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1、10申请公布号CN102040657A43申请公布日20110504CN102040657ACN102040657A21申请号200910070956822申请日20091026C07K14/435200601C12N15/12200601C12N15/70200601C12P21/02200601C12R1/1920060171申请人中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所地址300050天津市和平区大理道1号72发明人宁保安高志贤孙思明王红勇王彩红54发明名称胆汁三烯结合蛋白BBP的序列优化和高效表达57摘要本发明公开了一种胆汁三烯结合蛋白BBP分子。本发明根据大肠杆菌偏好密码子，。
2、以野生型胆汁三烯结合蛋白基因序列为模板，通过设计并合成优化BBP序列的引物，PCR扩增优化后的BBP序列与表达载体连接、在大肠杆菌中高效表达、纯化等步骤，获得了功能表达的BBP蛋白分子。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页附图4页CN102040660A1/1页21一种胆汁三烯结合蛋白BBP分子，其特征在于优化后的BBP序列与原序列相比，57个碱基被替换，序列中所有的大肠杆菌低频密码子均被高频密码子所替换。2根据权利要求1的胆汁三烯结合蛋白BBP分子，其特征在于具有序列表中序列1所示的碱基序列。3编码权利要求1的胆汁三烯结合蛋白BBP分子的基因。
3、，其特征在于具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。4权利要求1或2所述的胆汁三烯结合蛋白BBP分子的制备方法，其特征在于包括如下步骤1对野生型BBP序列的优化设计与引物合成；2PCR合成优化后BBP序列并与表达载体PBV220连接，构建PBV220BBP表达载体；3在大肠杆菌DH5中进行高效表达；4胆汁三烯结合蛋白BBP分子的分离纯化；5根据权利要求4的制备方法，其特征在于步骤2所述表达载体是PBV220。6根据权利要求4的制备方法，其特征在于步骤3所述大肠杆菌是ECOLIDH5。权利要求书CN102040657ACN102040660A1/5页3胆汁三烯结合蛋白BBP的序列优化和高效表达技术领。
4、域0001本发明涉及一种蛋白分子的制备方法，具体的说，本发明涉及一种具有高效表达活性的胆汁三烯结合蛋白BBP分子的制备方法。背景技术0002某些有毒有害小分子化合物如农药、兽药的残留等，是产生食品安全问题的主要因素，如何制备特异识别的小分子化合物的配体已经成为研究关注的热点问题。研究发现，胆汁三烯结合蛋白BBP分子BILINBINDINGPROTEIN，BBP对小分子具有较强的结合能力，具有重要的生物学功能，可用于运输和储藏次级代谢产物。BBP是以小分子受体蛋白脂质运载蛋白1IPOCALIN为骨架的蛋白，蛋白质折叠成桶状，提供了一个疏水的口袋结构，以便结合和运输疏水性小分子。与抗体相比，BBP。
5、结合小分子有独特的优点BBP分子骨架构象更适合与小分子物质结合，而抗体是免疫系统针对大分子物质应激产生的蛋白，其构象上更适合与大分子物质结合；BBP片段比抗体小，通过基因工程更容易对其进行操作，无需免疫动物、细胞融合等复杂制备过程；BBP口袋型识别位点具有很大的分子接触表面，结构稳定，避免了免疫球蛋白轻重链的非共价键结合。SCHLEHUBERS，SKERRAATUNINGLIGANDAFFINITY，SPECIFICITY，ANDFOLDINGSTABILITYOFANENGINEEREDLIPOCALINVARIANTASOCALLEDANTICALINUSINGAMOLECULARRAND。
6、OMAPPROACHJBIOPHYSCHEM，2002，9623213228。BESTE等以BBP为骨架基础，结合噬菌体表面展示技术，构建了随机突变肽库，筛选到3个对荧光素有特异吸附的突变体，亲和力高达352NMOL/L，且交叉反应率低。BBP最初是从大菜粉蝶PIERISBRASSICAE中得到的，其提取困难，成本高，提取效率低。因此，利用基因工程方法高效表达BBP分子，对筛选小分子模拟抗体的研究具有重要的意义。发明内容0003为克服上述野生型BBP制备的缺点，降低其制备成本并有效保持其活性，本发明提供了一种制备并纯化胆汁三烯结合蛋白BBP的方法及其多克隆抗体的制备方法。本发明的新型胆汁三烯结。
7、合蛋白BBP分子，是优化后的野生型的BBP分子，其序列与原序列相比，57个碱基被替换，序列中所有的大肠杆菌低频密码子均被高频密码子所替换。与野生型BBP相比，优化后的胆汁三烯结合蛋白BBP基因更适合在大肠杆菌中实现功能表达；本发明公开了一种具有序列表中序列1所示新型胆汁三烯结合蛋白BBP分子本发明还公开了一种编码新型胆汁三烯结合蛋白BBP分子的基因，该基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。本发明还公开了上述胆汁三烯结合蛋白BBP分子的制备方法。该方法包括如下步骤00041对野生型BBP序列的优化设计与引物合成；00052PCR合成优化后BBP序列并与表达载体连接构建PBV220BBP表达载体。
8、；00063纯化蛋白用BCA方法进行蛋白定量汪家政，范明蛋白质技术手册M北说明书CN102040657ACN102040660A2/5页4京科学出版社，2000，5154。；00074胆汁三烯结合蛋白BBP分子的分离纯化；0008制备胆汁三烯结合蛋白编码基因可以按照实验室常规方法进行，优选PCR法。优选PCR重叠引物延伸法黄培堂等译，J萨姆布鲁克，DW拉塞尔著，分子克隆实验指南第三版，P10911113。所述表达载体可以是常规的原核系统表达载体，如商业PET系列载体和国内广泛使用的PBV220载体，优选PBV220载体。大肠杆菌可以是适合原核系统表达的配套大肠杆菌，当使用PET类载体，宿主菌优。
9、选ECOLIBL21DE3系列；当使用PBV220载体时宿主菌可选择多种商业上提供的大肠杆菌，优选ECOLIDH5。本发明根据大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP序列的引物，PCR扩增优化后的BBP序列克隆至载体PEASYT3上，构建克隆载体PEASYBBP。测序后，将该序列克隆至表达载体PBV220并转化至DH5。在热激诱导下，在大肠杆菌DH5中实现了高效表达，经分离纯化，获得了电泳纯的胆汁三烯结合蛋白BBP分子。纯化蛋白用BCA方法进行蛋白定量汪家政，范明蛋白质技术手册M北京科学出版社，2000，5154。经热激诱导后，离心收集菌体，进行SDSPAGE电泳。电泳检测结果图6显示携带重组质粒P。
10、BV220BBP的表达菌株在分子量21KD的位置上产生一条特异蛋白条带，与BBP蛋白分子量相符，而对照菌株中无此相应蛋白条带。凝胶分析表明，PBV220BBP表达量约占细菌总蛋白的60以上。本研究首次成功合成了优化后的BBP的序列，且我们所构建的表达载体PBV220BBP表达量高，经纯化后纯度可达95以上。附图说明图1为BBP序列的优化前后比较图2为15凝胶电泳后回收纯化PCR产物图3为15琼脂糖凝胶电泳检测优化后BBP序列的PCR产物图4为PCR扩增后阳性克隆图5为BBP基因成功连接T载体图6为转化子菌落扩增产物图7为BAMHI与ECORI酶切表达载体PBV220BBP扩增产物图8为重组质粒。
11、PBV220BBP的表达菌株的表达产物图9为BCA蛋白定量试剂盒测定纯化后BBP蛋白浓度图10为SDSPAGE鉴定复性、纯化后的BBP蛋白具体实施方式0009实施例一胆汁三烯结合蛋白突变基因构建、表达质粒的鉴定及表达。00101材料与方法001111材料0012111质粒与菌株0013克隆载体PEASYT3购自北京全式金公司；表达载体PBV220、大肠杆菌ECOLIDH5由本实验保存。0014112酶及主要试剂0015胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、BAMHI、ECORI及T4DNALIGASE均购自PROMEGA公司；TAQDNA聚合酶、PFUDNA聚合酶、DL2000核酸分子量标准购自北京T。
12、IANGEN公司，低说明书CN102040657ACN102040660A3/5页5分子量蛋白标准物购自TAKARA公司。001612方法0017121BBP序列的优化设计与引物合成0018根据大肠杆菌偏爱密码子，利用CONDONOPT密码子优化软件优化从GENBANK中检索到的BBP基因序列，全部选用大肠杆菌偏好密码子，设计合成BBP序列的引物112表1。为了便于蛋白表达，引物FPBV和RPBV引入了ECORI和BAMHI的酶切位点，同时在3末端引入6HIS标签以利于进一步纯化。0019表1互为重叠的寡聚核苷酸引物002000210022122PCR合成优化后BBP序列说明书CN102040。
13、657ACN102040660A4/5页60023以设计的引物互为模板，分3段14，58，912合成BBP序列，回收PCR产物。再以14，58的产物为模板，1和8为引物进行PCR扩增，回收产物。最后以18和912的产物为模板，1和12为引物进行全长的扩增。反应条件如下94预变性3MIN，9430S，4530S，7230S，5个循环；9430S，57530S，7230S，25个循环，再72延伸5MIN。15凝胶电泳后回收纯化PCR产物。图20024123克隆载体PEASYBBP的构建0025将优化的BBP基因序列TA克隆至PEASYT3载体上构建克隆载体PEASYBBP，转化到ECOLIDH5中。
14、，PCR筛选阳性转化子，小量提取质粒，经酶切鉴定后送INVITROGEN公司测序。0026124表达载体PBV220BBP的构建0027以测序正确的质粒为模板，FPBV和RPBV为引物，以PFU酶进行PCR扩增引入酶切位点。反应条件如下94预变性3MIN，9430S，4530S，7245S，5个循环；9430S，5730S，7245S，25个循环，再72延伸10MIN。15凝胶电泳后回收纯化PCR产物。用BAMHI、ECORI双酶切BBP的PCR产物，所得产物与经同样酶切的PBV220质粒用T4DNA连接酶连接并转化到表达宿主ECOLIDH5中，PCR筛选阳性转化子。0028125BBP的诱导。
15、表达与鉴定0029菌株复苏后以2接种量接种于含有100MG/L氨苄青霉素的LB培养基中，以含空白PBV220质粒的菌株为对照，30摇至A6000608时调节温度为42，热激诱导4HR。离心收集菌体，SDSPAGE电泳分析表达情况，超声破碎后，分别取上清和沉淀进行SDSPAGE，鉴定表达产物的表达状态。00302结果003121优化后的BBP序列0032优化后的序列与原序列相比，57个碱基被替换，序列中所有的ECOLI低频密码子均被高频密码子所替换图1。003322合成序列的PCR结果0034优化后BBP序列大小为522BP。PCR产物经15琼脂糖凝胶电泳检测，在500750BP之间的位置出现一。
16、特异性条带，与理论值大小相符。图3003523克隆载体PEASYBBP鉴定0036直接挑取转化子菌落，1、12为引物进行PCR扩增，有约520BP片段扩增产物的为阳性克隆。如图4中1、2、4、7、8号转化子即为阳性克隆。图4PEASYT3上存在ECORI酶切位点，构建好的阳性克隆载体PEASYBBP小量提取质粒，用ECORI进行单酶切鉴定时出现约520BP大小的一条带，表明BBP基因已经成功连接T载体图5。003724BBP合成序列的测序结果0038由测序结果看出，合成的BBP序列与优化后的BBP序列一致，无点突变和移码突变等。表明成功构建了载体PEASYBBP。003925表达载体PBV22。
17、0BBP的酶切鉴定0040挑取转化子菌落，FPBV、RPBV为引物进行PCR扩增，有约520BP片段扩增产物。图6以BAMHI与ECORI酶切表达载体PBV220BBP，在约520BP大小有一条带图7，表明表达载体构建成功。说明书CN102040657ACN102040660A5/5页7004126BBP的诱导表达0042经热激诱导后，离心收集菌体，进行SDSPAGE电泳。电泳检测结果图8显示携带重组质粒PBV220BBP的表达菌株在分子量21KD的位置上产生一条特异蛋白条带，与BBP蛋白分子量相符，而对照菌株中无此相应蛋白条带。0043凝胶分析表明，PBV220BBP表达量约占细菌总蛋白的6。
18、0以上。004427BBP分子的蛋白定量0045使用BCA蛋白定量试剂盒方法所述，由直线回归方程Y10977X01489R209901，得到纯化后BBP蛋白浓度约为1MG/ML图9004628纯化结果的SDSPAGE分析0047菌体经超声破碎后显示，BBP以包涵体形式存在。利用6MOL/L盐酸胍溶解包涵体后，采用含有2MOL/L尿素的谷胱甘肽氧化还原复性缓冲液体系进行蛋白复性。将复性液透析后通过NI柱进行蛋白分离纯化。蛋白通过其带有的6HISTAG与NI2离子之间的螯合作用，特异性吸附于层析柱上，经洗脱后可见单一条带，而穿透液几乎不含该条带，可以认为得到较高纯度的蛋白图10。说明书CN102040657ACN102040660A1/4页8图1图2说明书附图CN102040657ACN102040660A2/4页9图3图4说明书附图CN102040657ACN102040660A3/4页10图5图6图7说明书附图CN102040657ACN102040660A4/4页11图8图9图10说明书附图CN102040657A。