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1、(10)授权公告号 CN 101565713 B (45)授权公告日 2011.07.06 CN 101565713 B *CN101565713B* (21)申请号 200910039860.5 (22)申请日 2009.06.01 CCTCC NO:M209081 2009.04.22 C12N 15/55(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12P 7/64(2006.01) C12P 7/62(2006.01) C12P 19/00(2006.01) C12R 1/84(2006.01。
2、) C12R 1/72(2006.01)(73)专利权人 华南理工大学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381 号 (72)发明人 林影 韩双艳 苏国栋 郑穗平 黄登峰 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 何淑珍 CN 101285078 A,2008.10.15, 全文 . CN 1681942 A,2005.10.12, 全文 . 潘志友 等.南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵 母表面展示及其催化乙酸乙酯的合成 .生物工 程学报 .2008, 第 24 卷 ( 第 4 期 ),673-678. (54) 发明名称 南极假丝酵母脂肪酶 B 基因及。
3、其在酵母展示 中的应用 (57) 摘要 本发明南极假丝酵母脂肪酶 B 基因及其 在酵母展示中的应用。改良的南极假丝酵母 B 其编码的蛋白与野生型南极假丝酵母脂肪酶 蛋白在氨基酸水平具有相同的功能， 其酶的耐 热能力为 50-80， 半衰期为 3h-24h， 核苷酸 序列在中度严谨条件下与 SEQ.ID.NO2 从核苷 酸第 1-978 位杂交。携带该质粒的大肠杆菌 DH5/pUC57-CALB(Escherichia coliDH5/ pUC57-CALB) 的保藏号为 ： CCTCC M 209081。将 其基因转入到毕赤酵母宿主菌中， 实现南极假丝 酵母脂肪酶 B 在毕赤酵母中的高效展示表。
4、达， 提 供的毕赤酵母菌能有效展示南极假丝酵母脂肪酶 B 能广泛应用于合成己酸乙酯、 糖脂， 具有不同熔 点且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些 “重构脂” 等。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙永福 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 CN 101565713 B1/1 页 2 1. 一种南极假丝酵母脂肪酶 B 基因， 其编码的酶蛋白氨基酸序列为 SEQ.ID.NO1， 该酶 蛋白与野生型南极假丝酵母脂肪酶 B 蛋白在氨基酸水平上有 7 个位点不同， 但具有相同功 能和不同催化能力 ； 该酶蛋白在 。
5、75保温 16h 时， 活力保持 50。 2. 根据权利要求 1 所述的一种南极假丝酵母脂肪酶 B 基因， 其特征在于， 按照毕赤酵 母偏好密码子设计核苷酸序列， 得到在毕赤酵母中表达量提高的南极假丝酵母脂肪酶 B 基 因， 序列为 SEQ.ID.NO2。 3. 一种含有权利要求 1 所述南极假丝酵母脂肪酶 B 基因的重组载体 pUC57-CALB， 其中 CALB 是指权利要求 1 所述的脂肪酶 B 基因序列。 4. 一 种 携 带 权 利 要 求 3 所 述 的 重 组 载 体 pUC57-CALB 的 大 肠 杆 菌 DH5/ pUC57-CALB(Escherichicoli DH5/。
6、pUC57-CALB)， 其保藏号为 ： CCTCC NO ： M 209081。 5.一种含有权利要求 1 所述基因的重组质粒 pKFS-CALB， 其中 CALB 是指权利要求 1 所 述的脂肪酶 B 基因， 以重组载体 pUC57-CALB 为模板， 设计引物， PCR 扩增 CALB 后利用分子 克隆技术构建重组质粒 pKFS-CALB。 6.一种由权利要求5所述的重组质粒pKFS-CALB所转化的毕赤酵母菌， 其特征在于， 将 表达载体 pKFS-CALB 转化入毕赤酵母菌。 7. 权利要求 6 所述的质粒 pKFS-CALB 所转化的毕赤酵母菌在短链芳香酯、 生物柴油以 及糖脂类的。
7、催化合成中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101565713 B1/7 页 3 南极假丝酵母脂肪酶 B 基因及其在酵母展示中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种能在毕赤巴斯德酵母中高效表达南极假丝酵母脂肪酶 B 的改良 基因序列和展示有高活力脂肪酶的酵母菌， 以及从该重组酵母中得到的基因工程脂肪酶。 背景技术 0002 来源于南极假丝酵母 (Candida antarctica) 的南极假丝酵母脂肪酶 B(CALB) 是 一类重要的脂肪酶， 在酯化、 水解、 转酯、 以及其它类型反应中都显示了较其它脂肪酶更为 出色的催化性能。然而， 游离脂肪酶对温度及有机溶剂的稳定性较差， 反应产物。
8、分离困难， 难以适应不同工业生产条件的需求。利用酵母表面展示技术， 外源脂肪酶可借助于锚定在 细胞壁的载体蛋白固定在酵母细胞表面， 类似酶的固定化， 保持了脂肪酶相对独立的空间 构象和原有的生物活性， 表现出耐温、 耐有机溶媒以及热稳定性好等优良特性， 如天然的米 根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase， ROL)在有机溶剂中是不能催化对映体拆分的， 而展 示的 ROL 却可以催化对映体拆分。 0003 脂肪酶蛋白酵母表面展示技术可以在标准的发酵过程中实现酶在酵母细胞表面 的固定 ( 展示 )， 不仅保留了固定化酶回收方便、 可重复使用的优点， 更省去了酶的分离纯 化以及固定。
9、化等步骤， 有望成为酶固定化的替代方法之一。 0004 基于 CALB 的优良特性， 人们对其进行了商业化的开发， 但高成本依然限制了 CALB 广泛应用于实践生产。近来， 日本的研究学者尝试将野生型 CALB 展示于酿酒细胞表面， 但 酶在酿酒酵母细胞表面展示后表现出催化效率偏低， 成为制约其发展的瓶颈。 0005 毕赤酵母具有受甲醇调控的 AOX1 基因强启动子， 能够稳定展示糖基化和二硫键 异构化等修饰的真核蛋白， 较酿酒酵母而言， 更具有表达量高， 胞外表达本底蛋白少等优 点。毕赤酵母展示与酿酒酵母展示相比， 毕赤酵母更易实现高密度培养， 因此一般可获得 高于酿酒酵母的酶产量。目前报道。
10、毕赤酵母表面展示的脂肪酶较少， 这与毕赤酵母表面 展示系统开发较晚， 载体系统不成熟， 展示能力不稳定有关。具体到 CALB 的展示， 发明人 (Shuang-yan Han， et al.Highly efficient synthesis of ethyl hexanoate catalyzed byCALB-displaying Saccharomyces cerevisiae whole-cells in non-aqueous phase， Journal ofMolecular Catalysis B ： Enzymatic， 2009， 59 ： 168-172) 已将未修饰的原。
11、始 CALB 基因在酿酒酵母表面展示， 酶水解活力为 17U/g 干细胞， 产量低， 大大限制了其作为全 细胞催化剂的应用和 CALB 脂肪酶酶制剂的开发。因而急需在增加酶的展示量、 寻找更合适 的展示宿主， 以及改良展示酶的催化特性等方面的研究完善， 为其应用奠定基础。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有脂肪酶展示催化效率低， 提供一种能在毕赤酵母表面 高效展示的南极假丝酵母脂肪酶 B(CALB) 的基因序列。 0007 本发明的第二个目的是提供上述基因序列克隆的载体。 0008 本发明的第三个目的是提供指导 CALB 展示表达在毕赤酵母细胞表面的重组质粒 说 明 书 CN 101。
12、565713 B2/7 页 4 载体。 0009 本发明的第四个目的是提供具有上述基因序列的能展示高活力 CALB 的毕赤酵母 工程菌。 0010 本发明提供的南极假丝酵母脂肪酶核苷酸序列， 利用基因工程的方法， 实现该基 因在毕赤酵母细胞表面的高效的展示， 以提高脂肪酶在细胞表面的展示量和热稳定性， 从 而提供一种高效率， 耐热脂肪酶， 降低脂肪酶生产成本。 0011 本发明的目的是通过以下技术方案实现 ： 0012 (1) 毕赤酵母中高效表达的改良 CALB 基因 ： 根据已报道的南极假丝酵母脂肪酶 B 的三维结构， 结合生物信息学计算， 设计多个氨基酸的突变和不同突变位点的组合， 建立野。
13、 生型 CALB 的突变库， 通过热稳定性、 酶活力筛选， 发现对野生型的 CALB(Genbank ： Z30645， 来源于南极假丝酵母 LF058 株 ) 的氨基酸序列设计如下突变， Pro226Asn， Leu227Lys， Phe228Thr， Val229Ser， Leu285Gly， Ala286Met， Ala288Ile， 改良后 CALB 具体的氨基酸序列 为 SEQ.ID.NO1， 突变后的 CALB 耐热性显著提高， 75保温 16h 时， 活力降低 50， 较野生型 75半衰期为8h提高1倍。 进一步利用毕赤巴斯德酵母菌的偏好密码子置换出野生型CALB 基因中稀有密码。
14、子， 序列具与SEQ.ID.NO2从核苷酸第1-978位具有85的同源性。 上述的 改良 CALB 基因可以通过化学法 (- 乙腈亚磷酸胺化学合成法 )， 使用全自动合成仪合成， 这种体外使用核酸自动合成仪合成的DNA分子， 编码与野生型CALB蛋白在氨基酸水平上有 7 个位点不同， 但具有相同功能和不同催化能力的核苷酸序列。 0013 本发明中人工合成改良脂肪酶基因工作可以通过专门的生物技术公司或机构 ( 如深圳华大基因科技有限公司、 上海生工生物工程公司， ) 采用核酸自动合成仪以及 PCR 拼接方法完成。 0014 (2) 具有上述基因序列克隆的载体的构建 0015 利用 Taq 酶能够。
15、在 PCR 产物的 3 末端加上一个非模板依赖的 A， 而 T 载体是一种 带有 3 T 突出端的载体， 将获得的改良脂肪酶基因 PCR 产物与 T 载体在连接酶作用下实 现体外连接， 转化大肠杆菌感受态， 涂平板培养过夜， 进行蓝白斑筛选， 挑选的阳性克隆提 质粒经测序验证。克隆脂肪酶基因用的 T 载体可以是市售通用的任意 T 载体， 如 pUC57、 pGEM-T、 PMD18-T、 PMD19-T 等。本发明选用了 pUC-57， 获得了携带改良 CALB 基因的质粒载 体 pUC57-CALB。 0016 本发明所述基因的重组载体 CCTCC M 209081， 其中 RML 是指脂肪。
16、酶基因序列 ； 携 带该质粒的菌株大肠杆菌DH5a/pUC57-CALB(Escherichia coli DH5a/pUC57-CALB)于2009 年4月22日在中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏号为 ： CCTCC NO ： M 209081。 保藏地址为 湖北省武汉市武汉大学 (430072)。 0017 (3) 脂肪酶展示表达到酵母细胞外的重组质粒载体的构建 0018 为 实 现 改 良 CALB 在 毕 赤 巴 斯 德 酵 母 中 的 展 示 表 达， 采 用 pKFS( 申 请 号 200810028631.9， 此展示载体在 pPIC9K(Invitrogen 公司真核表达载体。
17、 ) 的基础上利用限 制性内切酶 EcoRI 和 NotI 将原载体上的信号肽部分基因切除， 在此基础上用来源于酿酒 酵母的絮凝素基因 FS 替换。该质粒主要包含 5 AOX1、 3 AOX、 FS( 絮凝素基因 )、 HIS4， 以 及 Amp+、 Kna+等元件， 同时包含可用来克隆脂肪酶基因的多克隆位点， 包括限制性内切酶酶 切位点 MluI、 ApaI、 SacII、 EcoRI、 AvrII、 NotI) 为克隆表达载体。去除了 RML 上游编码自 说 明 书 CN 101565713 B3/7 页 5 身信号肽的 24 个氨基酸对应的序列， 以利用 pKFS 的絮凝素基因 FS 展。
18、示外源蛋白。根据 GenBank中已报道的南极假丝酵母脂肪酶B序列(GenBank ： Z30645.1)， 克隆CALB基因时去 除了 CALB 上游编码自身信号肽的 18 个氨基酸以及前导肽 7 个氨基酸对应的核苷酸序列， 以利用 pKFS 的絮凝素基因 FS 展示外源蛋白。根据上述思路设计引物 P1 为 5 TAGAATTCGC CACTCCTTTGGTGAAGCGTC(框内部分为EcoRI酶切位点)， 引物P25 TATGCGGCCGCTCAGGGGGTGA CGATG( 框内部分为 NotI 酶切位点 ) 0019 以质粒 pUC57-CALB 为模板， P1 和 P2 为引物进行 。
19、PCR 扩增。将 PCR 产物和 pKFS 质 粒都用 EcoRI 和 NotI 双酶切， 体外连接构建重组质粒 pKFS-CALB。 0020 (4) 提供具有上述基因序列的高表达南极假丝酵母脂肪酶 B 的毕赤酵母工程菌 0021 以 LiCl 法将 SalI 线性化的重组质粒 pKFS-CALB 转化毕赤巴斯德酵母宿主菌 GS115 或 KM71， 转化物涂布于 MD 平板， 培养 2-3d。将 MD 平板上的转化子分别接种于含不 同浓度的 G418 抗性 YPD 平板上， 培养 3-5d。将高浓度 G418-YPD 平板上出现的转化子挑取 其对应的单克隆， 按 Invitrogen 操作。
20、指南提取酵母基因组 DNA 作为模板， 进行酵母基因组 PCR 鉴定， 获得重组转化子。 0022 重组转化子先接种于 200mL 的 YPD 培养基中， 培养至 OD600到 8-12 作为种子液。 培养种子液 8-10 瓶， 然后以 5-10的接种量 ( 体积比 ) 转接至含 20-35LBSM 培养基的 50L 发酵罐中培养， 甘油耗完后再补加 5-8L 50 ( 体积比， 1 1) 的甘油， 至二次甘油消耗完， OD600达 280-320 左右， 饥饿 0.5-1h 后， 补料甲醇， 甲醇流加速度为 30g/Lh-60g/Lh， 溶 氧控制在 5-10， 氨水自动流加， 发酵 120。
21、-140h 后结束， 展示在毕赤酵母表面 CALB 水解对 硝基苯酚丁酸酯的高达 130U/g 酵母干细胞。 0023 含有表达载体 pKFS-CALB 转化的毕赤巴斯德酵母可用于短链芳香酯、 生物柴油以 及糖苷类的催化合成。 0024 相对于现有技术， 本发明具有如下优点和有益效果 ： 0025 本发明采用酵母表面展示系统表达酶， 在保持酶高活力、 高催化性能的同时， 相比 游离酶或固定化酶省略了纯化分离的繁琐步骤， 更具有固定化酶的优点， 可以反复使用， 操 作稳定性强。脂肪酶应用于生产实践时， 除对高酶活有要求外， 对酶的耐热性也是重点强 调的内容， 本发明利用生物信息学， 结合定向进化。
22、手段， 获得突变的 CALB 活力可耐 75高 温， 最适作用温度为 55， 较野生型的最适温度提高了 10。同时考虑到酵母表达非同种、 非同属的外源基因时， 也表现出来了产量不高， 表达能力降低的问题， 针对毕赤酵母表达系 统合成适合其表达的 RML 基因， 有效了解决了上述问题， 实现了酶的高表达， 表达活力高达 130U/g 酵母干细胞， 为现有报道的最高水平。 具体实施方式 0026 下面结合幅图与实施例对本发明做进一步的说明， 但本发明要求保护的范围并不 局限于实施例表述的范围。 0027 实施例 1 ： 改良米黑根毛霉脂肪酶基因的合成 0028 现有的南极假丝酵母脂肪酶B(Genb。
23、ank ： Z30645， 来源于南极假丝酵母LF058株)， 其基因如 SEQ.ID.NO3 所示， 而南极假丝酵母对密码子的偏好性与毕赤酵母存在一定差距。 0029 本发明首先借助生物信息学预测， 对野生型南极假丝酵母脂肪酶 B 实现不同 说 明 书 CN 101565713 B4/7 页 6 位点、 不同氨基酸的饱和突变， 之后通过定向进化和高通量筛选， 筛到 1 株酶活力和耐 热性均显著提高的菌株， 通过测序， 发现相对野生型的 CALB 的氨基酸序列有如下突变， Pro226Asn， Leu227Lys， Phe228Thr， Val229Ser， Leu285Gly， Ala286。
24、Met， Ala288Ile， 改良后 的 CAL 具体的氨基酸序列为 SEQ.ID.NO1， 在此基础上， 采用毕赤巴斯德酵母偏好的密码子 替换 CALB 在毕赤酵母中使用频率低的密码子， 设计出在毕赤巴斯德酵母中使用频率高的 基因序列， 形成以下具体的基因序列， 如 SEQ.ID.NO2， 从而提高 CALB 在毕赤酵母中的表达 量。本发明提供的基因序列可以通过专门的生物技术公司或机构使用全自动合成仪合成。 0030 实施例 2 ： pUC-CALB 质粒的构建 0031 上步获得的全合成基因可与pUC57进行TA克隆实现体外链接， 可按照说明书进行 操作。10L 体积反应体系如下 ： T。
25、 载体 1L(50ng)， 加入全合成基因产物 3L， 含 ATP 的 10Buffer 1L， T4DNA 连接酶 1L， 用 ddH2O 补足至 10L。稍加离心， 16水浴连接过 夜。 连接产物转化E.coli DH5， 然后涂布到含0.5mM IPTG， 40g/ml X-Gal指示平板上， 过夜培养， 挑选白斑提取质粒酶切鉴定后， 将重组质粒 PMD 18-T-RML 送上海生工生物工程 有限公司测序， 测序表明克隆的基因与我们所述的全合成基因一致。 0032 实施例 3 ： 重组质粒 pKFS-CALB 的构建 0033 以质粒 pUC57-CALB 为模板， P1 和 P2 为引。
26、物进行 PCR 扩增。体系为模板 1L ； 10TaqDNA 聚合酶 buffer 5L( 含 Mg2+) ； 2.5mmol/L dNTP 4L ； 20M mol/L 的引物各 1L ； Taq DNA聚合酶0.75L， 加无菌水至总体积为50L。 反应条件为 ： 94预变性5min ； 94变性 45s， 45退火 45s， 72延伸 2min， 共 30 个循环 ； 第 30 个循环 72延伸 10min， PCR 产物进行 0.8琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化。 0034 将全合成基因的 PCR 产物和 pKFS 质粒都用 EcoRI 和 NotI 双酶切， 进行体外连接。 20L。
27、 体积反应体系如下 ： pKFS 质粒 2L(50ng)， PCR 产物 15L(50ng)， 10Buffer2L， T4DNA 连接酶 1L。16水浴连接过夜后， 去连接产物 10L 用 CaCl2转化法转入 E.coli Top10F， 在 Amp+LB(50mg/mL) 平板上涂板， 提取阳性转化子质粒进行 EcoRI 和 Not I 双酶切 鉴定。鉴定正确后， 同样委托上海生工生物工程有限公司进行测序。 0035 实施例 4 ： 表达高活力脂肪酶的毕赤酵母工程菌的培养 0036 以LiCl法将SalI线性化的重组质粒pKFS-CALB转化宿主菌GS115， 转化物涂布于 MD平板， 。
28、30培养2d。 将MD平板上的转化子分别接种于含G4180.5mg/mL， 1.0mg/mL， 1.5mg/ mL， 2.0mg/mL， 3.0mg/mL 的 YPD 平板上， 30培养 3d。将高浓度 G418-YPD 平板 (3.0mg/mL) 上出现的转化子挑取单克隆。按 Invitrogen 操作指南提取酵母基因组 DNA 作为模板， 利用 目的基因序列的 PCR 引物进行酵母基因组 PCR 鉴定， 总反应体积为 20L， Taq 酶量为 2U， 取 2LPCR 产物进行 0.8琼脂糖凝胶电泳鉴定。 0037 鉴定正确的重组转化子 GS115/pKFS-CALB 先接种于 200mL 。
29、的 YPD 培养基中， 培养 至OD600到10作为种子液。 培养种子液8瓶， 然后以5的接种量(体积比)转接至含30LBSM 培养基的 50L 发酵罐中培养， 甘油耗完后再补加 6L 50 ( 质量体积比 ) 的甘油， 至二次甘 油消耗完， OD600达 300， 饥饿半小时后， 补料甲醇， 甲醇流加速度为 30g/Lh-60g/Lh， 溶氧 控制在 5-10， 氨水自动流加， 发酵 120h 后结束。 0038 发酵液在 7000rpm、 4离心 10 分钟， 弃上清， 用去离子水洗涤菌体三次， 重悬 菌体经真空冷冻干燥 24h， 得菌体冻干粉。利用对硝基苯酚丁酸酯 (PNPB) 做底物进。
30、行 说 明 书 CN 101565713 B5/7 页 7 NaOH 法滴定测定脂肪酶水解活力， 结果显示该脂肪酶活力高达 130U/g 酵母干细胞， 比现 有技术 (T.Tanino， T.Ohno， T.Aoki， H.Fukuda， A.Kondo， Development of yeast cells displayingCandida antarctica lipase B and their application to ester synthesis reaction Appl.Microbiol.Biotechol.2007， 75 ： 1319-1325) 报道的酿酒酵母展示。
31、的 CALB CBS6678 的酶活力 (20.4U/g 酵母干细胞 ) 提高近 6 倍。 0039 1 个酶活力单位定义为每分钟水解底物对硝基苯酚丁酸酯生成 1mol 对硝基苯 酚所需的酶量。 0040 实施例 5 ： 葡萄糖月桂酸酯的合成 0041 采用葡萄糖和月桂酸为原料， 使用有机溶剂叔戊醇和二甲基亚砜， 在毕赤酵母细 胞表面展示的南极假丝酵母脂肪酶作用下发生酯化反应， 得到糖酯产品。 0042 有机溶剂叔戊醇和二甲基亚砜 (4ml 的叔戊醇， 1ml 的二甲基亚砜 ) 预先用分子 筛充分除水。取底物 0.595g 葡萄糖， 1.2g 月桂酸 ( 酰基供体和酰基受体摩尔比为 2 1) 。
32、于25ml具塞三角瓶中， 在55度下预热20min， 然后加入0.3g(约39U)毕赤酵母工程菌菌体 冻干粉 ( 实施例 4 制备的 )， 反应温度 55， 然后于 200rpm 下振荡反应 72h。反应完成后离 心取上清， 然后上高效液相色谱定量分析 ( 液相色谱 ： waters2695 ； 检测器蒸发光散色检测 器 2424 ； 柱子 ： C18 柱 )， 最终葡萄糖酯的产率为 70。 0043 实施例 6 ： 果糖月桂酸酯的合成 0044 采用果糖和月桂酸为原料， 使用有机溶剂叔戊醇和二甲基亚砜， 在毕赤酵母细胞 表面展示的南极假丝酵母脂肪酶作用下发生酯化反应， 得到糖酯产品。 004。
33、5 有机溶剂叔戊醇和二甲基亚砜 (4ml 的叔戊醇， 1ml 的二甲基亚砜 ) 预先用分子 筛充分除水。取底物 ： 0.54g 果糖， 1.2g 月桂酸 ( 酰基供体和酰基受体摩尔比为 2 1) 于 25ml 具塞三角瓶中， 在 55下预热 20min， 然后加入 0.2g( 约 26U) 毕赤酵母工程菌菌体冻 干粉， 反应温度 55， 然后于 200rpm 下振荡反应 72h。反应完成后离心取上清， 然后上高 效液相色谱定量分析 ( 液相色谱 ： waters2695 ； 检测器蒸发光散色检测器 2424 ； 柱子 ： C18 柱 )， 最终果糖的产率为 80。 0046 实施例 7 ： 油。
34、酸甲酯的合成 0047 采用大豆油和甲醇为原料， 使用有机溶剂异辛烷 (2ml)， 在毕赤酵母细胞表面展示 的南极假丝酵母脂肪酶作用下发生转酯反应， 得到脂肪酸甲酯产品。 0048 异辛烷 (2ml) 预先用分子筛充分除水。向 25ml 具塞锥形瓶中加入 0.965g 大豆 油和 0.0525g 甲醇 ( 摩尔比为 1)， 放于 40的恒温空气摇床 (200rpm) 中预热 20min， 然后 加入 0.2g( 约 26U， 实施例 4 制备 ) 实施例 4 的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉开始反应。反 应温度 55， 然后于 200rpm 下振荡反应， 在反应 24h 和 48h 后分别加入 0.。
35、0525g 甲醇 ( 最 终醇油摩尔比为 3 1)， 反应 72h， 反应完成后离心取上清， 然后上气相色谱分析 ( 气相色 谱 ： 安捷伦 7890C ； 检测器 ： 氢离子检测器 ； 柱子 ： DB-FFAP 毛细管柱 )， 最终脂肪酸甲酯产率 为 65。 0049 实施例 8 ： 非水相酯化反应制备己酸乙酯 0050 试剂都预先用分子筛充分除水。在 25ml 具塞三角瓶中加入 4.604ml 的正庚烷， 375l 的正己酸 ( 终浓度 0.6M) 和实施例 4 的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉 (0.1g， 约 13U) 放于 40 度的恒温摇床中预热 10min， 然后加入 219l 无水乙。
36、醇 ( 反应体系中， 正己酸与乙 说 明 书 CN 101565713 B6/7 页 8 醇的摩尔比为 1 1.25)， 在 40 度摇床中反应， 摇床转速为 200rpm。当反应时间为 0.5h 和 5h 时， 分别加入 0.6g 和 0.3g 分子筛， 反应 6h， 己酸的转化率能达到 95。在上述条件下反 应后， 离心回收菌体， 经溶剂正庚烷洗涤， 去除产物和残余的微量底物， 再加入到含有新鲜 底物的反应体系中催化酯化反应， 经过10批次的连续使用， 毕赤酵母展示CALB仍然在每批 次中使己酸的转化率保持在 95以上。 0051 由实施例 5、 6、 7、 8 可见， 应用实施例 4 制。
37、备的毕赤酵母工程菌菌体冻干粉均能有 效催化糖脂、 油酸甲酯以及己酸乙酯的合成， 由于该菌体冻干粉作为催化剂， 与游离酶和固 定化酶相比， 省去了分离纯化的繁琐步骤， 易于制备， 生产周期短， 操作稳定性强， 有利于降 低生产成本， 并实现规模化应用。 0052 序列列表 0053 SEQ.ID.NO1 ： ( 改良后的南极假丝酵母的氨基酸序列， 划线部分标出的是与 Genank 中提供 (Z30645) 的不一致之处 ) 0054 MATPLVKRLP SGSDFAFSQP KSVLDAGLTC QGASPSSVSK PILLVPGTGT TGPQSFDSNW 0055 IPLSAQLGYT 。
38、PCWISPPPFM LNDTQVNTEY MVNAITTLYA GSGNNKLPVL TWSQGGLVAQ 0056 WGLTFFPSIR SKVDRLMAFA PDYKGTVLAG PLDALAVSAP SVWQQTTGSA LTTALRNAGG 0057 LTQIVPTTNL YSATDEIVQP QVSNSPLDSS YLFNGKNVQA QAVCGNKTSI DHAGSLTSQF 0058 SYVVGRSALR STTGQARSAD YGITDCNPLP ANDLTPEQKV AAAALGMPIA AAIVAGPKQN 0059 CEPDLMPYAR PFAVGKRTCS GIVTP。
39、* 0060 SEQ.IDNO2 ： ( 改良后的南极假丝酵母 DNA 序列， 包括了 AA 突变和密码子偏好 )AT GGCTACTCCATTGGTTAAGAGATTGCCATCTGGTTCTGATCCAGCTTTTTCTCAACCAAAGTCTGTTTTGGATGCTG GTTTGACTTGTCAAGGTGCTTCTCCATCTTCTGTTTCTAAGCCAATTTTGTTGGTTCCAGGTACTGGTACTACTGGT CCACAATCTTTTGATTCTAACTGGATTCCATTGTCTGCTCAATTGGGTTACACTCCATGTTGGATTTCTCCACCACC ATTTAT。
40、GTTGAACGATACTCAAGTTAACACTGAATACATGGTTAACGCTATACTACTTTGTACGCTGGTTCTGGTAA CAACAAGTTGCCAGTTTTGACTTGGTCTCAAGGTGGTTTGGTTGCTCAATGGGGTTTGACTTTTTTTCCATCTATTA GATCTAAGGTTGATAGATTGATGGCTTTTGCTCCAGATTACAAGGGTACTGTTTTGGCTGGTCCATTGGATGCTTTG GCTGTTTCTGCTCCATCTGTTTGGCAACAAACTACTGGTTCTGCTTTGACTACTGCTTTGAGAAACGCTGGT。
41、GGTTT GACTCAAATTGTTCCAACTACTAACTTGTACTCTGCTACTGATGAAATTGTTCAACCACAAGTTTCTAACTCTCCAT TGGATTCTTCTTACTTGTTTAACGGTAAGAACGTTCAAGCTCAAGCTGTTTGTGGTAACAAGACTAGTATTGATCAT GCTGGTTCTTTGACTTCTCAATTTTCTTACGTTGTTGGTAGATCTGCTTTGAGATCTACTACTGGTCAAGCTAGATC TGCTGATTACGGTATTACTGATTGTAACCCATTGCCAGCTAACGATTTGACTCCAGAACA。
42、AAAGGTTGCTGCTGCTG CTTTGGGTATGCCAATTGCTGCTGCTATTGTTGCTGGTCCAAAGCAAAACTGTGAACCAGATTTGATGCCATACGCT AGACCATTTGCTGTTGGTAAGAGAACTTGTTCTGGTATTGTTACTCCATAA/ 0061 SEQ.ID.NO3 ： 野生型的南极假丝酵母的 DNA 序列 ： 0062 ATGGCCACTCCTTTGGTGAAGCGTCTGCCTTCCGGTTCGGACCCTGCCTTTTCGCAGCCCAAGTCGGTG CTCGATGCGGGTCTGACCTGCCAGGGTGCTTCGCCAT。
43、CCTCGGTCTCCAAACCCATCCTTCTCGTCCCCGGAACCGG CACCACAGGTCCACAGTCGTTCGACTCGAACTGGATCCCCCTCTCTGCGCAGCTGGGTTACACACCCTGCTGGATCT CACCCCCGCCGTTCATGCTCAACGACACCCAGGTCAACACGGAGTACATGGTCAACGCCATCACCACGCTCTACGCT GGTTCGGGCAACAACAAGCTTCCCGTGCTCACCTGGTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAGTGGGGTCTGACCTTCTT CCCCAGTATCAGGTCCAAGGTCGAT。
44、CGACTTATGGCCTTTGCGCCCGACTACAAGGGCACCGTCCTCGCCGGCCCTC 说 明 书 CN 101565713 B7/7 页 9 TCGATGCACTCGCGGTTAGTGCACCCTCCGTATGGCAGCAAACCACCGGTTCGGCACTCACTACCGCACTCCGAAAC GCAGGTGGTCTGACCCAGATCGTGCCCACCACCAACCTCTACTCGGCGACCGACGAGATCGTTCAGCCTCAGGTGTC CAACTCGCCACTCGACTCATCCTACCTCTTCAACGGAAAGAACGTCCAGGCACAGGCTGTGTG。
45、TGGGCCGCTGTTCG TCATCGACCATGCAGGCTCGCTCACCTCGCAGTTCTCCTACGTCGTCGGTCGATCCGCCCTGCGCTCCACCACGGGC CAGGCTCGTAGTGCAGACTATGGCATTACGGACTGCAACCCTCTTCCCGCCAATGATCTGACTCCCGAGCAAAAGGT CGCCGCGGCTGCGCTCCTGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTGGCGGGTCCAAAGCAGAACTGCGAGCCCGACCTCA TGCCCTACGCCCGCCCCTTTGCAGTAGGCAAAAGGACCTGCTCCGGCATCGTCACCCCCTGA 说 明 书 。