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1、10申请公布号CN102051409A43申请公布日20110511CN102051409ACN102051409A21申请号200910236476422申请日20091029C12Q1/6820060171申请人中国中医科学院中药研究所地址100700北京市东直门内南小街16号72发明人黄璐琦钱丹陈敏崔光红袁庆军54发明名称中药黄芪原植物的分子鉴别方法57摘要本发明提供了一种中药黄芪原植物的分子鉴别方法。首次利用叶绿体的CPDNA的TRNHPSBA基因间序列将中药黄芪的原植物膜荚黄芪ASTRAGALUSMEMBRANACEUSFISCHBGE、蒙古黄芪AMEMBRANACEUSFISCHB。
2、GEVARMONGHOLICUSBGEHSIAO，和淡紫花黄芪AMEMBRANACEUSFPALLIDIPURPUREUSHSIAO鉴别开。通过DNA提取、PCR特异性扩增、测序、数据分析得出不同的单倍型。淡紫花黄芪的2个居群的40个个体拥有特有单倍型HAP1。蒙古黄芪所有居群拥有单倍型HAP2、HAP3、HAP4、HAP5和HAP10。膜荚黄芪拥有单倍型HAP6、HAP7、HAP8和HAP9四种单倍型。3种黄芪原植物相互之间没有交叉的单倍型。通过单倍型和进化树分析，我们可以成功的将黄芪原植物区分开，对CPDNATRNHPSBA片段在中药鉴定中的应用做出有益尝试。51INTCL19中华人民共和。
3、国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图3页CN102051415A1/1页21一种黄芪原植物的鉴别方法，其特征在于该鉴别方法采用测序及单倍型的方法，该方法包括下列步骤黄芪原植物的总DNA的提取；叶绿体引物的筛选及测序条件的优化；PCR扩增；PCR产物测序；测序结果分析及判定。2根据权利要求1所述的一种黄芪原植物的鉴别方法，其特征在于黄芪原植物的总DNA可以从干的或新鲜黄芪原植物材料中提取。3根据权利要求2所述的一种黄芪原植物的鉴别方法，其特征在于黄芪材料可以是黄芪的任一部分或黄芪粉末。4根据权利1所述的一种黄芪原植物的鉴别方法，其特征在于筛选的PCR扩增的引物，筛选在黄芪。
4、原植物的叶绿体TRNHPSBA序列，其序列为TRNH5CGCGCATGGTGGATTCACAATCC3PSBA5GTTATGCATGAACGTAATGCTC35用权利要求4所述的引物进行PCR反应，PCR反应参数为94预变性4MIN；进行30次循环9445S，5830S，7290S，后延伸727MIN，获得扩增产物。6根据权利要求5所述的方法扩增后，PCR扩增产物直接测序。7根据权利要求1所述的一种黄芪原植物的鉴别方法，其特征在于叶绿体TRNHPSBA序列的单倍型分析及判定可以采用软件进行分析，也可以人工统计。权利要求书CN102051409ACN102051415A1/6页3中药黄芪原植物的。
5、分子鉴别方法技术领域0001本发明提供一种鉴别中药材原植物的方法，明确的说是鉴别膜荚黄芪、蒙古黄芪和淡紫花黄芪的一种方法，设计DNA测序和单倍型的分子标记法。背景技术0002黄芪是我国常用中药材之一，用药历史悠久，始载于神农本草经，具补气固表，利尿，托毒排脓，敛疮生肌功效。2005版中国药典中收载蒙古黄芪ASTRAGALUSMEMBRANACEUSFISCHBGEVARMONGHOLICUSBGEHSIAO或膜荚黄芪AMEMBRANACEUSFISCHBGE的干燥根作为正品。淡紫花黄芪AMEMBRANACEUSFPALLIDIPURPUREUSHSIAO是中国黄芪属特有植物，中国植物志记载淡紫。
6、花黄芪分布于甘肃、宁夏、青海及四川西北部，与膜荚黄芪有同样的药用价值做膜荚黄芪用。0003黄芪是个广布种，黄芪的原植物中存在多个变异类群，它们形态上十分相似，难以区别，给鉴定工作带来了非常大的困难和混乱。要求鉴别者具备丰富的鉴别经验，而且根据形态特征很难进行准确地鉴别。随着分子生物学技术的不断进步，在数小时内快速鉴别膜荚黄芪、蒙古黄芪和淡紫花黄芪已成为可能，越来越受到关注。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的PCR引物及方法。发明内容0004本发明提供了一种采用叶绿体TRNHPSBA片段的单倍型的分子标记方法对中药黄芪原植物进行鉴别的方法。0005本发明采用叶绿体TR。
7、NHPSBA片段鉴别中药黄芪原植物，该方法包括下列步骤0006黄芪原植物的总DNA的提取；0007叶绿体义务的筛选及测序条件的优化；0008PCR扩增；0009PCR产物测序；0010测序结果分析及判定。0011首先采用改进CTAB法提取中药黄芪原植物膜荚黄芪、蒙古黄芪及淡紫花黄芪的总DNA，黄芪原植物材料可以是黄芪的干燥新鲜叶片，也可以是黄芪的根，皆研成细粉。CTAB法可以是CTAB高盐法，CTAB低PH法；其次筛选合适的叶绿体引物。本发明的引物设计参照了SANGT所采用的引物SANGT，CRAWFORDDJ，STUESSYTF1997CHLOROPLASTDNAPHYLOGENY，RETI。
8、CULATEEVOLUTION，ANDBIOGEOGRAPHYOFPAEONIAPAEONIACEAEAMERICANJOURNALOFBOTANY，8411201136，本发明采用的是20L反应体系，10MOLL1上游引物05L，10MOLL1下游引物05L。反应体系扩大或缩小，引物可随之增多或减少。然后再根据已公知的技术，对所提取的DNA进行PCR扩增分子克隆实验指南，PCR扩增产物电泳采用琼脂糖凝胶法分子克隆实验指南。一般地，染色方法选用的是溴化乙锭EB。PCR产物用DNA测序BDTV31试剂盒进行测序PCR后，在说明书CN102051409ACN102051415A2/6页4ABI31。
9、30基因分析仪上直接测序。0012最后，测序的测序结果用CONTIGEXPRESS软件进行序列的校对排序，并加以手工适当校正。然后用软件CLUSTALXVERSION181比对排列，所有的插入INDELS或缺失GAPS视同相同的突变。所有的序列校对正确后，统计CPDNA单倍型。依据PONS和PETIT所描述的方法，基于相同的单倍型频率，CPDNA的居群内遗传多样性HS和总的遗传多样性HT，居群间遗传分化系数GST，用程序HAPLONST进行计算。用TCSVERSION113软件构建单倍型网状进化树。0013根据本发明提供的方法，所有试剂包括本发明CTAB法所用试剂；所筛选的引物，其他PCR反应。
10、中所需用的酶或试剂，实现本发明所必需的其他酶或试剂或材料，可以用液体形式或冻干粉剂装入一个或多个可以接受的容器内制备成试剂盒，用于黄芪原植物的鉴别。附图说明0014图1为TRNHPSBA片段PCR鉴别结果0015MDNA分子量标准从上至下依次为2000BP、1000BP、750BP、500BP、250BP、100BP。120为AMGSSCW居群20个个体的TRNHPSBA片段PCR扩增结果。0016图2为用TCSVERSION113软件构建的单倍型网状进化树0017图3为10个单倍型的序列比对图具体实施方式00181材料0019三种黄芪材料采自甘肃、内蒙古、山西、黑龙江、吉林和山东六省见表1。。
11、为野外硅胶快速干燥的新鲜叶片，凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所标本馆CMMI，经中国科学院植物研究所朱相云教授鉴定。0020表1样品来源表0021说明书CN102051409ACN102051415A3/6页5002200232改进CTAB法提取黄芪原植物膜荚黄芪、蒙古黄芪和淡紫花黄芪的总DNA00241取材料适量，去除表面污染后在研钵中加液氮快速研磨以避免DNA的降解成细粉，材料研的越细越好。00252取少量置于15MLEP管中，加入65预热的CTAB提取缓冲液700L，充分振荡混匀。00263将离心管置65水浴中保温2小时，期间振荡数次。00274取出，样品冷却至室温后加氯仿异戊醇2。
12、41600L，轻缓颠倒混匀，7500RPM离心10MIN，转移上清液至一新的EP管中。00285加入等体积20预冷的异丙醇，沉降DNA，轻缓颠倒混匀，可见白色絮状沉淀，20放置30MIN。10000RPM离心15MIN，弃上清。00296沉淀用70乙醇、无水乙醇各洗涤一次。室温挥干乙醇。用2050L无菌高纯水溶解DNA。00307用琼脂糖凝胶电泳和核酸定量检测DNA质量和含量。003184保存备用。00323PCR扩增0033TRNHPSBA片段的扩增引物为TRNH5CGCGCATGGTGGATTCACAATCC3和PSBA5GTTATGCATGAACGTAATGCTC3。0034PCR扩增用。
13、20L扩增体系DNA50NG，10PCRBUFFER2L，DNTP2L，10MOLL1上游引物05L，10MOLL1下游引物05L，EXTAQDNA酶1U，DDH2O补足总体积20L。0035扩增的程序为94预变性4MIN；94变性45S，58复性30S，72延伸90S共30说明书CN102051409ACN102051415A4/6页6个循环，72延伸7MIN，4保存。扩增的产物用10的琼脂糖凝胶含EB在1TAE缓冲液电泳，SYNGENE型凝胶成像系统下观察、拍照，AMGSSCW居群20个个体的电泳如图1，4保存。00364PCR产物的测序0037在DNA测序BDTV31试剂盒中文操作手册中。
14、的反应体系和热循环条件的基础上，对BIGDYE的用量，退火温度进行优化后得到合适的反应体系和热循环。003810L反应体系00390040测序PCR热循环条件0041961MIN9610SEC565SEC604MINX25个循环4保温00425测序PCR产物的纯化10L反应体系，酒精/EDTA/NAAC法00431每管加入1L125MMEDTA，1L3MNAAC到管底。00442每管加入25L100酒精，铝箔封严密，震荡混匀4次，室温放置15MIN。0045312000RPM离心30MIN，倒置，弃上清。00464每管加入35L70酒精，12000RPM4离心15MIN；马上倒置，弃上清。00。
15、475重复第4步1次。00486室温挥发净酒精，加入10LHIDIFORMAMIDE溶解DNA；或者铝箔密封后于4保存。00497溶解后的样品需要在95变性4MIN，迅速置冰中冷却4MIN后，上样电泳。00506数据处理0051测序结果用CONTIGEXPRESS软件进行序列的校对排序，并加以手工适当校正。用CLUSTALX软件进行序列的比对。所有的序列校正比对正确后，统计CPDNA单倍型。以每个居群不同单倍型的个体数目和总的个体数计算单倍型频率。然后计算出每个居群的单倍型多样度；依据PONS和PETIT所描述的方法，基于相同的单倍型频率，CPDNA的居群内平均遗传多样性HS和总的遗传多样性H。
16、T，居群间遗传分化系数GST和NST值，用程序HAPLONST进行计算，该程序在网站HTTP/WWWPIERROTONINRAFR/GENETICS/LABO/SOFTWARE获得。用TCSVERSION113软件构建单倍型网状进化树00527分析结果0053黄芪21个居群407个个体CPDNA的TRNHPSBA基因间序列排列后的长度为331BP，没有长度多样性。A/T含量丰富，达74297445，这与大多数CPDNA基因间区碱基组成成分相符。12个位点发生了核苷酸的变异，形成了10个单倍型HAP1HAP10。这10种单倍型序列注册于GENBANK数据库中，注册号分别为GQ139474GQ13。
17、9483，单倍型序说明书CN102051409ACN102051415A5/6页7列进行比较后共发现8个变异位点，插入或缺失分别为15BP、31BP、89BP、108BP、109BP、131132BP2BP、133139BP之间7BP、240BP，统计结果见表2，序列比对如图3。黄芪原植物的每个居群单倍型数量、单倍型组成见表3。应用TCS程序构建10个单倍型的网状进化树见图3。这种方式应用溯祖理论来推测单倍型间的亲缘关系，可信度在95以上。0054淡紫花黄芪的2个居群的40个个体拥有特有单倍型HAP1。蒙古黄芪所有居群拥有单倍型HAP2、HAP3、HAP4、HAP5和HAP10。大部分的蒙古黄。
18、芪736190/258拥有单倍型HAP2；膜荚黄芪拥有单倍型HAP6、HAP7、HAP8和HAP9四种单倍型。大部分的膜荚黄芪67974/109拥有单倍型HAP7。0055淡紫花黄芪拥有独特的单倍型HAP1，能与蒙古黄芪和膜荚黄芪明显的区分开。膜荚黄芪和蒙古黄芪拥有一些专属单倍型，3种黄芪原植物相互之间没有交叉的单倍型。相互之间没有交叉，利用单倍型，在试验所使用的材料中可以达到100的鉴别。0056表2黄芪原植物CPDNATRNHPSBA片段10种单倍型间的序列变异位点00570058表321个居群的CPDNA单倍型频率0059说明书CN102051409ACN102051415A6/6页8说明书CN102051409ACN102051415A1/3页9图1图2说明书附图CN102051409ACN102051415A2/3页10说明书附图CN102051409ACN102051415A3/3页11图3说明书附图CN102051409A。