尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌及其构建方法与应用.pdf

本发明公开了一种遗传较稳定的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11 CGMCC NO.2976；本发明同时提供了汉逊酵母菌的构建方法，包括：1)构建含有汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的重组质粒p18HURA；2)构建HURA3基因被破坏的重组质粒pHURK；将步骤2)的质粒pHURK用酵母菌完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。本发明进一步公开了构建的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌在生产外源蛋白中的应用。

1、  尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCC NO.2976。

2、  一种构建权利要求1所述尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌的方法，按以下步骤进行：
1)构建含有汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的重组质粒p18HURA；
2)构建HURA3基因被破坏的重组质粒pHURK；
将步骤2)的质粒pHURK用酵母菌完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。

3、  权利要求1所述尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCC NO.2976在生产外源蛋白中的应用。

4、  如权利要求3所述的应用，其中所述的外源蛋白是淀粉酶或植酸酶。

尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种重组汉逊酵母菌及其构建方法与其在生产外源蛋白中的应用。更具体的说本发明是尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌及其构建方法与应用。
背景技术
利用基因工程技术获得有重要生物学活性的蛋白质是现代生物技术的重要目标。在体外表达蛋白质，重要的是在努力提高表达量的同时，最大限度地保持产物的空间结构和生物学活性与天然蛋白一致。为此人们建立了大肠杆菌、杆状病毒、哺乳动物细胞和酵母四大外源基因表达体系以适应各种来源的蛋白质在体外高效表达。其中的酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，拥有转录后加工修饰功能，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质.与昆虫表达系统和哺乳动物表达系统相比，酵母表达系统操作简便，成本低廉，可大规模进行发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。
在过去几十年的时间里，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为第一个真核基因表达系统得到了广泛的应用。但这一表达系统在应用过程中也存在诸多不足之处，如外源基因表达水平不高、表达蛋白的分泌水平低及多肽链糖基化过度、菌株不稳定等。而其他的酵母菌株，尤其是甲醇营养型酵母在外源基因的表达上则显示出更大的优势：重组菌株遗传稳定性高，外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10-100倍，且没有过度糖基化的现象，因此适于大规模发酵生产目的蛋白。其中的汉逊酵母(Hansenula)除具有上述优点外，还具有其特有的优势：(1)可利用甲醇氧化酶基因(MOX)启动子和甲醛脱氢酶基因(FMD)启动子等强启动子高效地启动外源基因的表达；(2)非同源重组的频率高，因而重组质粒可以高拷贝整合到染色体上，易获得高拷贝整合的转化子；(3)表达的外源蛋白通常贮存在过氧化物酶体内，可使其免受胞内蛋白酶的降解，并且降低了对细胞的毒害作用；(4)能用廉价的培养基进行高密度发酵，进一步提高外源基因的表达水平；(5)耐高温，最适生长温度为37℃-43℃，生长速率快，大规模发酵的培养时间短、污染率低。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
发明内容
本发明的目的是提供一种遗传较稳定的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌。本发明提供的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌，是乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破坏的汉逊酵母菌。
本发明公开了的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCC N0.2976，已于2009年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为YH-11CGMCC NO.2976，分类命名为：异常毕赤酵母，Pichia anomala。菌落呈凸起状，乳白色、有光泽、边缘整齐，细胞呈椭圆形，该菌株的最适生长温度为37℃，pH为5.5。
本发明进一步公开了构建尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌的方法，按以下步骤进行：
1)构建含有汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的重组质粒p18HURA；
2)构建HURA3基因被破坏的重组质粒pHURK；
将步骤2)的质粒pHURK用酵母菌完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。
具体构建方法的详细描述如下：
1)构建乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体；重组载体可为pHURK。
2)将步骤1)中的重组载体导入野生型汉逊酵母菌中，优选为汉逊酵母菌(Hansenula)。筛选得到乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被破坏的汉逊酵母菌。其中，所述筛选标记基因可为G418抗性基因、新霉素抗性基因或铜离子抗性基因。
所述G418抗性基因可为KanMX。来源于pFA6a-KanMX。
用于构建所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)被筛选标记基因灭活的重组载体的出发载体可为基因工程领域中的质粒载体、丝状噬菌体载体或酵母菌穿梭载体，优选为pUC18、pUC19、pUC118、pUC119等，尤其优选为pUC18或pUC19。
所述KanMX可来源于pFA6a-KanMX。
所述野生型汉逊酵母菌优选为汉逊酵母菌(Hansenula)。
所述乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因被筛选标记基因灭活的重组载体可为pHURK。
所述重组汉逊酵母菌为汉逊酵母菌(Hansenula)。
本发明所述的外源蛋白是淀粉酶或植酸酶。
本发明通过基因工程手段，构建了遗传稳定的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌珠，特别是汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCC NO.2976。本发明获得的HURA3基因功能缺失的汉逊酵母突变株的HURA3基因内部插入了5个碱基，造成第10个密码子之后发生移码突变，使得细胞不能产生有活性的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶，将该HURA3基因功能缺失的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母突变株(Hansenula)命名为YH-11。该菌株比目前国内外所用的逊酵母菌所有的优点：
(1)有丝分裂遗传稳定性高，回复突变率低。
(2)具有自主复制序列(HARS)，重组的频率高，重组质粒可以高拷贝整合到染色体上，易获得高拷贝整合的转化子。
(3)可利用甲醇氧化酶(MOX)启动子和甲醛脱氢酶基因(FMD)启动子等强启动子，高效地启动外源基因的表达。
(4)蛋白的表达通常在过氧化物酶体内进行，可使其免受细胞内蛋白酶的降解，并降低了对细胞的毒害作用。
(5)能利用廉价的化学合成培养基进行细胞高密度发酵，不需要添加价格昂贵的天然组分(如酵母粉、蛋白胨)，进一步降低了生产成本并提高了外源基因的表达水平。
(6)耐高温，最适生长温度为37-430C，生长速率快，大规模发酵的培养时间短。
(7)发酵中以甘油或甲醇为唯一碳源和能源，能利用甘油的微生物不多，能利用甲醇的微生物更少，发酵染菌率低。
(8)外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10倍左右，且没有过度糖基化现象，因此适合于大规模发酵生产目的蛋白。
附图说明：
图1为重组质粒p18HURA的构建示意图；
图2为尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌构建示意图；
图3为重组质粒pMOX-Amy的物理图谱；
图4为重组质粒pMOXα-Amy的物理图谱；
图5为重组质粒pMOXα-appA的物理图谱。
具体实施方式
为了简单和清楚的目的，下文恰当的省略了公知技术的描述，以免那些不必要的细节影响对本技术方案的描述。以下结合实例对本发明做进一步的说明。其中实施例中所用限制性内切酶均购自TaKaRa公司。
实施例1
汉逊酵母菌(Hansenula)的构建
一、构建含有汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的重组质粒p18HURA重组质粒p18HURA的构建过程如下：
1、汉逊酵母菌的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因(HURA3)的获得
根据已报道的汉逊酵母菌的HURA3的核苷酸序列设计的引物序列如下：
引物1：5′-CCAGGATCCTCAACATTTCCCTGAATAAT-3′(序列表中的序列1)(划线部分碱基为BamH I识别位点)
引物2：5′-CGAGAATTCTCACTAGTATTC CCGCGACT-3′(序列表中的序列2)(划线部分碱基为EcoR I识别位点)
以汉逊酵母菌(Hansenula)JCM3621(ATCC34438)的总DNA为模板，在引物1和引物2的引导下进行PCR反应扩增HURA3，PCR反应体系为：模板DNA 0.6μg，引物10.5μmol/L，引物20.5μmol/L，dNTP 200μmol/L，10×PCR缓冲液5μL，pfu DNA聚合酶(Promega公司)1单位，用去离子水补至50μL，混匀后加入20μl石蜡油；用国产PCR仪TC-96AE设置PCR反应条件为：94℃5分钟，循环1次；94℃40秒，70℃1分钟，50℃1分钟，29个循环；94℃40秒，70℃15分钟，50℃1分钟，循环1次。
将PCR产物回收并纯化后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明得到了大小约0.9kb的DNA片段，与预期的大小一致，将其命名为HURA3。
2、将步骤1的PCR产物经BamHI和EcoRI酶切后，与经同样酶酶切的质粒载体pUC18(TaKaRa公司)在T₄DNA连接酶作用下，16℃反应10-16小时进行连接，得到重组质粒，将其命名为p18HURA。将重组质粒p18HURA用BamHI和EcoRI限制性内切酶进行酶切鉴定，结果表明PCR扩增到的HURA3片段与GenBank中的HURA3片段具有相同的酶切图谱；采用双脱氧终止法测定插入重组质粒p18HURA的HURA3的核苷酸序列，结果表明HURA3与已报道的HURA3的序列同源性为100％，说明扩增得到了汉逊酵母菌乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶基因的编码序列。
二、HURA3基因被破坏的重组质粒pHURK的构建具体步骤如下：
1、含有G418抗性基因(KanMX)的载体pFA6a-KanMX(Wach A，Brachat A，PoehlmannR，Philippsen P.(1994)New heterologous modules for classical or PCR-based genedisruptions in Saccharomyces cerevisiaea.Yeast，10：1793-1808)；
2、用限制性内切酶EcoRV和SacI双酶切实施例1的重组质粒p18HURA，用限制性内切酶SmaI和SacI双酶切步骤1的质粒载体pFA6a-KanMX，将上述酶切产物分别经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收约3.6Kb的p18HURA线性片段和1.48Kb的G418抗性基因(KanMX)片段，并将回收的DNA片段分别溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)，-20℃保存备用；
3、将步骤2的p18HURA线性片段和G418抗性基因(KanMX)片段用T₄DNA连接酶连接，得到p18HURA载体中HURA3被破坏，即HURA3基因功能被阻断的重组质粒，将其命名为pHURK，连接反应体系为：3μl去离子水，1μl 10×连接缓冲液，1μl浓度为0.05pmol/μl的线性化的p18HURA，4μl浓度为0.02pmol/μl的KanMX片段和1μl T₄DNA连接酶；连接条件为：22℃，温育10-16小时。再将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性克隆，挑取白色单菌落接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，得到重组质粒pHURK。
三、汉逊酵母菌(Hansenula)的获得
转化溶液的配制：
0.1M醋酸锂溶液(LiAc-TE)：将醋酸锂溶于TE缓冲液(pH8.0)，使其终浓度为0.1M；
40％PEG-4000醋酸锂溶液：将20克PEG4000溶于0.1M LiAc-TE中，定容至50ml；
小牛胸腺DNA：4mg小牛胸腺DNA溶于1ml TE缓冲液(pH8.0)，4℃12-24小时，反复抽吸混匀，置于100℃沸水中煮沸10分钟后，迅速冰浴，冷却后进行分装，-20℃保存备用。
将步骤二的质粒pHURK用酵母菌完整细胞转化法转化野生型汉逊酵母，经筛选获得尿嘧啶营养缺陷型(因HURA3基因功能被阻断)菌株，具体步骤如下：
1、将野生型汉逊酵母接种于YEPD斜面培养基进行活化，用接种环挑取一环菌体接种于5ml YEPD液体培养基中，37℃150rpm摇床振荡培养，取1.5ml处于对数生长期的菌体细胞悬液，5000rpm离心1分钟收集菌体，用0.5ml 0.1M醋酸锂溶液将收集的菌体清洗后，再将菌体细胞重悬于100μl 0.1M醋酸锂溶液中，得到菌体细胞悬液；向菌体细胞悬液中加入5-10μg质粒pHURK和10μg小牛胸腺DNA，37℃保温10分钟，再加入700μl40％PEG-4000醋酸锂溶液，混匀，37℃保温1.5小时；转化体系中加入二甲亚砜，使其终浓度为10％(v/v)，45℃水浴热击5分钟；再加入1ml液体YEPD培养基，37℃保温30分钟，离心收集菌体细胞，将收集的菌体细胞重悬于2ml含1mg/ml G418的液体YEPD培养基中，37℃培养12小时；
2、将菌液稀释1000倍后，取200μL涂布于含0.1mg/ml G418的YEPD平板上，37℃培养3-5天，筛选转化子；
3、筛选转化子中的尿嘧啶营养缺陷型菌株，具体步骤如下：
挑取步骤2中在YEPD抗性平板上长出的单菌落于无菌水中混匀，室温静置4小时，然后分别接种于固体YNB(酵母菌生长基本培养基)培养平板、添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的固体YNB培养平板和固体YEPD平板上，37℃培养48小时，获得在添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的固体YNB培养平板和YEPD平板上能够正常生长，而在YNB培养基上不能生长的菌株，将上述菌株在YEPD平板上划线培养，每个菌株挑取50个单菌落分别置于无菌水中，室温静置4小时后，分别接种于以葡萄糖作碳源的YNB培养平板、添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培养平板以及以甲醇作碳源的YNB、添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培养平板培养平板上，37℃培养48小时，结果表明：在含尿嘧啶的YNB培养基上能够生长，而在缺乏尿嘧啶的YNB培养基上不能存活的菌株为尿嘧啶缺陷型菌株，其它表型(甲醇利用、37℃生长良好)均与野生型相同；
4、对步骤3获得的尿嘧啶营养缺陷型菌株进行鉴定：
1)用质粒YEp352(Hill JE，Meyers AM，Koerner TJ，Tzagoloff A.Yeast/E.coli shuttlevectors with multiple unique restriction sites.Yeast，1993，9：163-167.)转化上述尿嘧啶缺陷型菌株，获得能够被酿酒酵母URA3基因互补的菌株，从生物学功能上证明上述尿嘧啶营养缺陷型菌株即为HURA3基因功能缺失的汉逊酵母菌突变株；
2)提取汉逊酵母野生型菌株和步骤1)获得的尿嘧啶营养缺陷型菌株的总DNA。用限制性内切酶HindIII和PstI酶切质粒pFA6a-KanMX，回收0.7kb的G418抗性基因内部的DNA片段，以此为探针进行Southern杂交检测，结果野生型菌株和尿嘧啶营养缺陷型菌株的总DNA均未产生杂交信号，表明通过质粒pHURK引入细胞内的KanMX既没有插入到HURA3基因内部，也没有插入到染色体的其他部位；
3)以步骤2)提取的尿嘧啶营养缺陷型菌株的总DNA为模板，在步骤一的引物1和引物2的引导下，进行高保真PCR反应扩增菌株内的HURA3基因，对PCR产物用双脱氧法进行核苷酸序列测定，通过序列分析和同源性比较，表明在获得的HURA3基因功能缺失的汉逊酵母突变株的HURA3基因内部插入了5个碱基，造成第10个密码子之后发生移码突变，使得细胞不能产生有活性的乳清酸苷-5-磷酸脱羧酶，将该HURA3基因功能缺失的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母突变株(Hansenula)命名为YH-11，该菌株已保藏于天津博泰生物制品有限公司即为尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌-汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11。
实施例2
尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCCNO.2976生物量和生物活性的检测：
检测尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11的生物量
将野生型汉逊酵母(Hansenula)和尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11接种于YEPD斜面培养基进行活化，用接种环从斜面上挑取一环菌体接种于2ml YEPD液体培养基中，37℃振荡培养16小时；再按10％接种量转接于10ml YEPD液体培养基中，37℃摇床振荡培养16小时；离心收集菌体细胞，将细胞用无菌水洗两次，称重后，将细胞分成等量的四份，两份细胞为一组，将两组细胞分别接种于50ml YEPD液体培养基中和50ml以甲醇代替YEPD中的葡萄糖的液体培养基中，再将每组中的两份细胞分别于37℃摇床振荡培养24小时和48小时，离心收集细胞，用无菌水洗一次，再次离心后，将收集的细胞沉淀称重，计算其生物量。在以葡萄糖为碳源的培养基中，培养24小时，野生型菌株和尿嘧啶营养缺陷型菌株的生物量分别为27.2g/L和26.7g/L，培养48小时，生物量分别为37.8g/L和37.5g/L；以甲醇为碳源的培养基中，野生型菌株和尿嘧啶营养缺陷型菌株的生物量分别为23.4g/L(24小时)、31.7g/L(48小时)和22.9g/L(24小时)、31.5g/L(48小时)。因此汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11和野生型汉逊酵母菌在生物量上无明显差异，生长较稳定。
实施例3
尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCCNO.2976遗传稳定性分析。
尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11的遗传稳定性分析
将上述构建的HURA3基因功能被阻断的尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11接种于YEPD液体培养基中传代培养30次，取200μl经稀释后细胞涂布于YEPD平板，37℃培养48小时，随机挑取100个单菌落分别置于2ml无菌水中，在室温下饥饿4-6小时；取饥饿后的菌液分别接种于以葡萄糖为碳源的YNB平板和添加35μg/ml尿嘧啶的YNB平板上以及用甲醇作碳源的YNB平板和添加35μg/ml尿嘧啶的YNB平板上，37℃培养48小时，结果表明单菌落在添加尿嘧啶的YNB基本培养基上都生长，在没有添加尿嘧啶的YNB基本培养基上则完全不能生长，且没有出现回复突变现象，证明本发明构建的汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11是一株遗传稳定，并保持了野生型汉逊酵母菌生理生化特性的尿嘧啶营养缺陷型突变株。
实施例4
尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母基因工程宿主菌汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCCNO.2976在生产外源蛋白中应用。
淀粉酶基因在汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11中的胞内表达
1)以载体YIp5(Struhl K，Stinchcomb DT，et al.High-frequencytransformation of yeast：Autonomous replication of hybrid DNA molecules.Proc Natl Acad Sci USA，1979，76：1035-1039)为出发载体。用限制性内切酶SalI分别酶切质粒YIp5和pHARS(Roggenkamp R，Hansen H，et al.Transformation ofthe methylotrophic yeast Hansenula autonomous replication and integrationvectors.Mol Gen Genet，1986，202：302-308)，低熔点琼脂糖凝胶电泳分别回收5.6kb的线性YIp5DNA片段和0.5kb的汉逊酵母自主复制序列HARS，并将回收的DNA片段分别溶于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，进行连接反应，连接反应体系为：3μl去离子水，1μl 10×连接缓冲液，1μl浓度为0.05pmol/μl的线性化的YIp5，4μl浓度为0.06pmol/μl的HARS片段和1μl T4DNA连接酶；连接条件为：16℃，温育10-16小时。再将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过四环素抗性失活筛选阳性克隆，挑取失去四环素抗性的单菌落接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，得到重组质粒pIHARS5。用EcoRI完全酶切质粒pIHARS5后，再用SalI进行部分酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收6.1DNA片段，溶于TE缓冲液中；用SalI和MunI酶切质粒pMPT121(Godecke S，Eckart M，et al.Identification of sequences responsible for transcriptional regulation of thestrongly expressed methanol oxidase-encoding gene in hansenula，)，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收1.8kb含甲醇氧化酶基因启动子和终止子序列及多克隆位点的DNA片段(MOXp-MOXt)，将回收的DNA片段进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，将转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，得到重组质粒pHAM1。
根据报道的扣囊复膜孢酵母α-淀粉酶基因(AMY)的核苷酸序列设计引物amy1(5′-CCGAATTCAATATGCAAATTTCAAAAGC-3′，划线部分为EcoRI识别位点)和amy2(5′-CTGAATTCTCATGAACAAATGTCAGAAGC-3′，划线部分为EcoRI识别位点，以扣囊复膜孢酵母(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)染色体DNA为模板进行PCR反应扩增α-淀粉酶基因(AMY)。用EcoRI分别酶切PCR扩增的α-淀粉酶基因和质粒pHAM1，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收1.5kb的DNA片段和7.9kb的线性载体片段，上述片段在T4DNA连接酶作用下进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞，将转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，获得重组载体pMOX-Amy，该质粒的物理图谱如图3所示，该质粒带有URA3基因；
2)遗传转化：将重组质粒pMOX-Amy转化汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11，在酵母菌基本培养基上，通过营养缺陷互补筛选转化子，可在以葡萄糖为碳源的YNB平板生长的菌株为转化子；
3)验证转化子：挑取汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11和转化子单菌落置于2ml无菌水中，在室温条件下饥饿4-6小时，取饥饿后的菌液分别接种于以葡萄糖为碳源的YNB培养平板和添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培养平板以及以甲醇为碳源的YNB培养平板和添加35μg/ml尿嘧啶(Ura)的YNB培养平板上，37℃培养48小时，结果表明转化子在不含尿嘧啶(Ura)的两种不同碳源的YNB培养平板均能够正常生长，从营养需求上验证了转化子。
4)多拷贝转化子筛选：将转化子接于基本培养基YNB中，连续传代培养30次，稀释后涂YEPD平板，提取单菌落总DNA，以淀粉酶基因AMY为探针进行Southern杂交检测，结果表明获得了AMY高拷贝整合的重组菌株，将其命名为YH11-AMY，将重组YH11-AMY菌接种于YEPD斜面上，37℃培养48小时，4℃保存。
5)重组菌株培养：将汉逊酵母重组菌株YH11-AMY活化后，用接种环挑取一环细胞接种于10毫升YNB液体培养基中，37℃摇床振荡培养14-20小时获得的菌液作为液体菌种，将液体菌种按10％的接种量接入装有100毫升以总还原糖含量为2％的甘蔗糖蜜为碳源的合成培养基(5.0g磷酸二氢钾，10g磷酸一铵，4.5g七水合硫酸镁，5.0g硫酸铵，2.3g氯化钾，0.5g氯化钠，0.75g氯化钙，0.1g硫酸铁铵，8mg五水合硫酸铜，30mg七水合硫酸锌，40mg硫酸锰，0.1g硫胺素，0.3mg生物素，适量糖蜜，用水定容至1升)，37℃振荡培养48小时；
6)诱导培养：在上述培养物中添加甲醇至终浓度为1％，37℃摇床振荡培养48小时，期间每隔8小时按0.5％比例补加甲醇；
7)培养结束后，5000转/分钟离心5分钟收集细胞，按常规方法测定细胞内淀粉酶活性，表明在上述条件下，每升培养液的细胞湿重为80-85克，每克湿细胞的淀粉酶为28-32个酶活力单位。
淀粉酶基因在汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCC No.2976中的分泌表达
1)设计并合成引物amy3(5′-CCCTGCAGAATATGCAAATTTCAAAAGC-3′，划线部分为PstI识别位点)，与实施例2中的引物amy2一起，以扣囊复膜孢酵母(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)染色体DNA为模板，进行PCR反应扩增α-淀粉酶基因(AMY)。
设计并合成引物αP1(5′-TAAGAATTCAAAATGAGATTTCCTT-3′，划线部分为EcoRI识别位点)和αP2(5′-CGTCTGCAGCTCAGCTTCAGCCTCTCTT-3′，划线部分为PstI识别位点)，以质粒pMETαB(Invitrogen公司)为模板，进行PCR反应扩增约0.3kb的编码酿酒酵母α-因子信号肽的序列MFα1s。
用限制性内切酶EcoRI酶切实施例2中构建的质粒pHAM1，用限制性内切酶EcoRI和PstI酶切本实施例中PCR扩增产物AMY和MFα1s，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收7.9kb的线性pHAM1片段、1.5kb的α-淀粉酶基因AMY和0.3kb的α-因子信号肽序列MFα1s，上述三个DNA片段在T₄DNA连接酶作用下进行连接反应，转化大肠杆菌感受态细胞，将转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，获得重组载体pMOXα-Amy，该质粒的物理图谱如图4所示，该重组载体带有URA3基因，而且在外源基因编码序列上游有分泌信号序列，可以进行外源蛋白的分泌表达；
步骤2)-6)与实施例2相同；
7)培养结束后，5000转/分钟离心5分钟收集细胞和上清液，按常规方法测定细胞外淀粉酶活性，表明在上述条件下，每升培养液的细胞湿重为83-87克，每升培养液总的淀粉酶为2300-2560个活力单位，其中上清液中的酶活力为总活力的91％，细胞内的淀粉酶活力仅为总活力的9％。
实施例4、植酸酶在汉逊酵母菌(Hansenula)YH-11CGMCC No.2976中的分泌表达
1)质粒YEp352(Hill JE，Meyers AM，Koerner TJ，Tzagoloff A.Yeast/E.colishuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast，1993，9：163-167.)为出发载体，用EcoRI和SalI双酶切质粒YEp352，回收5.2kb线性DNA片段，按实施例3所述方法分别回收含甲醇氧化酶基因启动子和终止子序列及多克隆位点的DNA片段(MOXp-MOXt)和汉逊酵母自主复制序列HARS，首先将线性YEp352与HARS进行连接反应，16℃反应8小时后，反应体系中再加入MOXp-MOXt DNA片段，16℃继续反应8小时，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白菌落筛选阳性克隆，将白色转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养12-24小时后，用碱裂解法提取质粒，获得重组载体pYEAM1。
根据报道的大肠杆菌植酸酶基因appA核苷酸序列设计并合成引物AP1(5′-CAACTGCAGATGAAAGCGATCTTAATCCCAT-3′，划线部分为PstI识别位点)和AP2(5′-CCAGAATTCATTACAAACTGCACGCCGGT-3′，划线部分为EcoRI识别位点)，以大肠杆菌(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)基因组DNA为模板，进行PCR反应扩增1.3kb的植酸酶基因appA。用EcoRI酶切质粒pYEAM1，回收7.5kb线性DNA片段，用PstI和EcoRI酶切PCR产物，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收1.3kbappA基因，上述两种DNA片段与实施例3回收的0.3kb的α-因子信号肽序列MFα1s一起进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，将转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养6小时后，快速提取质粒，电泳检测，将质粒大小正确的转化子接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中37℃培养16小时后，用碱裂解法提取质粒，获得重组质粒pMOXα-appA，该质粒的物理图谱如图5所示，该质粒带有URA3基因作为转化酵母菌的筛选标记；
步骤2)-6)与实施例2相同；
7)培养结束后，5000转/分钟离心5分钟收集细胞和上清液，按常规方法测定细胞内、外植酸酶活性，表明在上述条件下，每升培养液的细胞湿重为83-87克，每升培养液中的植酸酶为1700-1800个活力单位，其中92％的植酸酶分泌到培养液中。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
序列表
<110>元昊
<120>尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母菌及其构建方法与应用
<160>2
<210>1
<211>29bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>29bp
<222>(1)..(29)
<400>1
ccaggatcct caacatttcc ctgaataat    29
<210>2
<211>29bp
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>29bp
<222>(1)..(29)
<400>2
cgagaattct cactagtatt cccgcgact    29