exp Bot， 66： 6563-77.)， 而类黄酮糖基转移酶基因相关研究尚未见报道， 因此 开展相关基因功能研究对于理解其花色形成具有重要意义。 0004 牡丹再生和遗传转化很困难， 尚未见其遗传转化体系的报道， 利用转基因技术验 证牡丹基因的功能存在技术瓶颈。 此外， 牡丹从实生苗到开花需要3年左右的时间， 开花相 关基因的表型鉴定困难较大。 0005 病毒诱导的基因沉默VIGS(Virus-i

20、nduced gene silencing)是近年来发现的一 种转录后基因沉默现象， 可引起内源mRNA序列特异性降解(Ratcliff F,Martin-Hemandez A M,Baulcombe D C.2001.Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing.Plant J， 25： 237-245.)。 发明内容 0006 为了弥补以上领域的缺陷， 本发明提供了鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS 沉默体系。 0007 本发明所提供的鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系

21、， 包含： 在VIGS 沉默载体上插入目的基因得到的重组载体； 所述目的基因为序列表中序列1所示核苷酸序 列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列。 0008 所述VIGS沉默载体为烟草脆裂病毒TRV2载体。 0009 本发明还提供了所述鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系的构建方 说明书 2/11 页 5 CN 107245497 A 5 法。 0010 本发明所提供的所述鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系的构建方 法， 包括如下步骤： 0011 (1)利用添加了BamH I酶切位点和Xho I酶切位点的特异性引物进行目的基因片 段的PCR扩增， 分别得到用于VIGS沉默的

22、PsUF3GT靶片段、 PsUF5GT靶片段； 0012 所述PsUF3GT靶片段的核苷酸序列如序列表中序列1所示； 扩增所述PsUF3GT靶片 段的特异性引物如下： 0013 3GT-VF1： AAGGATCCCATGGCTCAATGACCAAAAGGCTAA； 0014 3GT-VR1： TTACTCGAGCATTCTTCGTAAATACTCCACCGTCG； 0015 所述PsUF5GT靶片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示； 扩增所述PsUF5GT靶片 段的特异性引物如下： 0016 5GT-VF1： AAGGATCCTTTGGAAAAGCAAGGAATGGTGGTG； 0017 5G

23、T-VR1： ACGCTCGAGTCACAAATCACCACCTTTCCCCACC； 0018 (2)用BamH I酶和Xho I酶将所述PsUF3GT靶片段或PsUF5GT靶片段和TRV2载体进 行双酶切， 酶切完成后将PsUF3GT靶片段或PsUF5GT靶片段与烟草脆裂病毒TRV2载体进行连 接， 连接之后转化E.coLi DH5 感受态细胞， 筛选阳性单菌落， 然后转化到农杆菌GV3101中， 即得到所述VIGS沉默体系。 0019 所述鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的VIGS沉默体系在鉴定牡丹类黄酮糖基转 移酶基因PsUF3GT和/或PsUF5GT中的应用也属于本发明的保护范围。 002

24、0 一种鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的方法也属于本发明的保护范围。 0021 本发明所提供的使用鉴定牡丹类黄酮糖基转移酶基因的方法， 使用所述的VIGS沉 默体系。 0022 所述方法包括如下步骤： 0023 以牡丹带花柄的花朵为材料， 浸没在含有所述VIGS沉默载体的菌液， 真空渗透， 负 压处理， 放气； 0024 将真空渗透后的花瓣用去离子水漂洗， 去除多余菌液； 0025 将所述花柄采用水培方式进行培养， 之后检测目的基因的表达水平以及花青苷积 累量的变化。 0026 所述带花柄的花朵的花发育时期为全开或花苞。 0027 抽真空渗透的持续时间为10min-15min。 0028 将所述

25、花柄采用水培方式进行培养的条件为： 将花柄浸于去离子水中， 在温度为8 、 湿度60的条件下暗培养1天； 之后转移至温度为23-25、 湿度60的条件下正常光照 培养3天。 0029 所述含有权利要求1或2所述重组载体的菌液为： 含有在烟草脆裂病毒TRV2载体上 插入序列表中序列1所示核苷酸序列和/或序列表中序列3所示核苷酸序列得到的重组载体 菌液以及含有烟草脆裂病毒TRV1载体的菌液。 0030 本发明利用同源克隆技术克隆了牡丹类黄酮糖基转移酶基因PsUF3GT和PsUF5GT 保守区段作为靶基因构建TRV2载体， 成功建立了VIGS沉默体系， 有效地降低了这两个基因 的表达量和总花青苷含量

26、。 本研究结果对牡丹基因功能研究具有重要意义， 也为解析牡丹 说明书 3/11 页 6 CN 107245497 A 6 色斑形成的分子机制奠定了基础。 0031 影响VIGS沉默效果的因素很多。 首先是沉默基因片段长度和位置的选择， 本发明 利用扩增保守区段长度在400-450bp的片段来沉默同源家族基因， 取得了较好的沉默效果。 如针对某一特异基因进行沉默时， 则需考虑序列的特异性， 可以通过沉默非翻译区或者特 异区段的办法， 确保沉默特异目标基因。 本发明采用烟草脆裂病毒TRV为载体， 其能有效地 将目标基因在生长点或分生组织中沉默， 并获得系统的沉默效果。 此外， 利用TRV沉默基因

27、后的植物材料对温度比较敏感， 本发明在光照培养箱控温(25)控湿(相对湿度60)的条 件下进行， 获得了较好的实验结果。 因此， 成功沉默基因需要严格掌控好每个技术环节。 0032 针对牡丹遗传转化困难、 无法验证基因功能等问题， 本发明通过VIGS技术， 采用二 因素三水平共9个试验处理， 利用VIGS技术成功沉默了PsUF3GT和PsUF5GT基因。 建立了 PsUFGTs最佳VIGS体系， 用PsUFGTs基因保守区段为靶片段， 以S4或者S2期带花柄的花朵为 材料， 抽真空渗透10min-15min后置于去离子水中， 暗培养1d(8， 湿度60)； 之后转移至 23-25、 湿度60的

28、环境， 正常光照培养3d后进行检测和分析。 本结果为验证牡丹UFGTs基 因的功能奠定了基础， 也为验证牡丹中其他重要功能基因提供了研究思路和技术依据。 附图说明 0033 图1为PsUF3GT靶片段核苷酸及推测编码的氨基酸序列； 下划线表示PSPG-box。 0034 图2为PsUF5GT靶片段核苷酸及推测编码的氨基酸序列； 下划线表示UDPG特征序 列。 0035 图3为含有TRV载体的菌液凝胶电泳检测结果； M为分子量标准从上到下分别为 1000bp、 900、 800、 700、 600、 500、 400、 300、 200、 100bp。 0036 图4不同处理沉默花瓣中PsUF3

29、GT基因的表达量分析； 小写字母表示显著性程度的 差异。 0037 图5不同处理沉默花瓣中PsUF5GT基因的表达量分析； 小写字母表示显著性程度的 差异。 0038 图6不同处理沉默PsUFGTs的花斑中的花青苷含量和成分分析。 具体实施方式 0039 用于本发明的紫斑牡丹品种 青海湖银波 (P.suffruticosa Qing Hai Hu Yin Bo )栽植于中国科学院植物研究所牡丹芍药种质资源圃， 其斑为紫红色， 非斑为白色， 非斑 部分未检测出花青苷， 斑部花青苷有四种： Pn3G、 Pn3G5G、 Cy3G和Cy3G5G(记载过该紫斑牡丹 品种 青海湖银波 (P.suffrut

30、icosa Qing Hai Hu Yin Bo )的非专利文献是： Zhang J J, Wang L S,Shu Q Y,Liu Z A,Li C H,Zhang J,Wei X L,Tian D K.2007.Comparison of anthocyanins in non-blotches and blotches of the petals of Xibei tree peony.Sci Hortic， 114： 104-111)。 0040 本发明所用VIGS载体来自烟草脆裂病毒载体(tobacco rattle virus， TRV)， TRV1/TRV2为中国农业大学观赏植物

31、采后和逆境生理实验室马男教授馈赠(记载过该载体 的非专利文献是： Tian J,Pei H X,Zhang S,Chen J W,Chen W,Yang R Y,Meng Y L,You J,Gao J P,Ma N.2014.TRV-GFP:a modified Tobacco rattle virus vector for 说明书 4/11 页 7 CN 107245497 A 7 efficient and visualizable analysis of gene function.J Exp Bot， 65： 311-322.)， 其带有卡那筛选标记和35S启动子， pTRV2带有B

32、amH I和Xho I等多克隆位点。 0041 所用标准品矢车菊素-3-葡糖苷(Cy3G)购自法国Extrasynthese公司(Genay， France)。 0042 实施例1、 0043 一、 基因克隆 0044 花瓣总RNA的提取参照试剂盒说明书进行(RNAprep Pure Plant Kit， FastQuant cDNA天根生化科技(北京)有限公司)。 根据公共数据库中UF3GT和UF5GT序列设计上下游引 物克隆靶片段。 用于VIGS沉默的PsUF3GT和PsUF5GT片段设计上下游引物并添加BamH I和 Xho I酶切位点。 扩增引物见表1。 0045 表1 本发明所用引物

33、序列相关信息 0046 0047 0048 注： 下划线表示碱基酶切位点。 0049 (1)PsUF3GT靶片段的克隆序列分析 0050 根据上下游引物扩增PsUF3GT靶片段长度为413bp， 其核苷酸序列如序列表中序列 1所示。 所用的PCR反应体系和程序见表2和表3， 所扩增的片段利用凝胶回收试剂盒(Easy Pure Quick Gel Extraction， 全式金生物技术有限公司)按照说明书进行回收， 并连接到 pEASY-T3载体(购自全式金生物技术有限公司)， 转化大肠杆菌感受态细胞(Trans1- T1Phage Resistant Chemically Competent

34、Cell， 购自全式金生物技术有限公司)。 阳性 克隆进行测序(由北京博迈德基因技术有限公司完成)。 序列用DNAman5.0及在线网络软件 说明书 5/11 页 8 CN 107245497 A 8 (http:/prosite.expasy.org/mydomains/)分析， 其属于Glycosyltransferase_GTB_type 超家族， 含有PSPG基序(plant secondary product glycosyltransferase box， 图1下划线 表示)。 PsUF3GT靶片段编码的PsUF3GT蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。 0051 表2： PCR

35、反应体系 0052 0053 表3： PCR扩增程序 0054 0055 (2)PsUF5GT基因克隆和序列分析 0056 克隆的PsUF5GT靶片段长度为418bp， 其核苷酸序列如序列表中序列3所示。 所用的 PCR反应体系和程序等方法同PsUF3GT。 序列用DNAman5.0进行分析， 并与公共数据可进行 BlastP分析， 其属于Glycosyltransferase_GTB_type超家族， 其氨基酸在337-380处有UDPG ( U D P - g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s ) 特 征 序 列 即 WcnQleVLshksvgC

36、FLTHCGwnSsleSLvcgv.PvvafPqwaDQ(图2下划线所示)。 PsUF5GT靶片段编 码的PsUF5GT蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示。 0057 二、 制备重组载体 0058 首先对含有TRV2和TRV1的菌液(为中国农业大学观赏植物采后和逆境生理实验室 马男教授馈赠； 记载过TRV1/TRV2的非专利文献是： Tian J,Pei H X,Zhang S,Chen J W, Chen W,Yang R Y,Meng Y L,You J,Gao J P,Ma N.2014.TRV-GFP:a modified Tobacco rattle virus vector

37、for efficient and visualizable analysis of gene function.J Exp Bot， 65： 311-322.)进行PCR鉴定， 鉴定引物见表1， 扩增体系和程序见表4 和表5。 所扩增长度分别为500bp(TRV1)和200bp(TRV2)(图3)。 0059 表4： PCR反应体系 说明书 6/11 页 9 CN 107245497 A 9 0060 0061 PCR扩增程序如下表5： 0062 表5： PCR扩增程序 0063 0064 含有TRV载体的菌液凝胶电泳检测结果见图3。 TRV1所扩增片段大小为500bp左右， TRV2大小为

38、200bp左右， 证实扩增正确， 可以用于后续研究。 0065 上述所克隆的PsUF3GT/PsUF5GT序列上下游分别含有BamH I和Xho I酶切位点， 含 有目的片段和TRV2载体的菌液进行质粒提取， 采用无内毒素质粒中提试剂盒(EndoFree Plasmind Midi Kit， 购自康为世纪生物科技有限公司)， 提取方法参照试剂盒说明书进行。 同时用上述2个酶将靶片段和TRV2进行双酶切(内切酶购自NEB)， 酶切反应根据试剂说明书 进行， 并见表6。 酶切体系混匀后， 置于37水浴过夜。 0066 表6： 双酶切体系 0067 0068 酶切完成后将PsUF3GT/PsUF5G

39、T靶片段与TRV2载体进行连接， 采用T4DNA连接酶， 连接体系见表7。 0069 表7： 连接体系 说明书 7/11 页 10 CN 107245497 A 10 0070 0071 连接之后转化E.coLi DH5 感受态细胞(购自康为世纪生物科技有限公司)， 用含 kan抗性的LB培养基筛选阳性单菌落， 再进行PCR、 质粒酶切鉴定。 鉴定正确， 将确定含有 TRV2-PsUF3GT和TRV2-PsUF5GT大肠杆菌菌液进行测序(由北京博迈德基因技术有限公司完 成)， 确保序列的正确性。 测序结果正确， 然后转化到农杆菌GV3101中(农杆菌感受态细胞购 自北京博迈德基因技术有限公司)

40、转化方法为常规冻融法， 转化后的农杆菌培养2-3d后， 将 单菌落菌液进行测序验证， 对验证正确的农杆菌进行培养， 用于VIGS试验。 0072 三、 VIGS体系建立 0073 采用二因素三水平试验体系(表8)进行VIGS试验。 因素A： 花发育时期， 对应的A1 (全开， S4)； A2(半开， S3)； A3(花苞， S2)。 因素B： 真空渗透时间， 分别为10min(B1)、 15min (B2)和20min(B3)。 TRV2-3GT和TRV2-5GT为目标基因， 相应的TRV2空载体为对照。 转化方法 参照文献Tian J,Pei H X,Zhang S,Chen J W,Che

41、n W,Yang R Y,Meng Y L,You J,Gao J P,Ma N.2014.TRV-GFP:a modified Tobacco rattle virus vector for efficient and visualizable analysis of gene function.J Exp Bot， 65： 311-322.， 采用抽真空法。 主 要细节包括重悬菌液的OD6001.0， 且pTRV2-3/5GT、 pTRV1和pTRV2菌液的OD600值相同。 将 pTRV2-3/5GT和pTRV1， pTRV2和pTRV1菌液按体积比1： 1分别混合， 暗处静置4h。 牡

42、丹花朵带 5cm花柄剪下， 随机分布于不同处理， 浸没在菌液中， 抽真空至0.7atm， 负压处理， 缓慢放气。 每个处理三朵花即重复3次。 将抽吸后的花瓣用去离子水漂洗， 去除多余菌液。 花柄浸于去 离子水中， 8， 湿度60左右， 暗培养1d； 之后转移至23-25， 湿度60左右， 正常光照培 养3d。 侵染4d后采样， 将花瓣的斑与非斑部分分开。 选取花瓣作为RNA提取检测样本和色素 抽提样本， RNA检测样本置于液氮中速冻并存于-80， 色素抽提样本经冷冻干燥处理后保 存于茶色干燥器中。 之后检测目的基因的表达水平以及花青苷积累量相对于对照的变化。 因非斑部分不积累花青苷， 所以侵染

43、后仅测斑部花青苷成分及含量。 0074 表8 用于VIGS体系的二因素三水平试验处理 说明书 8/11 页 11 CN 107245497 A 11 0075 0076 四、 基因表达分析 0077 基因表达分析参照文献(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X,Liu Z A,Wang L S.2015.Methylation mediated by an anthocyanin O- methyltransferase,is involved in purple flower coloration in Paeon

44、ia.J Exp Bot， 66： 6563-77)， 将所有样品进行总RNA的提取， 并反转录成cDNA， 作为荧光定量PCR的模 板。 具体方法参照试剂盒说明进行(FastQuant cDNA和SYBR Green， 天根生化科技(北京)有 限公司)并参考文献(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X, Liu Z A ,Wang L S .2015 .Methylation mediated by an anthocyanin O- methyltransferase,is involved in purple

45、flower coloration in Paeonia.J Exp Bot， 66： 6563-77)， 荧光定量的反应体系和程序见表9和表10。 本研究采用2- CT(Livak)法 计算实时荧光定量PCR实验中基因的相对表达量， PsTubulin(accession no.EF608942)作 为内参基因(Du H,Wu J,Ji K X,Zeng Q Y,Bhuiyad M W,Su S,Shu Q Y,Ren H X,Liu Z A,Wang L S.2015.Methylation mediated by an anthocyanin O-methyltransferase,is

46、 involved in purple flower coloration in Paeonia.J Exp Bot， 66： 6563-77)。 将花瓣 斑与非斑分开进行表达量分析， 分3次生物学和3次技术重复。 0078 表9 荧光定量PCR扩增体系 0079 0080 0081 表10 荧光定量PCR扩增程序 说明书 9/11 页 12 CN 107245497 A 12 0082 0083 结果： 花瓣中沉默UFGTs后基因的表达量分析 0084 利用所扩增保守区片段长分别为413bp和418bp的PsUF3GT和PsUF5GT基因片段构 建TRV2载体， 用于沉默目的基因。 通过二因

47、素三水平9个试验， 寻找UFGT基因沉默的最佳处 理， 对沉默后的基因表达量进行分析(图4和图5)。 通过对不同处理的斑与非斑中PsUF3GT和 PsUF5GT基因表达量分析发现， 9个处理中PsUF3GT基因的表达量在处理2的斑中降低最多， 比对照处理1、 处理6和处理8分别降低了65.0、 45.0和71.0。 PsUF5GT在处理7的非斑 中表达量降低最多， 比对照处理1和8分别降低了15.9和85.0。 0085 五、 斑部花青苷测定 0086 将干燥后的花斑进行称重提取花青苷(Li C H,Du H,Wang L S,Shu Q Y,Zheng Y R,Xu Y J,Zhang J

48、J,Zhang J,Yang R Z,Ge Y X.2009.Flavonoid composition and antioxidant activity of tree peony(Paeonia Section Moutan)Yellow Flowers.J Agric Food Chem， 57： 84968503.)， 即称取干燥花瓣0.1-0.2g， 用0.2甲酸甲醇溶液超声 20min， 并黑暗放置2h后12,000rpm离心5min充分提取， 各3个重复。 使用HPLC分析前， 取1mL 提取液， 用0.22 m尼龙微孔滤器过滤到样品瓶中。 所用分析系统为Dionex HPLC-DAD系统， 色谱柱为TSK gel ODS-80Ts QA， 4.6mm(内径)150mm(柱长)(日本Tosoh株式会社)。 花青 苷的定性和定量分析参照(Zhang J J,Wa