血清钠离子酶法定量测定试剂盒及其制备方法和其检测方法 【技术领域】
本发明涉及一种测定血清中钠离子含量的试剂盒及其制备方法以及其检测方法。
背景技术
血液内钠离子含量对人体内电解质的调节起着重要的作用，一般钠离子的正常值在135-148mmol/L的范围内，而临床上常见的电解质紊乱是低血钠症。因此，血清中钠离子的测定已经成为医院里常规的分析项目之一。
目前应用的钠离子分析方法中常用的有火焰光度法、离子选择电极法和酶法。火焰光度法的原理是将待测钠原子通过火焰加热刺激而被激发，当回到基态时发出具有特征波长的光，火焰中由被激发的待测钠原子产生的特征波长的辐射能的强度与钠原子的数量直接成正比，而被激发的待测钠原子数量与样本中所要测定的钠原子的浓度直接成正比。但是，这种方法需要的仪器复杂，且设备昂贵，造成检测的成本高，并且需要使用可燃气体，因此，在临床分析中具有应用难度大的缺点。
离子选择电极法(Ion-Selective Electrodes、ISE)的原理是：电极溶液中被测离子接触电极时，在离子选择电极膜基质的含水层内发生离子迁移，而迁移离子的电荷改变存在着电势，因而使膜面间的电位发生变化，在测量电极与参比电极间产生一个电位差。理想的离子选择性电极需要溶液中所要测定的离子产生的电位差和离子的活度对数成比例，当活度对数保持恒定时，电位差与离子浓度的对数也成比例，由此可以求出溶液中离子的浓度。对于离子选择电极法，其理想的情况是所使用的电极都要具有单一离子的选择性，而使电极只对一种离子产生反应。但是，实际上所有的离子选择电极都存在干扰离子，即使经过校正也不能完全保证测定结果的准确性。并且，在使用离子选择性电极时要保证管道的畅通，如果经多次保养后的电极，经过定标后不能达到规定的标准，就不能再被使用，需要进行更换，由此可见，离子选择性电极具有一定的寿命。因此，离子选择电极法存在难于保证测定值的精度，且需要定期对电极进行检测，电极的寿命不长这样的缺点。
对于酶法的测定，其原理在于：通过钠依赖性β-半乳糖苷酶催化底物O-硝基酚-β-D-吡喃半乳糖的酶动力学反应检测钠离子，其产物O-硝基酚在405nm的吸光度变化率与钠浓度呈正比。酶法检测血清钠离子的优点在于可以使用全自动生化分析仪，不需要专门的仪器和相应的耗材，因此，大大的降低了检测的成本。
在现有技术中，对于酶法测定钠离子的方法公开有中国200410066188.6的专利申请，记载了一种酶法测定钠离子含量的方法及钠离子诊断试剂盒，使用的酶为β-半乳糖苷酶，底物为O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖。样本中的钠离子激活β-半乳糖苷酶，分解底物O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖，生成有色物质，该生成有色物质的速率与样本中的钠离子浓度成正比。为了使反应体系中的钠离子维持在一个合适地浓度范围，需要加入一定浓度的穴醚或冠醚来结合掉一部分钠离子，为了保证穴醚或冠醚与钠离子的结合效率较高，反应体系应为碱性。但是，β-半乳糖苷酶和O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖在溶液中不稳定，尤其是在碱性溶液中更不易稳定，因此，该钠离子诊断试剂盒存在血清中钠离子的检测精度差、试剂不稳定这样的缺点。虽然该专利申请提出了可以将试剂制成稳定的干粉试剂或干试剂，但是却没有具体的提供干粉试剂或干试剂的制备方法。
专利申请200610028451.1也公开了一种酶法检测血清中钠离子的试剂及方法，检测原理与专利申请号200410066188.6基本相同，但使用了成本较低的冠醚代替穴醚。虽然该申请将试剂做成稀释液和冻干品来保证试剂的稳定性，并且使用15％或18％的蔗糖作为赋形剂。但是，蔗糖的共熔点较低，10％的蔗糖共熔点为-26℃，40％的蔗糖共熔点为-33℃。一般情况下，冻干过程中为了避免试剂融化必须将主冻干的温度控制在共熔点5℃以下，因此，对同时兼顾冷阱和箱体制冷的设备提出了较高的要求。并且在-30℃下、冰面的饱和蒸汽压为0.37mbar(大气压为1000mbar)，冻干过程中的压力只有维持在0.12mbar左右，才能达到较高的升华效率，否则冻干的速度会很慢，因此，对真空泵及真空冷冻干燥机封闭性的要求也很高。再加上蔗糖在冻结时极易形成玻璃态，且在冰面形成干物质密度较大的表层，对冻干速率和冻干外形有很大的影响。因此，专利申请200610028451.1公开的血清中钠离子的检测方法，还存在一定的缺陷。
【发明内容】
因此，本发明在试剂组成成分上进行了优化，提供一种血清钠离子酶法定量测定试剂盒。本发明的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，采用不同于现有技术的赋形剂，使该冻干试剂比现有的冻干试剂更稳定，且冻干工艺对设备的要求低。
本发明还提供一种血清钠离子酶法定量测定试剂盒的制备方法。
另外，本发明提供一种血清钠离子酶法定量测定试剂盒的检测方法。
为了克服了现有技术中所存在的缺陷，本发明提供的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括R1复溶液成分、R1冻干品成分、R2复溶液成分和R2冻干品成分，其中，所述R1复溶液成分包含缓冲液，以及溶解于该缓冲液中的穴醚或冠醚和稳定剂；所述R1冻干品成分包括缓冲液，以及溶解于该缓冲液中的β-半乳糖苷酶、稳定剂和赋形剂；所述R2复溶成分包括缓冲液；所述R2冻干品成分包括缓冲液，以及溶于缓冲液中的O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和赋形剂，所述赋性剂包含选自多元醇和蛋白中的任意一种或多种，或者它们的组合，并且所述R1冻干品成分与R2冻干品成分中的赋形剂彼此相同或不同，所述各稳定剂彼此相同或不同，所述各缓冲液彼此相同或不同。
本发明的优选的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，其中，所述赋性剂进一步含有糖类或多聚糖类。
本发明的优选的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，所述赋形剂为蛋白和其它物质的混合物，其混合质量比为0.1～10∶1。
本发明的优选的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，其中，所述多元醇为选自山梨醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、异麦芽酮糖醇、赤藓糖醇和聚乙二醇中的一种或多种，优选为选自甘露醇、木糖醇和聚乙二醇中的一种或多种。
另外，本发明的优选的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，其中，所述蛋白为选自脱脂牛奶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、马血清白蛋白、牛γ球蛋白、鱼精蛋白和大豆白蛋白中的一种或多种，优选为选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和鱼精蛋白中的一种或多种。
本发明的优选的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，其中，所述赋性剂进一步含有选自葡聚糖、可溶性淀粉、环糊精、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、阿拉伯胶和果胶中的一种或多种，优选进一步含有选自葡聚糖和羟乙基纤维素中的一种或多种。
本发明的优选的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，其中，所述R1复溶液成分包含浓度为20-800mmol/L的缓冲液，在该R1复溶液成分中，基于该R1复溶液成分，所述穴醚或冠醚的含量为0.5-30mmol/L，所述稳定剂的含量为0.5-100mmol/L；所述R1冻干品成分包括浓度为10-100mmol/L的缓冲液，在该R1冻干品成分中，基于该R1冻干品成分，所述β-半乳糖苷酶的含量为500-150000U/L，所述稳定剂的含量为0.5-100mmol/L，所述赋形剂的含量为0.5-30质量％；所述R2复溶液成分包含浓度为0.5-100mmol/L的缓冲液；所述R2冻干品成分包括10-100mmol/L的缓冲液，在该R2冻干品成分中，基于该R2冻干品成分，所述O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量为2.5-150mmol/L，所述赋形剂的含量为0.5-5质量％。
本发明的优选的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，其中，所述R1复溶液成分包含浓度为50-500mmol/L的缓冲液，在该R1复溶液成分中，基于该R1复溶液成分，所述穴醚或冠醚的含量为0.5-20mmol/L，所述稳定剂的含量为0.5-50mmol/L；所述R1冻干品成分包括浓度为20-50mmol/L的缓冲液，在该R1冻干品成分中，基于该R1冻干品成分，所述β-半乳糖苷酶的含量为1000-80000U/L，所述稳定剂的含量为0.5-50mmol/L，所述赋形剂的含量为2-15质量％；所述R2复溶液成分包含浓度为10-50mmol/L的缓冲液；所述R2冻干品成分包括20-50mmol/L的缓冲液，在该R2冻干品成分中，基于该R2冻干品成分，所述O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量为10-100mmol/L，所述赋形剂的含量为1-3质量％。
本发明的优选的血清钠离子酶法定量测定试剂盒的方法，其特征在于，分别配制R1复溶液成分、R1冻干品成分、R2复溶液成分和R2冻干品成分，其中，配制所述R1复溶液成分的步骤包括在缓冲液中溶解穴醚或冠醚和稳定剂；配制R1冻干品成分的步骤包括在缓冲液中溶解β-半乳糖苷酶、稳定剂和赋形剂，制成冻干品。配制R2冻干品成分的步骤包括将O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和赋形剂溶解于缓冲液中，制成冻干品。
本发明的使用血清钠离子酶法定量测定试剂盒的检测方法，其特征在于，将权利要求1～8中任一项所述血清钠离子酶法定量测定试剂盒冻干试剂的R1复溶液溶解R1冻干品得到RA，使RA中含有β-半乳糖苷酶的含量为100-10000U/L，R2复溶液溶解R2冻干品得到RB，使RB中含有O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量为1-20mmol/L，RA和RB的体积配比为1～10∶1。
由本发明提供的血清钠离子酶法定量测定试剂盒，提高了β-半乳糖苷酶和O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖在碱性溶液中的稳定性，并且使用醇类和蛋白中的任意一种或多种及其组合，以及它们和糖类的组合作为赋形剂，大大提高了冻干产品的稳定性，同时，有效的升高了冻干试剂的共熔点，最终获得了制备简便、稳定性良好的冻干试剂。
【具体实施方式】
以下，具体的说明本发明的血清钠离子酶法定量测定试剂盒。
本发明的血清钠离子酶法定量测定试剂盒中，其测定血清中的钠离子的原理在于，将样品加入主要由β-半乳糖苷酶、O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖组成的试剂中，使之发生如下的反应：
其产物O-硝基酚在405nm的吸光度变化率与钠离子浓度呈正比。
本发明的试剂主要包括：缓冲液、β-半乳糖苷酶、O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖、稳定剂、赋形剂。
该钠离子含量的试剂盒成分中的缓冲液主要是维持反应体系的pH值在稳定的范围内，保证穴醚或冠醚能与钠离子高效结合。其pH在6.0-11.0之间，优选在8.0-10.0之间。对于这样的缓冲液可以举出：2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、二(2-羟乙基)亚氨基(Bis-Tris)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，3-二[tris(羟甲基)甲基氨基]丙烷(Bis-Tris Propane)缓冲液、N(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二醋酸(ADA)缓冲液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸(MOPSO)缓冲液、N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)缓冲液、吗啉代丙烷磺酸(MOPS)缓冲液、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)缓冲液、三乙醇胺(TEA)缓冲液、3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸(DIPSO)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液、甘氨酸缓冲液等缓冲液中的至少一种。其中，优选为三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、1，3-二[tris(羟甲基)甲基氨基]丙烷(Bis-Tris Propane)缓冲液、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸(TAPS)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)缓冲液、3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸(CAPSO)缓冲液、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)缓冲液、咪唑-盐酸缓冲液和甘氨酸缓冲液。
对于β-半乳糖苷酶优选来自微生物的酶，这是因为微生物来源的酶有热稳定更好的优点，可以提高试剂的长期稳定性。
而O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖优选纯度在95％以上，并且加入到试剂中后在405nm下的吸光度较小。
试剂中的稳定剂是为了保证试剂的稳定，使酶不失活，酶的量决定显色反应的大小。对于稳定剂例如可以举出：硫酸镁、氯化镁、醋酸镁、d-生物素、甘氨酸、丙氨酸、牛γ球蛋白、N-乙酰半胱氨酸、甲硫氨酸、巯基乙醇、二硫苏糖醇、还原性谷胱甘肽、乙二醇(α-氨基乙基)醚四乙酸、乙二胺四乙酸、氢氧化锂、柠檬酸锂、碳酸锂、硫酸锂、硝酸锂、磷酸锂、氯化锂等。可以使用其中的一种，或几种混合后使用。其中，优选为硫酸镁、氯化镁、醋酸镁、巯基乙醇、二硫苏糖醇、还原性谷胱甘肽、乙二醇(α-氨基乙基)醚四乙酸、乙二胺四乙酸、氢氧化锂、碳酸锂、氯化锂。
本发明的血清钠离子酶法定量测定试剂盒作为一种冻干双试剂，含有如下成分：
R1复溶液成分 浓度 优选浓度 缓冲液 20-800mmol/L 50-500mmol/L 穴醚或冠醚 0.5-30mmol/L 0.5-20mmol/L 稳定剂 0.5-100mmol/L 0.5-50mmol/L
R1冻干品成分(8～15倍浓缩) 浓度 优选浓度 缓冲液 10-100mmol/L 20-50mmol/L β-半乳糖苷酶 500-150000U/L 1000-80000U/L 稳定剂 0.5-100mmol/L 0.5-50mmol/L 赋形剂 0.5-30质量％ 2-15质量％
R2复溶液成分 浓度 优选浓度 缓冲液 0.5-100mmol/L 10-50mmol/L
R2冻干品成分(4～10倍浓缩) 浓度 优选浓度 缓冲液 10-100mmol/L 20-50mmol/L O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖 2.5-150mmol/L 10-100mmol/L 赋形剂 0.5-5质量％ 1-3质量％
其中，缓冲液的浓度为其本身的浓度，其余的浓度为基于相应混合后成分的浓度，冻干品的浓缩倍数是基于β-半乳糖苷酶或O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的浓度而言的。各成分的浓度配比只是优选的范围，本领域技术人员在本发明说明书的指导下，可以适当选择不同的缓冲液、稳定剂、赋形剂等，并且调整、确定其最佳配比。
在测定时，将R1复溶液溶解R1冻干品得到RA，R2复溶液溶解R2冻干品得到RB，该RA和RB的体积配比为1～10∶1，并且各物质所在的位置可进行调整以形成多个配方。
冻干试剂中赋形剂是选自多元醇类和蛋白中的任意一种或多种，以及它们的组合，还可以进一步含有糖类或多聚糖类。本发明的多元醇类例如可以举出，山梨醇、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、异麦芽酮糖醇、赤藓糖醇、聚乙二醇等，优选为甘露醇、木糖醇、聚乙二醇，对于蛋白类，可以举出脱脂牛奶、牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、马血清白蛋白、牛γ球蛋白、鱼精蛋白、大豆白蛋白、明胶等，优选为牛血清白蛋白、卵清蛋白、鱼精蛋白。对于本发明中的糖类可以举出乳糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、海藻糖等糖类，优选乳糖、葡萄糖、海藻糖。多聚糖类可以举出葡聚糖、可溶性淀粉、环糊精、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、阿拉伯胶、果胶等，优选葡聚糖、羟乙基纤维素。在这些赋形剂中，更优选为蛋白和其它物质的混合物，例如，蛋白和多元醇的混合，蛋白和糖类的混合，以及蛋白和多聚糖类的混合，该混合物的混合比根据配比物质的性质而定，优选其他物质与蛋白的混合质量比为0.1～10∶1。
本发明中的赋形剂作用在于提高冻干产品的干物质含量，改善冻干产品的溶解性和稳定性，减少冷冻干燥过程中对有效成分的损害，提高产品的共熔点和崩解温度，使冻干产品有美观的外形。赋形剂也称保护剂、悬浮介质、填充剂、缓冲剂、基础物等。
所有试剂的组成成分中应尽量减少钠离子的含量，或者使其含量为零，否则会升高试剂空白、降低试剂的稳定性。
对于需要冻干的溶液经过过滤除菌后，分别装入西林瓶或其它冻干用瓶内，真空冷冻干燥后，真空压塞或通入氮气、氦气、氩气后压塞，密封。对于本发明中冻干试剂的冻干方法，可以采用常规的冻干方法。
检测最终反应产物是在主波长下(405nm或其他选定的波长)吸光度的变化，测定样本中钠离子含量。该测定波长优选O-硝基酚有最大吸收的波长。对于本发明的血清钠离子酶法定量测定试剂盒的制备方法，可以是分别配制R1复溶液成分、R1冻干品成分、R2复溶液成分和R2冻干品成分，R1复溶液成分，首先配制缓冲液，然后在缓冲液中溶解穴醚或冠醚和稳定剂，R1冻干品成分也是首先配制缓冲液，然后在缓冲液中溶解β-半乳糖苷酶、稳定剂和赋形剂，制成冻干品，冻干方法可以采用任何一种常规的冻干方法，然后，配制缓冲液制成R2复溶成分，而R2冻干品成分，首先配制缓冲液，然后将O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖和赋形剂溶解于缓冲液中，制成冻干品，冻干方法也是采用任何一种常规的冻干方法。按上述混合比配制成的R1复溶液成分、R1冻干品成分、R2复溶液成分和R2冻干品成分，作为一种试剂盒产品，具有很高的稳定性。
在测定时，只要将R1复溶液溶解R1冻干品得到RA，使RA中含有β-半乳糖苷酶的含量为100-10000U/L，R2复溶液溶解R2冻干品得到RB，使RB中含有O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷半乳糖的含量为1-20mmol/L，RA和RB的体积配比为1～10∶1，就可以进行本领域技术人员常规的血清中钠离子含量的测定。
实施例
以下，基于实施例，进一步具体说明有关本发明。但是，本发明不限于以下的实施例。
实施例1
(1)R1复溶液：Tris-HCl缓冲液pH 9.0(25℃)450mmol/L，1000mL，依次准确的加入以下物质：
硫酸镁 0.6g
氨基聚醚221(Kryptofix 221) 2.0g
巯基乙醇 0.78g
(2)R1冻干品(10倍浓缩液)：Tris-HCl缓冲液pH 9.0(25℃)50mmol/L，100mL，依次准确的加入以下物质：
硫酸镁 0.06g
海藻糖 1.0g
牛血清白蛋白 6.0g
β-半乳糖苷酶 5000U
(3)R2复溶液：Tris-HCl缓冲液pH 9.0(25℃)30mmol/L，400mL
(4)R2冻干品(5倍浓缩液)：Tris-HCl缓冲液pH 9.0(25℃)30mmol/L，80mL，依次准确的加入以下物质：
牛血清白蛋白 1.6g
O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷 2.0g
R1冻干品分装为4.5ml/瓶，冻干后用45ml R1复溶液溶解得到RA，R2冻干品分装为4.0ml/瓶，冻干后用20ml R2复溶液溶解得到RB，该RA和RB的体积混合比为2.5∶1。
在全自动生化分析仪(奥林巴斯AU400)设置参数如下：反应温度37℃，主波长：410nm，副波长：660nm，两点速率法(RATE1)，RA∶RB∶样本体积比为200∶80∶8(单位μl)，样本与RA在37℃保温3分钟后，加入RB，1分钟后记录吸光度A1，反应100秒后，记录吸光度A2。计算两点间的吸光度变化，对照标准反应曲线可测得样本中的钠离子含量。
实施例2
(1)R1复溶液：Tris-HCl缓冲液pH 8.5(25℃)100mmol/L，1000mL，依次准确的加入以下物质：
氯化镁 1.0g
氨基聚醚221(Kryptofix 221) 2.7g
二硫苏糖醇 0.3g
(2)R1冻干品(10倍浓缩液)：Tris-HCl缓冲液pH 8.5(25℃)20mmol/L，100mL，依次准确的加入以下物质：
氯化镁 0.1g
甘露醇 10g
牛血清白蛋白 2.0g
β-半乳糖苷酶 3000U
(3)R2复溶液：Tris-HCl缓冲液pH 8.5(25℃)10mmol/L，500mL
(4)R2冻干品(5倍浓缩液)：Tris-HCl缓冲液pH8.5(25℃)10mmol/L，100mL，依次准确的加入以下物质：
甘露醇 2.5g
牛血清白蛋白 0.5g
O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷 1.0g
R1冻干品分装为5ml/瓶，冻干后用50ml R1复溶液溶解得到RA，R2冻干品分装为5ml/瓶，冻干后用25ml R2复溶液溶解得到RB，该RA和RB的配比为2∶1。
在全自动生化分析仪(日立7060)设置参数如下：反应温度37℃，主波长：405nm，副波长：660nm，两点速率法(2 Point Rate)，RA∶RB∶样本体积比为200∶100∶8(单位μl)，样本与RA在37℃保温5分钟后，加入RB，1分钟后记录吸光度A1，反应2分钟后，记录吸光度A2。计算两点间的吸光度变化，对照标准反应曲线可测得样本中的钠离子含量。
实施例3
(1)R1复溶液：Tris-HCl缓冲液pH 7.5(25℃)200mmol/L，1000mL，依次准确的加入以下物质：
硫酸镁 0.6g
氨基聚醚221(Kryptofix 221) 2.0g
二硫苏糖醇 0.5g
(2)R1冻干品(8倍浓缩液)：Tris-HCl缓冲液pH 7.5(25℃)40mmol/L，125mL，依次准确的加入以下物质：
硫酸镁 0.075g
葡萄糖 1.25g
卵清蛋白 6.25g
β-半乳糖苷酶 125U
(3)R2复溶液：Tris-HCl缓冲液pH 7.5(25℃)60mmol/L，1000mL
(4)R2冻干品(4倍浓缩液)：Tris-HCl缓冲液pH 7.5(25℃)60mmol/L，250mL，依次准确的加入以下物质：
卵清蛋白 5.0g
O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷 0.76g
R1冻干品分装为6.25ml/瓶，冻干后用50ml R1复溶液溶解得到RA，R2冻干品分装为6.25ml/瓶，冻干后用25ml R2复溶液溶解得到RB，该RA和RB的体积混合比为1∶1。
在全自动生化分析仪(日立7060)设置参数如下：反应温度37℃，主波长：405nm，副波长：660nm，两点速率法(2 Point Rate)，RA∶RB∶样本体积比为175∶175∶10(单位μl)，样本与RA在37℃保温5分钟后，加入RB，1分钟后记录吸光度A1，反应2分钟后，记录吸光度A2。计算两点间的吸光度变化，对照标准反应曲线可测得样本中的钠离子含量。
实施例4
(1)R1复溶液：CAPSO缓冲液pH10.0(25℃)50mmol/L，1500mL，依次准确的加入以下物质：
氯化镁 1.8g
15-冠醚-5 6.0g
二硫苏糖醇 0.8g
(2)R1冻干品(15倍浓缩液)：CAPSO缓冲液pH10.0(25℃)50mmol/L，100mL，依次准确的加入以下物质：
氯化镁 0.12g
甘露醇 1.0g
卵清蛋白 5.0g
β-半乳糖苷酶 8000U
(3)R2复溶液：CAPSO缓冲液pH9.0(25℃)80mmol/L，200mL
(4)R2冻干品(5倍浓缩液)：CAPSO缓冲液pH9.0(25℃)80mmol/L，40mL，依次准确的加入以下物质：
卵清蛋白 0.4g
O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷 1.2g
R1冻干品分装为4.0ml/瓶，冻干后用60ml R1复溶液溶解得到RA，R2冻干品分装为4.0ml/瓶，冻干后用20ml R2复溶液溶解得到RB，该RA和RB的配比为7.5∶1。
在全自动生化分析仪(日立7060)设置参数如下：反应温度37℃，主波长：405nm，副波长：660nm，两点速率法(2 Point Rate)，RA∶RB∶样本体积比为225∶30∶8(单位μl)，样本与RA在37℃保温5分钟后，加入RB，1分钟后记录吸光度A1，反应3分钟后，记录吸光度A2。计算两点间的吸光度变化，对照标准反应曲线可测得样本中的钠离子含量。
比较例1
制作以下组成的试剂，但不含有赋形剂，试剂配比及检测参数同实施例2。
(1)R1：Tris-HCl缓冲液pH 8.5(25℃)102mmol/L，1000mL，依次准确的加入以下物质：
氯化镁 1.1g
氨基聚醚221(Kryptofix 221) 2.7g
二硫苏糖醇 0.3g
β-半乳糖苷酶 3000U
(2)R2：Tris-HCl缓冲液pH 8.5(25℃)12mmol/L，500mL，准确的加入以下物质：
O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷 1.0g
比较例2
制作以下组成的试剂，主要成分与复溶后的实施例2相同，但是，不经过冻干，为液体试剂，试剂配比及检测参数同实施例2。
(1)R1：Tris-HCl缓冲液pH 8.5(25℃)102mmol/L，1000mL，依次准确的加入以下物质：
氯化镁 1.1g
氨基聚醚221(Kryptofix 221) 2.7g
二硫苏糖醇 0.3g
甘露醇 10g
牛血清白蛋白 2.0g
β-半乳糖苷酶 3000U
(2)R2：Tris-HCl缓冲液pH 8.5(25℃)12mmol/L，500mL，依次准确的加入以下物质：
甘露醇 2.5g
牛血清白蛋白 0.5g
O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷 1.0g
比较例3
主要成分与实施例4相同，用蔗糖作为赋形剂。
(1)R1复溶液：CAPSO缓冲液pH10.0(25℃)50mmol/L，1500mL，依次准确的加入以下物质：
氯化镁 1.8g
15-冠醚-5 6.0g
二硫苏糖醇 0.8g
(2)R1冻干品(15倍浓缩液)：CAPSO缓冲液pH10.0(25℃)50mmol/L，100mL，依次准确的加入以下物质：
氯化镁 0.12g
蔗糖 27.0g
β-半乳糖苷酶 8000U
(3)R2复溶液：CAPSO缓冲液pH9.0(25℃)80mmol/L，200mL
(4)R2冻干品(5倍浓缩液)：CAPSO缓冲液pH9.0(25℃)80mmol/L，40mL，依次准确的加入以下物质：
蔗糖 4.8g
O-硝基酚基-β-D-吡喃糖苷 1.2g
1.有关血清钠离子酶法定量测定试剂盒冻干试剂检测准确度的效果试验
根据各实施例和比较例的要求设定检测参数，同时复溶试剂并在相应检测仪器上进行实验，使用配套标准液定标后检测多个厂家的质控品，评价与靶值的偏离程度，检测结果见表1。
表1
质控品 靶值及范围 (mmol/L) 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 比较例1 比较例2 朗道多项生化质控品 2 142(134-155) 145.2 143.4 141.8 143.8 150.5 143.7 朗道多项生化质控品 3 161(151-171) 160.4 1615 159.4 160.7 170.6 162.5 伯乐多项生化质控品 1 144(140-148) 143.7 142.1 145.9 144.5 141.7 145.4 伯乐多项生化质控品 2 126(122-130) 127.1 126.8 124.9 128.1 122.8 127.5
质控品 靶值及范围 (mmol/L) 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 比较例1 比较例2 罗氏多项生化质控品 (正常值) 122(110-134) 123.0 124.5 124.6 121.4 127.9 122.9 罗氏多项生化质控品 (异常值) 141(129-153) 145.6 142.9 143.7 140.7 150.7 143.8 利德曼多项生化质控 品(低值) 107(86-128) 105.2 106.2 104.8 106.3 106.7 105.4 利德曼多项生化质控 品(正常值) 134(105-157) 135.1 136.1 134.6 132.7 140.5 134.8 利德曼多项生化质控 品(高值) 155(124-186) 156.4 154.3 154.7 155.2 159.1 155.9
其中，质控品是临床检验实验室为了对检测系统的稳定性及检测结果的可靠性进行连续监测而使用的稳定的、有定值的样本。本实验中的质控品都是冻干品，各个质控品的生产厂家和批号，见下表。
质控名称 生产厂家 剂型 规格 批号 朗道多项生化质控品2 Randox Laboratories Ltd. 冻干 5ml/瓶 423UN/2 朗道多项生化质控品3 Randox Laboratories Ltd. 冻干 5ml/瓶 292UN/2 伯乐多项生化质控品1 Bio-rad Laboratories 冻干 5ml/瓶 14141 伯乐多项生化质控品2 Bio-rad Laboratories 冻干 5ml/瓶 14142 罗氏多项生化质控品 (正常值) Roche Diagnostics GmbH 冻干 5ml/瓶 176469
质控名称 生产厂家 剂型 规格 批号 罗氏多项生化质控品 (异常值) Roche Diagnostics GmbH 冻干 5ml/瓶 176287 利德曼多项生化质控 品(低值) 北京利德曼生化股份 有限公司 冻干 5ml/瓶 8101511 利德曼多项生化质控 品(正常值) 北京利德曼生化股份 有限公司 冻干 5ml/瓶 8F1B01 利德曼多项生化质控 品(高值) 北京利德曼生化股份 有限公司 冻干 5ml/瓶 8F1A24
从表1中我们可以看出，实施例中的测定值都比比较例的测定值更接近于靶值，说明由该试剂测定的血清中的钠离子比现有的试剂具有更好的精确度。
2.有关血清钠离子酶法定量测定试剂盒冻干试剂稳定性的效果实验
(1)定标稳定性：临床检验实验室在使用检测试剂的过程中一般将试剂开盖置于生化仪试剂仓中一直到试剂使用完，并且不一定每次检测前都定标。为了避免不必要的试剂浪费，要求试剂开盖置于试剂仓中的定标频次越低越好。对复溶后的实施例3、实施例4与比较例1的试剂，同时在日立7060全自动生化仪上定标，检测质控品(下面使用的为英国朗道多项生化质控品水平2和水平3，水平2靶值142mmol/L，为正常范围内的质控品，水平3靶值161mmol/L，为异常高值的质控品。)然后将所有试剂开盖置于试剂仓内，每天不定标检测相同的质控，用最初定标的结果进行计算，结果见表2。
表2
从表2的数据中可知：实施例3和实施例4的开盖稳定性好于比较例1，能明显降低定标频次，避免浪费试剂。
(2)加速破坏稳定性：将未复溶的实施例2试剂、比较例3试剂(包括R1复溶液、R1冻干品、包括R2复溶液、R2冻干品)和液体的比较例2试剂(包括R1和R2)同时置于37℃或41℃恒温培养箱内加速破坏，一定时间取出，复溶实施例2、比较例3的试剂，与比较例2一起定标检测质控，评价加速破坏对试剂准确度的影响，结果见表3。
表3
从表3的数据中可知：对于实施例2，在37℃、41℃分别加速12天、3天，对质控测值无影响。按照通常法则，生物试剂在37℃每稳定1天，相当于在4-10℃稳定1.5月，41℃每稳定1天，相当于在4-10℃稳定5-6个月，因此可推算实施例2的试剂盒在4-10℃可稳定18个月左右。而比较例2在37℃加速破坏3天后尚能测准，但41℃加速破坏3天后，质控测值上升。37度加速6天后试剂失效。其主要原因在于β-半乳糖苷酶失活，不能通过定标，因此，无法检测样本。并且R2颜色变深，在405nm的吸光度增大，接近仪器的检测高限，使检测反应的吸光度监测受到影响。比较例3加速破坏后虽然可以进行测定，但是其测出的值却比实施例2测出的值偏离靶值。由此可见，制成冻干试剂的实施例2稳定性远远好于液体试剂的比较例2，也好于使用蔗糖作为赋形剂的比较例3。
3.有关血清钠离子酶法定量测定试剂盒冻干条件改善的探讨
将比较例3的冻干试剂与实施例4的冻干试剂一起冻干，将两试剂降温到-40℃，并维持2小时后开始抽真空并缓慢升温，主冻干期间板层温度维持在-5℃，冷阱温度低于-40℃，真空度0.1～0.3mbar，将产品的温度维持在-20℃。主冻干结束后升高板层温度到30℃进行二次冻干，总时长35小时。实施例4冻干状态良好，呈白色匀质固体，体积与冻干前一致。比较例3冻干后脱壁萎缩，形成致密表层，中间层干物质较少，有明显的崩解现象，外观上不如实施例4。
对于比较例3，将试剂降温到-50℃，并维持2小时后开始抽真空并缓慢升温，主冻干期间板层温度维持在-25℃，冷阱温度低于-55℃，真空度0.1～0.2mbar，将产品的温度维持在-35℃。主冻干结束后升高板层温度到30℃进行二次冻干，总时长45小时，才能制成和实施例4具有同样外观的冻干试剂。
由此可见使用蔗糖作为赋形剂对冻干设备提出了很高的要求，在产品温度很低的情况下进行升华要求冷阱的温度更低，真空度更高，并且为了维持较低的温度，冻干设备的能耗也很高，冻干的速率也较慢，而本发明的冻干试剂，通过对赋性剂的选择，降低了对冻干条件的要求，也减小了冻干过程中试剂融化的风险，冻干工艺更容易控制。
由本发明提供的制备方法制备的冻干试剂使用了共熔点较低的赋形剂或赋形剂组合，提高了试剂的稳定性，降低了冻干制剂的难度，可适用于手工、半自动、自动检测系统中。由该制备方法制备的冻干试剂测定的血清中的钠离子准确度高，可在4-10℃稳定长达18个月左右。