热稳定性提高的脂肪酶突变体 技术领域 本发明涉及热稳定性提高的脂肪酶突变体， 具体地说涉及利用分子生物学技术获 得热稳定性提高的脂肪酶突变体， 属于酶的基因工程技术领域。
背景技术 脂肪酶 (EC 3.1.1.3) 不仅能催化油脂水解， 也能在非水相中催化酯合成、 转酯 化、 酸解等反应， 被广泛地应用于化学， 食品， 制药和洗涤剂或生物能源工业中。 微生物是脂 肪酶的一个重要来源， 而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今， 已有超过 30 种根霉 脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度 1， 3- 位置选择性， 因此常用于油脂加 工中。 但是油脂加工通常需要在较高温度下进行， 而根霉脂肪酶属于中温脂肪酶， 在 65℃下 的半衰期仅有 15min 左右， 热稳定性差不仅限制了其应用范围， 而且易于失活， 增加了生产 成本。
定向进化属于非理性设计， 是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程， 针对 某一蛋白质酶的基因， 通过改进的诱变技术改造的酶的基因， 然后根据特定的改造目的， 筛 选有价值的天然酶。近 10 年来， 定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得巨大 的成功， 主要集中于提高酶的催化反应活性， 改进底物特异性， 提高热稳定性， 对映立体选 择性等方面 (Johannes TW et al.Curr.Opin.Microbiol， 2006， 9： 261-267)。
发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶 的华根霉 (Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021 菌株， 并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶 基因序列， 并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris) 中的高水平分泌表达 (Yu Xiao-Wei et al.J Mol CatalB ： Enzym， 2009， 57 ： 304-311)。 本发明以华根霉脂肪酶基因为 模板， 利用定向进化技术获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。
酶分子的热稳定性提高可以用其半衰期 (t50) 来体现。即酶的活力降低到原来活 力一半时所需要的时间。半衰期长， 则酶稳定性高。反之， 则稳定性差。因此， t50 的提高代 表了酶分子热稳定性的提高。
定义 ：
氨基酸和 DNA 核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认 IUPAC 命名法， 用三字母代码形式。 DNA 核酸序列采用公认 IUPAC 命名法。
脂肪酶突变体的标识
采用 “原始氨基酸位置替换的氨基酸” 来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如 Glu107Gly， 表示位置 107 的氨基酸由亲本脂肪酶的 Glu 替换成 Gly， 位置的编号对应于附件 序列表 1 中亲本华根霉脂肪酶 RCL 的氨基酸序列编号。 如 Leu180His/Thr218Ser， 表示位置 180 和位置 218 的氨基酸都发生了突变。
发明内容 本发明的目的在于提供热稳定性提高的脂肪酶突变体。
本发明的技术方案 ： 热稳定性提高的脂肪酶突变体， 其特征在于由亲本华根 霉 (Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021 脂 肪 酶 进 行 定 向 进 化， 通 过 易 错 PCR、 DNA Shuffling 和定点突变， 获得脂肪酶突变体， 亲本华根霉氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1 中在氨基 酸取代位置发生突变， 采用 “原始氨基酸 - 位置 - 替换的氨基酸” 来表示脂肪酶突变体中突 变的氨基酸， 所述脂肪酶突变体为 ： ，
表1
华根霉脂肪酶氨基酸突变体的氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 2， 有 22 个突变氨基酸， 底色标记显示。
用于表达所述的脂肪酶突变体的表达载体为 ： pPIC9K， pPIC3.5K， pPICZα， 用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母。5pPICZ ；
101974499 A CN 101974503
说明书3/8 页与亲本华根霉脂肪酶相比， 所述脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高， 以在 65℃ 下的半衰期 t50 来表示热稳定性的提高， 所述脂肪酶突变体的半衰期以及提高的倍数如下 ：
表2
亲本华根霉脂肪酶在 65℃下的半衰期 t50 为 16.5min。
本发明的有益效果 ： 运用分子生物学方法对亲本华根霉脂肪酶进行定向进化， 通 过易错 PCR、 DNA Shuffling 和定点突变， 获得脂肪酶突变体， 以半衰期 t50 表示， 脂肪酶突变
体的热稳定性得到了提高， 如表 2 所示。 附图说明 根据上海生工生物工程技术服务有限公司测序结果确定突变氨基酸， 各个突变体 的氨基酸突变位点测序结果如下。
图 1 脂肪酶突变体 1 ： Ser234Phe 测序峰图。
图 2 脂肪酶突变体 2 ： a： Pro168Leu， b： Val329Ala 测序峰图。
图 3 脂肪酶突变体 3 ： Cys160Leu 测序峰图。
图 4 脂肪酶突变体 4 ： a： His317Pro， b： Met101Thr 测序峰图。
图 5 脂肪酶突变体 5 ： a： Ser151Asn， b： Leu180His 测序峰图。
图 6 脂肪酶突变体 6 ： a： Val261Gly， b： Ser373Cys 测序峰图。
图 7 脂肪酶突变体 7 ： a： Asp182Tyr， b： Ala230Phe 测序峰图。
图 8 脂肪酶突变体 8 ： a： Leu180His， b： Thr218Ser 测序峰图。
图 9 脂肪酶突变体 9 ： a： Asn366Asp， b： Leu180His， c： Val329Ala 测序峰图。
图 10 脂肪酶突变体 10 ： a： Ser234Phe， b： Leu180His， c： Thr218Ser 测序峰图。
图 11 脂肪酶突变体 11 ： a： Ser234Phe， b： Pro168His， c： Val329Ala， d： Cys160Leu， e： His317Pro， f： Met101Thr 测序峰图。
图 12 脂肪酶突变体 12 ： a： Leu180His， b： Thr218Ser， c： Val261Gly， d： Lys161Arg 测序峰图。
图 13 脂肪酶突变体 13 ： a： Glu107Gly， b： Ala129Ser， C： Glu363Arg， d： Lys161Arg， e： Val261Gly， f： Leu180His 测序峰图。
图 14 脂肪酶突变体 14 ： a： Lys161Arg， b： Leu180His， c： Thr218Ser， d： Met101Thr， e： Thr183Ala， f： Glu107Gly， g： Ser151Asn， h： Glu363Arg 测序峰图。
图 15 脂肪酶突变体 15 ： a： Glu107Gly， b： Ala129Ser， c： Ser151Asn， d： Lys161Arg， e： Leu180His， f： Ser234Phe， g： Glu363Arg， h： Val329Ala 测序峰图。
图 16 脂 肪 酶 突 变 体 12-1 ： a： Ala230Phe， b： Leu180His， c： Thr218Ser， d： Val261Gly， e： Lys161Arg 测序峰图。
图 17 脂 肪 酶 突 变 体 13-1 ： a： Glu107Gly， b： Ala129Ser， c： Ser151Asn， d： Lys219Asp， e： Leu180His， f： Glu363Arg， g： Ala230Phe 测序峰图。
实施例中涉及到的培养基及试剂配方如下 ：
LB 液体培养基 ： 蛋白胨 1％， 酵母提取物 0.5％， NaCl 1％， pH7.0。
YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) ： Yeast Extract 1％， Trypton 2％， Dextrose 2％， 制作平板时加入 Agar 2％。121℃高压灭菌 20min。用于筛选 G418 抗 性时加入 G418 至终浓度为 0.25mg/mL-1.0mg/mL， 即 YPD-G418 平板。
MD(Minimal Dextrose Medium) ： YNB 1.34％， Biotin 4×10-5％， Dextrose 2％， Agar 2％。
MM(Minimal Methanol Medium) ： YNB1.34％， Biotin4×10-5％， Methanol 0.5％， Agar2％。
BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium) ： Yeast Extract 1％， Trypton 2％，
YNB 1.34％， Biotin 4×10-5％， Glycerol 1％， 磷酸钾溶液 pH 6.0、 100mmol/L。
BMMY(Buffered Methanol-complex Medium) ： Yeast Extract 1％， Trypton 2％， -5 YNB1.34％， Biotin 4×10 ％， Methanol 0.5％， 磷酸钾溶液 100mmol/L。
培养基中的单位为％ (W/V)
Fast-blue RR 染色剂 ： 360μL 萘酯 (20mg 萘酯溶于 1mL 2- 甲基甲酰胺 ) 与 160μL Fast blue RR(80mg Fast blue RR 溶于 1mL 二甲亚砜 ) 相混合。
实施例 1、 利用易错 PCR 方法构建表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库
利用易错 PCR 技术在体外向华根霉脂肪酶基因 proRCL 引入核苷酸突变。 易错 PCR 的反应条件如下 ：
dCTP(25mmol/L) 2μL
dTTP(25mmol/L) 2μL
dGTP(10mmol/L) 1μL
dATP(10mmol/L) 1μL
F(20pmol/μL) 1μL
R(20pmol/μL) 1μL Mg2+(25mM) 14μL 2+
Mn (5mM) 1.5μL
pPIC9K-proRCL
( 携带有华根霉脂肪酶基因 proRCL 的质粒 ) 0.5μL
Taq DNA 聚合酶 (2.5U) 1μL
10×PCR 缓冲液 ( 不含 MgCl2) 5μL
ddH2O 20μL
其中， 上游引物 F 和下游引物 R 序列为 ：
F： 5′ -TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3′ ；
R： 5′ -AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3′。
PCR 扩 增 条 件 ： 94 ℃ 3min ； 94 ℃ 1min， 59 ℃ 1min， 72 ℃ 2min， 30 个 循 环 ； 72℃ 10min。
易错 PCR 扩增产物经 DNA 纯化试剂盒纯化后， 限制性内切酶 Avr Ⅱ和 NotI 分别对 易错 PCR 扩增产物和质粒 pPIC9K 进行消化， 连接， 获得包含突变体基因的表达质粒， 转化至 E.coli JM109 感受态细胞。涂布于 LB( 含 100μg/μL 的 Amp) 平板。生长 12h 后， 将转化 子转移至 LB 液体培养基中培养， 获得表达质粒。
将表达质粒经限制性内切酶 SalI 线性化后， 电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞。 将转化液涂布于 MD 平板上， 30℃培养 2d， 构成表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库。
实施例 2、 利用 DNA Shuffling 方法构建表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库
利用 DNA Shuffling 的方法将易错 PCR 构建的脂肪酶突变体中的突变位点进行随 机组合。DNA Shuffling 的条件如下 ：
提取易错 PCR 方法构建的表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库的基因组， 用 DNase Ⅰ消化 30min， 将消化产物酚氯仿抽提除去蛋白质后溶解于 30μL 无菌水中。 以该基因组为 模板进行如下操作 ：
步骤一 ： PCR 反应体系 ：
Taq(2.5U) 0.5μL 2+
5×buffer(Mg plus) 10μL
基因组 0.5μL
dNTP(25mmol/L) 4μL
dd H2O 34.5μL
PCR 扩 增 条 件 ： 94 ℃ 3min ； 94 ℃ 1min， 59 ℃ 1min， 72 ℃ 2min， 10 个 循 环 ； 72℃ 10min。
步骤二 ： 在 上 述 体 系 中 加 入 引 物 F 和 R 各 1μL， PCR 扩 增 条 件 ： 94 ℃ 3min ； 94℃ 1min， 59℃ 1min， 72℃ 2min， 30 个循环 ； 72℃ 10min。
扩增产物经胶回收纯化试剂盒纯化后， 用实施例 1 同样的方法， 构建表达脂肪酶 突变体的毕赤酵母文库。
实施例 3、 高酶活脂肪酶突变体的筛选
将保存于 MD 平板上的毕赤酵母文库影印复制到 MM 平板上， 30℃培养 2 天， 以表达 亲本华根霉脂肪酶的毕赤酵母作为对照菌。
平板初筛 ： 每 12h 向 MM 平皿盖上补加 200μL 甲醇诱导重组脂肪酶表达， 诱导 2-3 天后， 将平板置于 65℃热处理 60min， 冷却到室温， 向平板上均匀倾倒 Fast-blue RR 染色剂 约 15mL， 2min 内单克隆所显黑褐色深于对照的菌落为初筛目的菌株。
96 孔板筛选方法 ： 向 1.8mL/ 孔 ( 平底 ) 的 96 孔板中加入 300μL BMGY 培养基， 121℃灭菌 20min。向其中接入初筛获得的菌株， 以表达亲本华根霉脂肪酶的毕赤酵母作为 对照菌， 30℃ 250r/min 振荡培养至 OD600 为 2-6。离心， 弃上清， 用 900μL BMMY 培养基重悬 菌体， 每 24h 加入 1％ (V/V) 甲醇诱导脂肪酶表达， 诱导 4 天， 离心收集上清， 根据实施例 4 的方法测定脂肪酶突变体在 65℃下的半衰期 t50。
筛选易错 PCR 和 DNA Shuffling 构建的表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库， 分别 获得 14 株热稳定性明显提高的菌株， 测定脂肪酶核苷酸序列 ( 由上海生工生物工程技术服 务有限公司测序 )， 利用三联体密码子推测脂肪酶的氨基酸序列， 脂肪酶突变体的氨基酸取 代及半衰期如表 3 所示。
表 3 脂肪酶突变体及其半衰期
实施例 4 脂肪酶突变体的 t50 测定
为测定脂肪酶的 t50 值， 需要对酶进行分离纯化。
摇瓶发酵 ： 接种量 10 ％ (V/V)， 25mL BMGY 培养基中， 30 ℃振荡培养 16 ～ 20h 至 OD600 为 2 ～ 6， 离心收集菌体， 用 BMMY 培养基稀释至 OD600 为 1， 每隔 24h 添加 0.5％的甲醇 诱导表达， 培养 3-4d 后， 收集发酵上清液。
分离纯化 ： 将突变菌株的发酵上清液经过 10KD 超滤膜浓缩， SP-SepharoseFF 强阳 离子交换层析和 Phenyl-Sepharose 6FF 疏水色谱柱层析后得到纯化的突变脂肪酶活性组 分。具体操作参考文献 Yu Xiao-Wei et al.JMol CatalB ： Enzym， 2009， 57 ： 304-311。
t50 的测定方法 ：
脂 肪 酶 活 力 的 测 定 方 法 为 pNPP 法 (Pencreach G et al.Enzyme and MicrobialTechnol.1996， 18 ： 417-422.)。酶活的定义为 pH8.0， 40 ℃下反应每分钟产生10
101974499 A CN 101974503说明书8/8 页1μmol 对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。脂肪酶在 65℃下半衰期的测 定方法为 ： 在 65℃下处理酶液， 在不同处理时间取样， pNPP 法测定脂肪酶残余酶活百分比 (％ )。以残余酶活百分比的 log 值对时间 T(min) 作图， 直线的斜率为失活常数 kinact。由 t50 ＝ ln2/kinact 得到脂肪酶在该温度下的 t50。
实施例 5 定点突变组合脂肪酶突变体的基因突变位点
经过上述易错 PCR 和 DNA Shuffling 突变文库的构建， 筛选获得如表 3 所示的脂 肪酶突变体。为了考察其中某一个突变及各突变的组合对脂肪酶突变体活力的影响， 对表 3 中的突变位点进行定点突变组合 ( 定点突变可以利用市售的试剂盒进行 )， 将含有上述突 变位点组合的基因与载体 pPIC9K 连接， 获得表达质粒， 后续毕赤酵母表达如实施例 1 所述。 用实施例 4 的方法测定脂肪酶突变体在 65℃下的 t50。热稳定性获得提高的脂肪酶突变体 如表 4 所示。
表 4 突变体脂肪酶及其 t50 提高的倍数
背景技术 脂肪酶 (EC 3.1.1.3) 不仅能催化油脂水解， 也能在非水相中催化酯合成、 转酯 化、 酸解等反应， 被广泛地应用于化学， 食品， 制药和洗涤剂或生物能源工业中。 微生物是脂 肪酶的一个重要来源， 而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今， 已有超过 30 种根霉 脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度 1， 3- 位置选择性， 因此常用于油脂加 工中。 但是油脂加工通常需要在较高温度下进行， 而根霉脂肪酶属于中温脂肪酶， 在 65℃下 的半衰期仅有 15min 左右， 热稳定性差不仅限制了其应用范围， 而且易于失活， 增加了生产 成本。
定向进化属于非理性设计， 是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程， 针对 某一蛋白质酶的基因， 通过改进的诱变技术改造的酶的基因， 然后根据特定的改造目的， 筛 选有价值的天然酶。近 10 年来， 定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得巨大 的成功， 主要集中于提高酶的催化反应活性， 改进底物特异性， 提高热稳定性， 对映立体选 择性等方面 (Johannes TW et al.Curr.Opin.Microbiol， 2006， 9： 261-267)。
发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶 的华根霉 (Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021 菌株， 并从该菌株中首次克隆得到脂肪酶 基因序列， 并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母 (Pichiapastoris) 中的高水平分泌表达 (Yu Xiao-Wei et al.J Mol CatalB ： Enzym， 2009， 57 ： 304-311)。 本发明以华根霉脂肪酶基因为 模板， 利用定向进化技术获得了热稳定性显著提高的脂肪酶突变体。
酶分子的热稳定性提高可以用其半衰期 (t50) 来体现。即酶的活力降低到原来活 力一半时所需要的时间。半衰期长， 则酶稳定性高。反之， 则稳定性差。因此， t50 的提高代 表了酶分子热稳定性的提高。
定义 ：
氨基酸和 DNA 核酸序列的命名法
使用氨基酸残基的公认 IUPAC 命名法， 用三字母代码形式。 DNA 核酸序列采用公认 IUPAC 命名法。
脂肪酶突变体的标识
采用 “原始氨基酸位置替换的氨基酸” 来表示脂肪酶突变体中突变的氨基酸。如 Glu107Gly， 表示位置 107 的氨基酸由亲本脂肪酶的 Glu 替换成 Gly， 位置的编号对应于附件 序列表 1 中亲本华根霉脂肪酶 RCL 的氨基酸序列编号。 如 Leu180His/Thr218Ser， 表示位置 180 和位置 218 的氨基酸都发生了突变。
发明内容 本发明的目的在于提供热稳定性提高的脂肪酶突变体。
本发明的技术方案 ： 热稳定性提高的脂肪酶突变体， 其特征在于由亲本华根 霉 (Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021 脂 肪 酶 进 行 定 向 进 化， 通 过 易 错 PCR、 DNA Shuffling 和定点突变， 获得脂肪酶突变体， 亲本华根霉氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1 中在氨基 酸取代位置发生突变， 采用 “原始氨基酸 - 位置 - 替换的氨基酸” 来表示脂肪酶突变体中突 变的氨基酸， 所述脂肪酶突变体为 ： ，
表1
华根霉脂肪酶氨基酸突变体的氨基酸序列为 SEQ ID NO ： 2， 有 22 个突变氨基酸， 底色标记显示。
用于表达所述的脂肪酶突变体的表达载体为 ： pPIC9K， pPIC3.5K， pPICZα， 用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母。5pPICZ ；
101974499 A CN 101974503
说明书3/8 页与亲本华根霉脂肪酶相比， 所述脂肪酶突变体的热稳定性获得了提高， 以在 65℃ 下的半衰期 t50 来表示热稳定性的提高， 所述脂肪酶突变体的半衰期以及提高的倍数如下 ：
表2
亲本华根霉脂肪酶在 65℃下的半衰期 t50 为 16.5min。
本发明的有益效果 ： 运用分子生物学方法对亲本华根霉脂肪酶进行定向进化， 通 过易错 PCR、 DNA Shuffling 和定点突变， 获得脂肪酶突变体， 以半衰期 t50 表示， 脂肪酶突变
体的热稳定性得到了提高， 如表 2 所示。 附图说明 根据上海生工生物工程技术服务有限公司测序结果确定突变氨基酸， 各个突变体 的氨基酸突变位点测序结果如下。
图 1 脂肪酶突变体 1 ： Ser234Phe 测序峰图。
图 2 脂肪酶突变体 2 ： a： Pro168Leu， b： Val329Ala 测序峰图。
图 3 脂肪酶突变体 3 ： Cys160Leu 测序峰图。
图 4 脂肪酶突变体 4 ： a： His317Pro， b： Met101Thr 测序峰图。
图 5 脂肪酶突变体 5 ： a： Ser151Asn， b： Leu180His 测序峰图。
图 6 脂肪酶突变体 6 ： a： Val261Gly， b： Ser373Cys 测序峰图。
图 7 脂肪酶突变体 7 ： a： Asp182Tyr， b： Ala230Phe 测序峰图。
图 8 脂肪酶突变体 8 ： a： Leu180His， b： Thr218Ser 测序峰图。
图 9 脂肪酶突变体 9 ： a： Asn366Asp， b： Leu180His， c： Val329Ala 测序峰图。
图 10 脂肪酶突变体 10 ： a： Ser234Phe， b： Leu180His， c： Thr218Ser 测序峰图。
图 11 脂肪酶突变体 11 ： a： Ser234Phe， b： Pro168His， c： Val329Ala， d： Cys160Leu， e： His317Pro， f： Met101Thr 测序峰图。
图 12 脂肪酶突变体 12 ： a： Leu180His， b： Thr218Ser， c： Val261Gly， d： Lys161Arg 测序峰图。
图 13 脂肪酶突变体 13 ： a： Glu107Gly， b： Ala129Ser， C： Glu363Arg， d： Lys161Arg， e： Val261Gly， f： Leu180His 测序峰图。
图 14 脂肪酶突变体 14 ： a： Lys161Arg， b： Leu180His， c： Thr218Ser， d： Met101Thr， e： Thr183Ala， f： Glu107Gly， g： Ser151Asn， h： Glu363Arg 测序峰图。
图 15 脂肪酶突变体 15 ： a： Glu107Gly， b： Ala129Ser， c： Ser151Asn， d： Lys161Arg， e： Leu180His， f： Ser234Phe， g： Glu363Arg， h： Val329Ala 测序峰图。
图 16 脂 肪 酶 突 变 体 12-1 ： a： Ala230Phe， b： Leu180His， c： Thr218Ser， d： Val261Gly， e： Lys161Arg 测序峰图。
图 17 脂 肪 酶 突 变 体 13-1 ： a： Glu107Gly， b： Ala129Ser， c： Ser151Asn， d： Lys219Asp， e： Leu180His， f： Glu363Arg， g： Ala230Phe 测序峰图。
实施例中涉及到的培养基及试剂配方如下 ：
LB 液体培养基 ： 蛋白胨 1％， 酵母提取物 0.5％， NaCl 1％， pH7.0。
YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium) ： Yeast Extract 1％， Trypton 2％， Dextrose 2％， 制作平板时加入 Agar 2％。121℃高压灭菌 20min。用于筛选 G418 抗 性时加入 G418 至终浓度为 0.25mg/mL-1.0mg/mL， 即 YPD-G418 平板。
MD(Minimal Dextrose Medium) ： YNB 1.34％， Biotin 4×10-5％， Dextrose 2％， Agar 2％。
MM(Minimal Methanol Medium) ： YNB1.34％， Biotin4×10-5％， Methanol 0.5％， Agar2％。
BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium) ： Yeast Extract 1％， Trypton 2％，
YNB 1.34％， Biotin 4×10-5％， Glycerol 1％， 磷酸钾溶液 pH 6.0、 100mmol/L。
BMMY(Buffered Methanol-complex Medium) ： Yeast Extract 1％， Trypton 2％， -5 YNB1.34％， Biotin 4×10 ％， Methanol 0.5％， 磷酸钾溶液 100mmol/L。
培养基中的单位为％ (W/V)
Fast-blue RR 染色剂 ： 360μL 萘酯 (20mg 萘酯溶于 1mL 2- 甲基甲酰胺 ) 与 160μL Fast blue RR(80mg Fast blue RR 溶于 1mL 二甲亚砜 ) 相混合。
实施例 1、 利用易错 PCR 方法构建表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库
利用易错 PCR 技术在体外向华根霉脂肪酶基因 proRCL 引入核苷酸突变。 易错 PCR 的反应条件如下 ：
dCTP(25mmol/L) 2μL
dTTP(25mmol/L) 2μL
dGTP(10mmol/L) 1μL
dATP(10mmol/L) 1μL
F(20pmol/μL) 1μL
R(20pmol/μL) 1μL Mg2+(25mM) 14μL 2+
Mn (5mM) 1.5μL
pPIC9K-proRCL
( 携带有华根霉脂肪酶基因 proRCL 的质粒 ) 0.5μL
Taq DNA 聚合酶 (2.5U) 1μL
10×PCR 缓冲液 ( 不含 MgCl2) 5μL
ddH2O 20μL
其中， 上游引物 F 和下游引物 R 序列为 ：
F： 5′ -TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3′ ；
R： 5′ -AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3′。
PCR 扩 增 条 件 ： 94 ℃ 3min ； 94 ℃ 1min， 59 ℃ 1min， 72 ℃ 2min， 30 个 循 环 ； 72℃ 10min。
易错 PCR 扩增产物经 DNA 纯化试剂盒纯化后， 限制性内切酶 Avr Ⅱ和 NotI 分别对 易错 PCR 扩增产物和质粒 pPIC9K 进行消化， 连接， 获得包含突变体基因的表达质粒， 转化至 E.coli JM109 感受态细胞。涂布于 LB( 含 100μg/μL 的 Amp) 平板。生长 12h 后， 将转化 子转移至 LB 液体培养基中培养， 获得表达质粒。
将表达质粒经限制性内切酶 SalI 线性化后， 电转化毕赤酵母 GS115 感受态细胞。 将转化液涂布于 MD 平板上， 30℃培养 2d， 构成表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库。
实施例 2、 利用 DNA Shuffling 方法构建表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库
利用 DNA Shuffling 的方法将易错 PCR 构建的脂肪酶突变体中的突变位点进行随 机组合。DNA Shuffling 的条件如下 ：
提取易错 PCR 方法构建的表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库的基因组， 用 DNase Ⅰ消化 30min， 将消化产物酚氯仿抽提除去蛋白质后溶解于 30μL 无菌水中。 以该基因组为 模板进行如下操作 ：
步骤一 ： PCR 反应体系 ：
Taq(2.5U) 0.5μL 2+
5×buffer(Mg plus) 10μL
基因组 0.5μL
dNTP(25mmol/L) 4μL
dd H2O 34.5μL
PCR 扩 增 条 件 ： 94 ℃ 3min ； 94 ℃ 1min， 59 ℃ 1min， 72 ℃ 2min， 10 个 循 环 ； 72℃ 10min。
步骤二 ： 在 上 述 体 系 中 加 入 引 物 F 和 R 各 1μL， PCR 扩 增 条 件 ： 94 ℃ 3min ； 94℃ 1min， 59℃ 1min， 72℃ 2min， 30 个循环 ； 72℃ 10min。
扩增产物经胶回收纯化试剂盒纯化后， 用实施例 1 同样的方法， 构建表达脂肪酶 突变体的毕赤酵母文库。
实施例 3、 高酶活脂肪酶突变体的筛选
将保存于 MD 平板上的毕赤酵母文库影印复制到 MM 平板上， 30℃培养 2 天， 以表达 亲本华根霉脂肪酶的毕赤酵母作为对照菌。
平板初筛 ： 每 12h 向 MM 平皿盖上补加 200μL 甲醇诱导重组脂肪酶表达， 诱导 2-3 天后， 将平板置于 65℃热处理 60min， 冷却到室温， 向平板上均匀倾倒 Fast-blue RR 染色剂 约 15mL， 2min 内单克隆所显黑褐色深于对照的菌落为初筛目的菌株。
96 孔板筛选方法 ： 向 1.8mL/ 孔 ( 平底 ) 的 96 孔板中加入 300μL BMGY 培养基， 121℃灭菌 20min。向其中接入初筛获得的菌株， 以表达亲本华根霉脂肪酶的毕赤酵母作为 对照菌， 30℃ 250r/min 振荡培养至 OD600 为 2-6。离心， 弃上清， 用 900μL BMMY 培养基重悬 菌体， 每 24h 加入 1％ (V/V) 甲醇诱导脂肪酶表达， 诱导 4 天， 离心收集上清， 根据实施例 4 的方法测定脂肪酶突变体在 65℃下的半衰期 t50。
筛选易错 PCR 和 DNA Shuffling 构建的表达脂肪酶突变体的毕赤酵母文库， 分别 获得 14 株热稳定性明显提高的菌株， 测定脂肪酶核苷酸序列 ( 由上海生工生物工程技术服 务有限公司测序 )， 利用三联体密码子推测脂肪酶的氨基酸序列， 脂肪酶突变体的氨基酸取 代及半衰期如表 3 所示。
表 3 脂肪酶突变体及其半衰期
实施例 4 脂肪酶突变体的 t50 测定
为测定脂肪酶的 t50 值， 需要对酶进行分离纯化。
摇瓶发酵 ： 接种量 10 ％ (V/V)， 25mL BMGY 培养基中， 30 ℃振荡培养 16 ～ 20h 至 OD600 为 2 ～ 6， 离心收集菌体， 用 BMMY 培养基稀释至 OD600 为 1， 每隔 24h 添加 0.5％的甲醇 诱导表达， 培养 3-4d 后， 收集发酵上清液。
分离纯化 ： 将突变菌株的发酵上清液经过 10KD 超滤膜浓缩， SP-SepharoseFF 强阳 离子交换层析和 Phenyl-Sepharose 6FF 疏水色谱柱层析后得到纯化的突变脂肪酶活性组 分。具体操作参考文献 Yu Xiao-Wei et al.JMol CatalB ： Enzym， 2009， 57 ： 304-311。
t50 的测定方法 ：
脂 肪 酶 活 力 的 测 定 方 法 为 pNPP 法 (Pencreach G et al.Enzyme and MicrobialTechnol.1996， 18 ： 417-422.)。酶活的定义为 pH8.0， 40 ℃下反应每分钟产生10
101974499 A CN 101974503说明书8/8 页1μmol 对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。脂肪酶在 65℃下半衰期的测 定方法为 ： 在 65℃下处理酶液， 在不同处理时间取样， pNPP 法测定脂肪酶残余酶活百分比 (％ )。以残余酶活百分比的 log 值对时间 T(min) 作图， 直线的斜率为失活常数 kinact。由 t50 ＝ ln2/kinact 得到脂肪酶在该温度下的 t50。
实施例 5 定点突变组合脂肪酶突变体的基因突变位点
经过上述易错 PCR 和 DNA Shuffling 突变文库的构建， 筛选获得如表 3 所示的脂 肪酶突变体。为了考察其中某一个突变及各突变的组合对脂肪酶突变体活力的影响， 对表 3 中的突变位点进行定点突变组合 ( 定点突变可以利用市售的试剂盒进行 )， 将含有上述突 变位点组合的基因与载体 pPIC9K 连接， 获得表达质粒， 后续毕赤酵母表达如实施例 1 所述。 用实施例 4 的方法测定脂肪酶突变体在 65℃下的 t50。热稳定性获得提高的脂肪酶突变体 如表 4 所示。
表 4 突变体脂肪酶及其 t50 提高的倍数
最后， 还需注意到的是， 上述列举的仅是本发明的若干个实施例。显然， 本发明不 限于以上实施例。11101974499 A CN 101974503
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