技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及制备糖巨肽及小分子肽的制备方法。
背景技术
牦牛乳糖巨肽是一种含有唾液酸的活性糖肽，由κ-牦牛乳分子中的106-169氨基酸 残基组成，约占乳清蛋白含量的15%～25%。糖巨肽具有不同的种类，主要是由于其不同 的糖基化和磷酸化结构。糖巨肽的氨基酸组成中缺少芳香氨基酸，而支链氨基酸却很多。 糖巨肽的糖链主要有以O-糖苷型结合的2种中性糖链和3种酸性糖链，90%以上的结合 糖链都含唾液酸。
目前制备糖巨肽的方法主要是直接提取法，还有酶解法。酶解法是制备糖巨肽常用 的方法，最关键就是选择合适的酶和确定合适的水解条件。制备糖巨肽的酶要具有专一 性切断芳香族氨基形成的肽键，并且较少作用于其他氨基酸形成的肽键。
肽是经过蛋白催化降解获得的小分子片段，它具有极强的生物活性和多样性，食后 不但不会引起人们担心的“营养过剩”，相反，它还可以平衡调节营养，改善“营养过剩” 和“营养缺乏”的症状。酶法生产的小分子活性多肽可全面调节人体生理功能，增强人 体生理活性，是现代人的前沿营养。
牦牛乳是西北特有的资源，利用牦牛乳生产功能性肽，可以拓宽牦牛乳系列产品的 种类，延长乳制品资源的货架期，间接提高牦牛乳的营养价值及附加值。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种牦牛乳糖巨肽的制备方法。
本发明的又一目的提供一种牦牛乳小分子肽的制备方法。
最大限度的对牦牛乳进行开发利用，得到了牦牛乳糖巨肽及小分子肽的生产工艺， 有效的提高了牦牛乳的利用率，适合工业化推广。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种牦牛乳糖巨肽的制备方法，其主 要特点是包括以下步骤：
（1）脱脂：采用牛奶分离机，4000-8000r/min，对牦牛乳进行脱脂处理。
（2）酶解：调节脱脂牦牛乳温度在37℃～50℃，加入牦牛乳体积/凝乳酶质量V/M 为0.5%～2%的凝乳酶，酶解40～90min；
（3）灭酶：酶解结束后，升温至80～100℃，灭酶5～15min；
（4）离心：4000～10000g离心力，离心5～15min。分部收集上清液和沉淀。
（5）上清液通过截留分子量为6000Da的超滤膜超滤除盐，截留液喷雾干燥，得到 牦牛乳糖巨肽。
所述的牦牛乳糖巨肽的制备方法，所述原料为牦牛乳。用超滤膜设备进行除盐及分 离牦牛乳糖巨肽。
所述的牦牛乳糖巨肽的制备方法，步骤（2）中所述的酶为凝乳酶，其活力为 200000U/g。
一种牦牛乳小分子肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：
（1）取上述步骤（4）中离心后沉淀，配置成1～10%的溶液，调pH6.5～8.5；添加 底物量为0.5%～2%的复合蛋白酶，在45℃～65℃酶解1～4个小时；
（2）酶解结束后，80～100℃，灭酶5～10min；冷却至10～50℃左右，以无机酸调 pH为4.1，4000～10000g离心力，离心5～15min；用平均截留分子量为6000Da的超滤膜， 除高分子蛋白；150℃～180℃干燥透过液，得到所述牦牛乳酪蛋小分子肽。
所述的牦牛乳小分子肽的制备方法，所述原料为糖巨肽制备过程中的离心沉淀，配 置成1～10%的溶液。
所述的牦牛乳小分子肽的制备方法，步骤（1）中所述的酶为复合蛋白酶。
所述的牦牛乳小分子肽的制备方法，步骤（2）中所述的无机酸为盐酸，无机碱为氧 氧化钠溶液。
牦牛乳糖巨肽含量的检测：
牦牛乳糖巨肽纯度的测定
紫外吸收法测定牦牛乳糖巨肽纯度：糖巨肽的化学特征为不含芳香族氨基酸，只有 205nm～217nm处的紫外吸收，在280nm处没有紫外吸收。因此，210nm与280nm处 的紫外吸收差值可用于牦牛乳糖巨肽纯度的评价。
计算如公式：
牦牛乳糖巨肽含量的测定
采用间苯二酚-盐酸法：取20mg/mL间苯二酚溶液10mL，0.1mol/L硫酸铜溶液 0.25mL，浓盐酸80mL，加水定容至100mL，混匀，4h后储于4℃冰箱内，即制得间苯 二酚工作液，此液呈黄色。取样品糖巨肽溶液2mL于10mL试管中，加间苯二酚工作液 2mL，试管加盖，于100℃沸水浴15min，快速冷却后加入醋酸正丁醇酯-正丁醇(体积比 为85：14)4mL，振荡提取后在37℃水浴15min，4000r/min离心10min，取上层有机相， 于580nm处测定其吸光度，此为牦牛乳水解物中的唾液酸的吸光度，并以其大小表征水 解生成的牦牛乳糖巨肽的多少。
本发明的有益效果主要体现在：本发明以牦牛乳为原料在微生物凝乳酶作用下专一 性水解释放糖巨肽，结合膜设备提高糖巨肽纯度，得到了牦牛乳糖巨肽的最佳生产工艺， 利用复合蛋白酶水解糖巨肽制备后产生的沉淀，得到牦牛乳小分子肽，有效的提高了牦 牛乳产品得率，适于工业化推广生产。
1.本发明采用牦牛乳为原料，通过酶水解，制备出糖巨肽和生物小分子肽，产物溶解 性好，易吸收，不但提高了牦牛乳的营养价值，而且赋予产品多种生物学功能。
2.食源牦牛乳糖巨肽，稳定性高，安全性高，易于吸收。
3.由于有效利用糖巨肽制备过程中的沉淀，进行二次水解，制备小分子肽，易吸收， 渗透压低，可以作为现代人补充蛋白质的良好选择。
4.操作工艺简单，绿色环保，生产成本低，适合工业化生产和推广。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定 本发明的范围。
实施例1：一种牦牛乳糖巨肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）脱脂：取牦牛乳（蛋白含量3.0%）1000mL，采用牛奶分离机，4000r/min，对 牦牛乳进行脱脂处理。
（2）酶解：调节脱脂牦牛乳温度37℃，加入5g凝乳酶，酶解90min；
（3）灭酶：酶解结束后，升温至80℃，灭酶5min；
（4）离心：4000g离心力，离心15min。分部收集上清液和沉淀。
（5）上清液通过截留分子量为6000Da的超滤膜超滤除盐，截留液喷雾干燥，得到 牦牛乳糖巨肽2.76g，蛋白回收率为9.2%，牦牛乳糖巨肽纯度为95.78%，唾液酸含量为 6.125mg/g。
实施例2：一种牦牛乳小分子肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）取实施例1步骤（4）中离心后沉淀51g，配置成1%的溶液5100mL，调pH7.0； 添加0.255g复合蛋白酶，在45℃酶解4个小时；
（2）酶解结束后，80℃，灭酶5min；冷却至10℃左右，以无机酸调pH为4.1，4000g 离心力，离心15min；用平均截留分子量为6000Da的超滤膜，除高分子蛋白；150℃干 燥透过液，得到牛乳酪蛋小分子肽21.92g，蛋白回收率，73%。
实施例3：一种牦牛乳糖巨肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）脱脂：取牦牛乳（蛋白含量3.0%）1000mL，采用牛奶分离机，6000r/min，对 牦牛乳进行脱脂处理。
（2）酶解：调节脱脂牦牛乳温度45℃，加入10g凝乳酶，酶解70min；
（3）灭酶：酶解结束后，升温至90℃，灭酶8min；
（4）离心：8000g离心力，离心10min。分部收集上清液和沉淀。
（5）上清液通过截留分子量为6000Da的超滤膜超滤除盐，截留液165℃喷雾干燥， 得到牦牛乳糖巨肽2.23g，蛋白回收率为7.4%，牦牛乳糖巨肽纯度为96.78%，唾液酸含 量为6.37mg/g。
实施例4：一种牦牛乳小分子肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）取实施例3步骤（4）中离心后沉淀55g，配置成5%的溶液1100mL，调pH7.5； 添加0.55g复合蛋白酶，在55℃酶解2个小时；
（2）酶解结束后，90℃，灭酶8min；冷却至30℃左右，以无机酸调pH为4.1，8000g 离心力，离心10min；用平均截留分子量为6000Da的超滤膜，除高分子蛋白；165℃干 燥透过液，得到牛乳酪蛋小分子肽22.35g，蛋白回收率，74.5%。
实施例5：一种牦牛乳糖巨肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）脱脂：取牦牛乳（蛋白含量3.0%）1000mL，采用牛奶分离机，8000r/min， 对牦牛乳进行脱脂处理。
（2）酶解：调节脱脂牦牛乳温度50℃，加入20g凝乳酶，酶解40min；
（3）灭酶：酶解结束后，升温至100℃，灭酶5min；
（4）离心：10000g离心力，离心5min。分部收集上清液和沉淀。
（5）上清液通过截留分子量为6000Da的超滤膜超滤除盐，截留液180℃喷雾干燥， 得到牦牛乳糖巨肽2.07g，蛋白回收率为6.9%，牦牛乳糖巨肽纯度为98.32%，唾液酸含 量为6.54mg/g。
实施例6：一种牦牛乳小分子肽的制备方法，包括以下步骤：
（1）取实施例5步骤（4）中离心后沉淀57g，配置成10%的溶液570mL，调pH8.5； 添加1.14g复合蛋白酶，在65℃酶解1个小时；
（2）酶解结束后，100℃，灭酶5min；冷却至50℃左右，以无机酸调pH为4.1， 10000g离心力，离心5min；用平均截留分子量为6000Da的超滤膜，除高分子蛋白；180℃ 干燥透过液，得到牛乳酪蛋小分子肽23.12g，蛋白回收率，77%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。