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1、(10)申请公布号 CN 102690831 A (43)申请公布日 2012.09.26 CN 102690831 A *CN102690831A* (21)申请号 201210162176.8 (22)申请日 2012.05.23 C12N 15/29(2006.01) C07K 14/415(2006.01) (71)申请人 中国科学院东北地理与农业生态研 究所 地址 150081 黑龙江省哈尔滨市南岗区哈平 路 138 号 (72)发明人 夏正俊 吕世翔 翟红 吴红艳 刘宝辉 邱丽娟 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 金永焕 (54) 发明名称 。
2、大豆生育期 e1-b3a 基因及其编码蛋白 (57) 摘要 大豆生育期 e1-b3a 基因及其编码蛋白， 它涉 及大豆生育期 e1-b3a 基因及其编码蛋白。本发 明提供了大豆生育期 e1-b3a 基因及其编码蛋白。 本发明的大豆生育期 e1-b3a 基因的基因序列如 序列表 Seq ID No ： 1 所示。本发明的大豆生育期 e1-b3a 基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表 Seq ID No ： 2 所示。本发明通过品种的相关的遗 传及分子功能验证， e1-b3a 基因与 E1 基因相比， 具有促进开花的功能。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 。
3、附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 大豆生育期 e1-b3a 基因， 其特征在于大豆生育期 e1-b3a 基因的基因序列如序列表 SeqID No ： 1 所示。 2. 如权利要求 1 所述的大豆生育期 e1-b3a 基因的编码蛋白， 其特征在于大豆生育期 e1-b3a 基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表 Seq ID No ： 2 所示。 权 利 要 求 书 CN 102690831 A 2 1/5 页 3 大豆生育期 e1-b3a 基因及其编码蛋白 技术领域 0001。
4、 本发明涉及大豆生育期 e1-b3a 基因及其编码蛋白。 背景技术 0002 E1 基因位于着丝点附近， 自 Bernard（1971） 年报道以来， 人们一直没有克隆出其 功能基因。 由于该基因位于近着丝点(pericentromeric region)， 遗传重组率较低， 不利于 采用图位克隆法克隆出该基因， 在发明专利名称 ： 一种大豆生育期 E1 基因及其编码蛋白， 专利申请号为 ： 201210112662.9 中， 公布出 E1 基因序列及其相应的蛋白序列后， 证明大豆 生育期 E1 基因具有强烈抑制大豆开花的生理功能。其蛋白质序列虽然并不能鉴定出 B3 结 构域， 但是与B3结构。
5、域基因具有远缘的关系。 B3结构域基因是一类较为保守的植物特有的 转录因子， 一般只有 100-120 氨基酸， 常与其他结构域共同起作用。B3 结构域中含有与 DNA 相结合的特殊位点， 一般与 DNA 分子的大沟起作用。在含有 B3 结构域的蛋白质对抗逆性反 应、 植物的生长与发育等诸多方面起重要作用。同时， E1 基因具有一个核定位信号， 其特征 为亲核蛋白一般都含有的能保证整个蛋白质能够通过核孔复合体被运到细胞核内的特殊 的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品种中， 其 E1 基因的突变如何影响着大豆生育期 （开花期 及成熟期） 是一个非常重要的科学问题， 目前还没有在分子水平上的相关研究报道。
6、。 发明内容 0003 本发明的目的是提供了大豆生育期 e1-b3a 基因及其编码蛋白。 0004 本发明的大豆生育期 e1-b3a 基因的基因序列如序列表 Seq ID No ： 1 所示。 0005 本发明的大豆生育期 e1-b3a 基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表 Seq ID No ： 2 所示。 0006 本发明的大豆生育期 e1-b3a 基因是大豆生育期 E1 基因 （发明专利申请号 ： 201210112662.9） 的突变型基因。 0007 本发明的有益效果 ： 0008 本发明是在克隆出大豆生育期 E1 基因 （发明专利申请号 ： 201210112662.9） 的基 础上。
7、， 进一步对E1基因序列进行深入系统的研究。 由于在大豆中具有典型的B3基因结构域 基因， 本基因是代表一类新型的基因家族， 我们已证实 E1 基因可以代表着 E1 位点的功能， 即具有抑制大豆开花的功能。本发明对不同品种及近等基因系中 E1 基因序列进行了研究， 并确定了 e1-b3a 基因， 其对大豆生开花具有促进作用。 0009 大豆生育期 E1 基因在氨基酸序列 55174 区域存在着一个与 B3 结构域远缘相 似的区域， 大豆生育期 e1-b3a 基因的核苷酸序列在 334336 处发生 3 个碱基突变及在 337338 处有 2 个碱基缺失， 在蛋白质的 C 未端发生移码， 在氨基。
8、酸序列中 1111 处与大豆 生育期基因 E1 相同， 112147 处为错位氨基酸序列， 因移码 （frameshift） 而形成了终止子 （见 Seq ID No ： 2） ， 而且在 148 位产生了终止密码子， 因而本发明的大豆生育期 e1-b3a 基 因在氨基酸 65 位从苏氨酸改变为异亮氨酸， 改变了大豆生育期 E1 基因 （发明专利申请号 ： 说 明 书 CN 102690831 A 3 2/5 页 4 201210112662.9） 的 B3 结构域的完整性， 从而使大豆开花提前， 说明 E1 基因中类似于 B3 的 结构域的改变， 引发了大豆 E1 基因功能的改变。具有该基因。
9、的品种烟黄 3 号表现为早花特 性。 附图说明 0010 图 1 为 e1-b3a 电泳图， 其中， 1 号为中黄 13， 2 号为合丰 55， 3 号为 Jack， 4 号为烟 黄 3 号， 5 号为垦丰 18， 6 号为合丰 50 ； 0011 图 2 具 e1-b3a 基因的大豆品种烟黄 3 号在长日照 16 小时光照 /8 小时黑暗条件 下， 出苗后 45 天照片， 其中， 箭头所指的是已开放的大豆花朵 ； 0012 图 3 具大豆生育期 E1 基因的大豆品种 Harosoy-E1 在长日照 16 小时光照 /8 小时 黑暗条件下， 出苗后 45 天的照片。 具体实施方式 0013 具。
10、体实施方式一 ： 本实施方式的大豆生育期 e1-b3a 基因的突变基因序列如序列 表 Seq IDNo ： 1 所示。 0014 本实施方式是在克隆出大豆生育期 E1 基因 （发明专利申请号 ： 201210112662.9） 的基础上， 进一步对 E1 基因序列进行深入系统的研究。由于在大豆中具有典型的 B3 基因 结构域基因， 本基因是代表一类新型的基因家族， 我们已证实E1基因可以代表着E1位点的 功能， 即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中 E1 基因序列进 行了研究， 并确定了 e1-b3a 基因， 其对大豆生开花具有促进作用。 0015 大豆生育期 E1 基。
11、因在氨基酸序列 55174 区域存在着一个与 B3 结构域远缘相 似的区域， 大豆生育期 e1-b3a 基因的核苷酸序列在 334336 处发生 3 个碱基突变及在 337338 处有 2 个碱基缺失， 在蛋白质的 C 未端发生移码， 在氨基酸序列中 1111 处与大豆 生育期基因 E1 相同， 112147 处为错位氨基酸序列， 因移码 （frameshift） 而形成了终止子 （见Seq ID No ： 2） ， 而且在148位产生了终止密码子， 因而本实施方式的大豆生育期e1-b3a 基因的氨基酸 65 位从苏氨酸改变为异亮氨酸， 改变了大豆生育期 E1 基因 （发明专利申请 号 ： 2。
12、01210112662.9） 的 B3 结构域的完整性， 从而使大豆开花提前， 说明 E1 基因中类似于 B3的结构域的改变， 引发了大豆E1基因功能的改变。 具有该基因的品种烟黄3号表现为早 花特性。 0016 具体实施方式二 ： 本实施方式的大豆生育期 e1-b3a 基因的编码蛋白的氨基酸序 列如序列表 Seq ID No ： 2 所示。 0017 本实施方式是在克隆出大豆生育期 E1 基因 （发明专利申请号 ： 201210112662.9） 的基础上， 进一步对 E1 基因序列进行深入系统的研究。由于在大豆中具有典型的 B3 基因 结构域基因， 本基因是代表一类新型的基因家族， 我们已。
13、证实E1基因可以代表着E1位点的 功能， 即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中 E1 基因序列进 行了研究， 并确定了 e1-b3a 基因， 其对大豆生开花具有促进作用。 0018 大豆生育期 E1 基因在氨基酸序列 55174 区域存在着一个与 B3 结构域远缘相 似的区域， 大豆生育期 e1-b3a 基因的核苷酸序列在 334336 处发生 3 个碱基突变及在 337338 处有 2 个碱基缺失， 在蛋白质的 C 未端发生移码， 在氨基酸序列中 1111 处与大豆 说 明 书 CN 102690831 A 4 3/5 页 5 生育期基因 E1 相同， 112147 。
14、处为错位氨基酸序列， 因移码 （frameshift） 而形成了终止子 （见Seq ID No ： 2） ， 而且在148位产生了终止密码子， 因而本实施方式的大豆生育期e1-b3a 基因的氨基酸 65 位从苏氨酸改变为异亮氨酸， 改变了大豆生育期 E1 基因 （发明专利申请 号 ： 201210112662.9） 的 B3 结构域的完整性， 从而使大豆开花提前， 说明 E1 基因中类似于 B3的结构域的改变， 引发了大豆E1基因功能的改变。 具有该基因的品种烟黄3号表现为早 花特性。 0019 通过以下试验验证本发明的效果 ： 0020 (1) 本发明的 e1-b3a 基因是通过如下方法得到。
15、的 0021 取长至三叶真叶期烟黄 3 号大豆品种的叶片， 采用 CTAB 法提取叶片基因组 DNA ； 以提取的 DNA 为模板通过 K1 与 K2 引物， 采用购买自 Takara 公司的高保真酶 primerSTAR HS 扩增 e1-b3a 基因， PCR 反应条件如下 ： 94预变性 10min， 94变性 30s， 60退火 15s， 72延伸 1min， 共 30 循环， 再 72延伸 7min， 将 PCR 产物在 ABI3130 测序仪 （ABI 公司） 上 进行测序。 0022 测序结果表明大豆生育期e1-b3a基因具有序列表中Seq ID No ： 1的核苷酸序列， 序列。
16、表中的 Seq ID No ： 1 由 522 个碱基组成， 并编码具有序列表中 Seq ID No ： 2 的氨基酸 序列的蛋白质。 0023 (2) 大豆 E1 基因中 e1-b3a 基因鉴定 ： 0024 一、 取长至三叶真叶期待测品种的叶片， 采用 CTAB 法提取叶片基因组 DNA ； 二、 以 步骤一提取的基因组 DNA 为模板， F1 和 F2 为引物， 采用购买自 Takara 公司的 rTaq 酶进行 扩增， PCR 反应条件如下 ： 95预变性 3min ； 95变性 20s， 58退火 30s， 72延伸 40s， 共 32 个循环， 再 72延伸 7min ； 三、 取。
17、经步骤二 PCR 后的 8l( 其浓度约为 300ng/l)， 稀释 1 倍后， 经 BfuI 限制性内切酶 （购买自 Takara 公司） ， 在 37 C 温度下， 消化 3h ； 四、 然后将 步骤三酶切后的产物， 采用13%非变性PAGE胶电泳进行检测 ； 其中， 步骤一所述的待测品种 中黄 13， 合丰 55， Jack， 烟黄 3 号， 垦丰 18 和合丰 50。 0025 电泳检测结果如图 1 所示， 由图 1 可知， 4 号烟黄 3 号品种出现 2 条条带 （如 BC 所 示） ， 即为e1-b3a基因型， 而1、 2、 3、 5和6号只有一条条带 （如A所示） ， 即没有并不。
18、能被BfuI 消化， 则为 E1 的其它基因型。 0026 (3)e1-b3a 基因的功能验证 0027 一、 大豆品种带有 e1-b3a 基因的表型分析 0028 为进一步验证 e1-b3a 基因型的功能， 将含有 e1-b3a 基因的烟黄 3 号与含有大 豆生育期 E1 基因 （发明专利申请号 ： 201210112662.9）的 Harosoy-E1 品种， 种植在人工 培养箱中 （人工控制日照长度 ： 长日照为 16 小时光照 /8 小时黑暗， 中等长照为 13.5 小时 /9.5 小时， 短日照条件为 12 小时光照 /12 小时黑暗） ， 光源为荧光灯与白炽灯， 其光强为 2352。
19、70mols-1m-2， 同时， 在自然光照的田间种植， 观察含有 e1-b3a 基因烟黄 3 号品种 与含有大豆生育期 E1 基因 （发明专利申请号 ： 201210112662.9） 的 Harosoy-E1 品种从出苗 到开花的天数。 0029 结果如表 1 所示， 从表 1 中可以看出， 大豆为短日照作物， 在短日照 （12 小时光照 /12 小时黑暗） 条件下， 含有大豆生育期 E1 基因的 Harosoy-E1 品种与含有 e1-b3a 基因的 烟黄 3 号种开花天数 （从播种到开花） 相当， 大约 30 天左右 ； 而在长日照条件 （16 小时光照 说 明 书 CN 102690。
20、831 A 5 4/5 页 6 /8 小时黑暗） 下， 含有大豆生育期 E1 基因的 Harosoy-E1 品种的开花天数超过 70 天， 而含 有 e1-b3a 基因的烟黄 3 号品种为 43 天左右， 在中等日照条件下， 含有 e1-b3a 基因的烟黄 3 号品种在 45 天时已经开花 （图 2） ， 而含有大豆生育期 E1 基因的 Harosoy-E1 品种则处于 营养生长状况 （图 3） 。 0030 e1-b3a基因是在我国自己培育的大豆品种烟黄3号中发现的， 说明e1-b3a基因代 表着一个极其重要的一类变异， 对于全面了解 E1 基因的机理起决定作用。 0031 表 1 品种带有。
21、 e1-b3a 基因与带有 E1 基因型的比较 0032 0033 注 ： n.d.(not done) 没有进行相应的试验 ； L=Light（光照长度） ； D=Dark（黑暗长 度） 0034 二、 E1 基因中远缘类似于 B3 结构的突变对开花期的影响 0035 在品种福丰 （Fukuyutaka） （购自日本农业生物资源研究所） 中， 经乙烷甲基磺酸 (EMS) 处理， 获得了系列突变体库， 在其突变体库中筛选与大豆生育期 E1 基因 （发明专利申 请号 ： 201210112662.9） 的相关突变体， 我们获得了在类似 B3 结构域 （氨基酸 65 位处， 从 E1 基因的苏氨酸。
22、到异亮氨酸的突变体， 定名为 e1-m3， 其有关突变体库的建立、 突变体的筛选 过程参照 McCallum 等 (2000)Targeting induced local lesions IN genomes(TILLING) for plant functional genomics.Plant Physiol 123 ： 439442 和 Yang 等 (2000) Purification,cloning,and characterization ofthe CEL I nuclease.Biochemistry 39:35333541 进行。 0036 结果如表2所示， 由表2可知，。
23、 其杂合体后代分离中， 纯合的突变型 （e1-m3/e1-m3） 其开花期为 37.33 比带纯合 E1/E1 基因型的株系开花期为 46.75 及野生型带有 E1 基因的 开花期的平均值 48.57 天提前， 达到显著水平差异。结果表明在除大豆生育期 E1 基因以外 所有基因型完全相同的情况下， E1 基因中远缘类似于 B3 基因的结构域发生突变， 引发植株 的开花提前。同样， 含有 e1-as 基因的烟黄 3 号品种中， 突变亦发生远缘类似于 B3 基因的 结构域， 造成影响至少部分影响 E1 基因的功能， 造成开花提前。 0037 表 2 大豆品种福丰 （Fukuyutaka） 中 E1。
24、 基因中 B3 结构域的突变体杂合型自交后 说 明 书 CN 102690831 A 6 5/5 页 7 代的开花期分离 0038 0039 注 ： 每一株植株的 E1 基因型是根据其 E1 基因的序列测定序列测定结果来确定 0040 显著性测定是用 SigmaPlot(V12.1) 中的 ANOVA 进行。 0041 上述试验中的 Harosoy-E1 和 Harosoy-e1 来源于美国农业部基因种质库 （the USDA-ARS National Plant Germplasm System）的统一入库编号， 分别为 PI 547707 和 PI547676 ； Harosoy-E1、 。
25、Harosoy-e1、 Williams 82、 Bay、 Enrei、 坂本早生 （Sakamotowase） 和Jack等从日本生物资源研究所基因库中购买得到。 其他品种中黄13， 合丰55， 垦丰18、 青 黄豆 （Aokimame） 、 北京小黑豆 （Peking） 和合丰 50 由吉林省农业科学院大豆研究中心是 大豆国家工程研究中心馈赠。烟黄 3 号从中国农业科学院作物研究所种质资源研究室购买 得到。 说 明 书 CN 102690831 A 7 1/3 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102690831 A 8 2/3 页 9 0003 序 列 表 CN 102690831 A 9 3/3 页 10 序 列 表 CN 102690831 A 10 1/3 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102690831 A 11 2/3 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102690831 A 12 3/3 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 102690831 A 13 。