牦牛乳糖巨肽及牦牛乳小分子肽的制备方法.pdf

1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310314161.3 (22)申请日 2013.07.24 C12P 21/06(2006.01) C07K 1/34(2006.01) (73)专利权人 甘肃华羚生物技术研究中心 地址 730000 甘肃省兰州市城关区定西南路 225 号 专利权人 兰州大学 甘肃华羚酪蛋白股份有限公司 (72)发明人 谢小冬 高维东 纪银莉 宋礼 文鹏程 孙文静 冯丹 刘恭 何潇 葛静微 (74)专利代理机构 兰州振华专利代理有限责任 公司 62102 代理人 张真 童伟 . 牛乳酪蛋白抗氧化乳基料的制备及其 分离纯化. 食品科学 .2013,

2、第34卷(第6期), 摘要， 1.3， 2.2. 李博智 . 酪蛋白糖巨肽分离纯化方法的研究 进展 .食品科学 .2008, 第 29 卷 ( 第 11 期 ), 全文 . 高维东 . 牦牛乳酪蛋白糖巨肽生产工艺研 究 .食品工业科技 .2013, 第 2 页 1.2.7. 高维东 . 牦牛乳酪蛋白糖巨肽生产工艺研 究 .食品工业科技 .2013, 第 2 页 1.2.7. (54) 发明名称 牦牛乳糖巨肽及牦牛乳小分子肽的制备方法 (57) 摘要 本发明提供了一种牦牛乳糖巨肽及小分子 肽的分步制备方法， 所述方法包括 ： 采用牛奶分 离机， 对牦牛乳脱脂处理 ； 调节脱脂乳温度， 加入 凝乳

3、酶进行酶解反应 ； 高温灭活凝乳酶 ； 4000 10000g 离心酶解液 ； 离心后上清液通过超滤膜超 滤除盐， 截留液喷雾干燥， 得到牦牛乳糖巨肽 ； 离 心后沉淀， 配置成 1 10% 的溶液 ； 添加复合蛋 白酶， 酶解 1 4 个小时， 高温灭复合蛋白酶 ； 冷 却至 10 40左右， 以无机酸调 pH4.1 ； 4000 1000g 离心 ； 用截留分子量为 6000Da 的超滤膜， 除高分子蛋白 ； 干燥膜透过液， 得到所述牦牛乳 小分子肽。本方法牦牛乳蛋白的综合利用率达到 80% 以上， 显著的降低了牦牛乳功能性肽的生产 成本， 适合功能性肽产品的工业化生产与推广。 (51)I

4、nt.Cl. (56)对比文件 审查员 刘婷 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 CN 103382497 B 2016.04.27 CN 103382497 B 1/1 页 2 1.一种牦牛乳小分子肽的制备方法， 有以下步骤 ： （1） 脱脂 ： 采用牛奶分离机， 4000-8000r/min， 对牦牛乳进行脱脂处理 ； （2） 酶解 ： 调节脱脂牦牛乳温度在 37 50， 加入牦牛乳体积 / 凝乳酶质量比为 0.5% 2% 的凝乳酶， 酶解 40 90min ； （3） 灭酶 ： 酶解结束后， 升温至 80 100， 灭酶 5 15min ；

5、 （4） 离心 ： 4000 10000g 离心力， 离心 5 15min ； 分部收集上清液和沉淀 ； 其特征是， 还包括以下步骤 ： （5） 取步骤 （4） 中离心后沉淀， 配置成 1 10% 的溶液， 调 pH6.5 8.5 ； 添加复合蛋白 酶， 添加量是底物量的 0.5% 2%， 在 45 65酶解 1 4 个小时 ； （6） 酶解结束后， 80 100， 灭酶 5 10min ； 冷却至 1050， 以无机酸调 pH 为 4.1， 4000 10000g 离心力， 离心 5 15min ； 用平均截留分子量为 6000Da 的超滤膜， 除高分子 蛋白 ； 150 180干燥透过液，

6、 得到所述牦牛乳小分子肽。 2.如权利要求 1 所述的牦牛乳小分子肽的制备方法， 其特征在于用超滤膜设备控制牦 牛乳小分子肽的分子量。 权 利 要 求 书 CN 103382497 B 2 1/4 页 3 牦牛乳糖巨肽及牦牛乳小分子肽的制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及制备糖巨肽及小分子肽的制备方法。 背景技术 0002 牦牛乳糖巨肽是一种含有唾液酸的活性糖肽， 由 - 牦牛乳分子中的 106-169 氨 基酸残基组成， 约占乳清蛋白含量的 15% 25%。糖巨肽具有不同的种类， 主要是由于其不 同的糖基化和磷酸化结构。 糖巨肽的氨基酸组成中缺少芳香氨基酸， 而支链氨

7、基酸却很多。 糖巨肽的糖链主要有以 O- 糖苷型结合的 2 种中性糖链和 3 种酸性糖链， 90% 以上的结合糖 链都含唾液酸。 0003 目前制备糖巨肽的方法主要是直接提取法， 还有酶解法。酶解法是制备糖巨肽常 用的方法， 最关键就是选择合适的酶和确定合适的水解条件。制备糖巨肽的酶要具有专一 性切断芳香族氨基形成的肽键， 并且较少作用于其他氨基酸形成的肽键。 0004 肽是经过蛋白催化降解获得的小分子片段， 它具有极强的生物活性和多样性， 食 后不但不会引起人们担心的 “营养过剩” ， 相反， 它还可以平衡调节营养， 改善 “营养过剩” 和 “营养缺乏” 的症状。酶法生产的小分子活性多肽可全

8、面调节人体生理功能， 增强人体生理 活性， 是现代人的前沿营养。 0005 牦牛乳是西北特有的资源， 利用牦牛乳生产功能性肽， 可以拓宽牦牛乳系列产品 的种类， 延长乳制品资源的货架期， 间接提高牦牛乳的营养价值及附加值。 发明内容 0006 本发明的目的在于避免现有技术的不足， 提供一种牦牛乳糖巨肽的制备方法。 0007 本发明的又一目的提供一种牦牛乳小分子肽的制备方法。 0008 最大限度的对牦牛乳进行开发利用， 得到了牦牛乳糖巨肽及小分子肽的生产工 艺， 有效的提高了牦牛乳的利用率， 适合工业化推广。 0009 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案为 ： 一种牦牛乳糖巨肽的制备方法，

9、其主 要特点是包括以下步骤 ： 0010 （1） 脱脂 ： 采用牛奶分离机， 4000-8000r/min， 对牦牛乳进行脱脂处理。 0011 （2） 酶解 ： 调节脱脂牦牛乳温度在 37 50， 加入牦牛乳体积 / 凝乳酶质量 V/ M 为 0.5% 2% 的凝乳酶， 酶解 40 90min ； 0012 （3） 灭酶 ： 酶解结束后， 升温至 80 100， 灭酶 5 15min ； 0013 （4） 离心 ： 4000 10000g 离心力， 离心 5 15min。分部收集上清液和沉淀。 0014 （5） 上清液通过截留分子量为 6000Da 的超滤膜超滤除盐， 截留液喷雾干燥， 得到

10、牦牛乳糖巨肽。 0015 所述的牦牛乳糖巨肽的制备方法， 所述原料为牦牛乳。用超滤膜设备进行除盐及 分离牦牛乳糖巨肽。 0016 所述的牦牛乳糖巨肽的制备方法， 步骤 （2）中所述的酶为凝乳酶， 其活力为 说 明 书 CN 103382497 B 3 2/4 页 4 200000U/g。 0017 一种牦牛乳小分子肽的制备方法， 其主要特点是包括以下步骤 ： 0018 （1） 取上述步骤 （4） 中离心后沉淀， 配置成 1 10% 的溶液， 调 pH6.5 8.5 ； 添加 底物量为 0.5% 2% 的复合蛋白酶， 在 45 65酶解 1 4 个小时 ； 0019 （2） 酶解结束后， 80

11、100， 灭酶 5 10min ； 冷却至 10 50左右， 以无机酸 调 pH 为 4.1， 4000 10000g 离心力， 离心 5 15min ； 用平均截留分子量为 6000Da 的超滤 膜， 除高分子蛋白 ； 150 180干燥透过液， 得到所述牦牛乳酪蛋小分子肽。 0020 所述的牦牛乳小分子肽的制备方法， 所述原料为糖巨肽制备过程中的离心沉淀， 配置成 1 10% 的溶液。 0021 所述的牦牛乳小分子肽的制备方法， 步骤 （1） 中所述的酶为复合蛋白酶。 0022 所述的牦牛乳小分子肽的制备方法， 步骤 （2） 中所述的无机酸为盐酸， 无机碱为氧 氧化钠溶液。 0023 牦牛

12、乳糖巨肽含量的检测 ： 0024 牦牛乳糖巨肽纯度的测定 0025 紫外吸收法测定牦牛乳糖巨肽纯度 ： 糖巨肽的化学特征为不含芳香族氨基酸， 只 有 205nm 217nm 处的紫外吸收， 在 280nm 处没有紫外吸收。因此， 210nm 与 280nm 处的紫 外吸收差值可用于牦牛乳糖巨肽纯度的评价。 0026 计算如公式 ： 0027 0028 牦牛乳糖巨肽含量的测定 0029 采用间苯二酚 - 盐酸法 ： 取 20mg/mL 间苯二酚溶液 10mL， 0.1mol/L 硫酸铜溶液 0.25mL， 浓盐酸 80mL， 加水定容至 100mL， 混匀， 4h 后储于 4冰箱内， 即制得间苯

13、二酚工作 液， 此液呈黄色。 取样品糖巨肽溶液2mL于10mL试管中， 加间苯二酚工作液2mL， 试管加盖， 于 100沸水浴 15min， 快速冷却后加入醋酸正丁醇酯 - 正丁醇 ( 体积比为 85 ： 14)4mL， 振 荡提取后在 37水浴 15min， 4000r/min 离心 10min， 取上层有机相， 于 580nm 处测定其吸光 度， 此为牦牛乳水解物中的唾液酸的吸光度， 并以其大小表征水解生成的牦牛乳糖巨肽的 多少。 0030 本发明的有益效果主要体现在 ： 本发明以牦牛乳为原料在微生物凝乳酶作用下专 一性水解释放糖巨肽， 结合膜设备提高糖巨肽纯度， 得到了牦牛乳糖巨肽的最佳

14、生产工艺， 利用复合蛋白酶水解糖巨肽制备后产生的沉淀， 得到牦牛乳小分子肽， 有效的提高了牦牛 乳产品得率， 适于工业化推广生产。 0031 1. 本发明采用牦牛乳为原料， 通过酶水解， 制备出糖巨肽和生物小分子肽， 产物溶 解性好， 易吸收， 不但提高了牦牛乳的营养价值， 而且赋予产品多种生物学功能。 0032 2. 食源牦牛乳糖巨肽， 稳定性高， 安全性高， 易于吸收。 0033 3. 由于有效利用糖巨肽制备过程中的沉淀， 进行二次水解， 制备小分子肽， 易吸 收， 渗透压低， 可以作为现代人补充蛋白质的良好选择。 0034 4. 操作工艺简单， 绿色环保， 生产成本低， 适合工业化生产和

15、推广。 说 明 书 CN 103382497 B 4 3/4 页 5 具体实施方式 0035 以下对本发明的原理和特征进行描述， 所举实例只用于解释本发明， 并非用于限 定本发明的范围。 0036 实施例 1 ： 一种牦牛乳糖巨肽的制备方法， 包括以下步骤 ： 0037 （1） 脱脂 ： 取牦牛乳 （蛋白含量 3.0%） 1000mL， 采用牛奶分离机， 4000r/min， 对牦牛 乳进行脱脂处理。 0038 （2） 酶解 ： 调节脱脂牦牛乳温度 37， 加入 5g 凝乳酶， 酶解 90min ； 0039 （3） 灭酶 ： 酶解结束后， 升温至 80， 灭酶 5min ； 0040 （4）

16、 离心 ： 4000g 离心力， 离心 15min。分部收集上清液和沉淀。 0041 （5）上清液通过截留分子量为 6000Da 的超滤膜超滤除盐， 截留液喷雾干燥， 得 到牦牛乳糖巨肽 2.76g， 蛋白回收率为 9.2%， 牦牛乳糖巨肽纯度为 95.78%， 唾液酸含量为 6.125mg/g。 0042 实施例 2 ： 一种牦牛乳小分子肽的制备方法， 包括以下步骤 ： 0043 （1） 取实施例 1 步骤 （4） 中离心后沉淀 51g， 配置成 1% 的溶液 5100mL， 调 pH7.0 ； 添加 0.255g 复合蛋白酶， 在 45酶解 4 个小时 ； 0044 （2） 酶解结束后，

17、80， 灭酶 5min ； 冷却至 10左右， 以无机酸调 pH 为 4.1， 4000g 离心力， 离心15min ； 用平均截留分子量为6000Da的超滤膜， 除高分子蛋白 ； 150干燥透过 液， 得到牛乳酪蛋小分子肽 21.92g， 蛋白回收率， 73%。 0045 实施例 3 ： 一种牦牛乳糖巨肽的制备方法， 包括以下步骤 ： 0046 （1） 脱脂 ： 取牦牛乳 （蛋白含量 3.0%） 1000mL， 采用牛奶分离机， 6000r/min， 对牦牛 乳进行脱脂处理。 0047 （2） 酶解 ： 调节脱脂牦牛乳温度 45， 加入 10g 凝乳酶， 酶解 70min ； 0048 （3

18、） 灭酶 ： 酶解结束后， 升温至 90， 灭酶 8min ； 0049 （4） 离心 ： 8000g 离心力， 离心 10min。分部收集上清液和沉淀。 0050 （5） 上清液通过截留分子量为 6000Da 的超滤膜超滤除盐， 截留液 165喷雾干燥， 得到牦牛乳糖巨肽 2.23g， 蛋白回收率为 7.4%， 牦牛乳糖巨肽纯度为 96.78%， 唾液酸含量为 6.37mg/g。 0051 实施例 4 ： 一种牦牛乳小分子肽的制备方法， 包括以下步骤 ： 0052 （1） 取实施例 3 步骤 （4） 中离心后沉淀 55g， 配置成 5% 的溶液 1100mL， 调 pH7.5 ； 添加 0.

19、55g 复合蛋白酶， 在 55酶解 2 个小时 ； 0053 （2） 酶解结束后， 90， 灭酶 8min ； 冷却至 30左右， 以无机酸调 pH 为 4.1， 8000g 离心力， 离心10min ； 用平均截留分子量为6000Da的超滤膜， 除高分子蛋白 ； 165干燥透过 液， 得到牛乳酪蛋小分子肽 22.35g， 蛋白回收率， 74.5%。 0054 实施例 5 ： 一种牦牛乳糖巨肽的制备方法， 包括以下步骤 ： 0055 （1） 脱脂 ： 取牦牛乳 （蛋白含量 3.0%） 1000mL， 采用牛奶分离机， 8000r/min， 对牦牛 乳进行脱脂处理。 0056 （2） 酶解 ：

20、调节脱脂牦牛乳温度 50， 加入 20g 凝乳酶， 酶解 40min ； 0057 （3） 灭酶 ： 酶解结束后， 升温至 100， 灭酶 5min ； 说 明 书 CN 103382497 B 5 4/4 页 6 0058 （4） 离心 ： 10000g 离心力， 离心 5min。分部收集上清液和沉淀。 0059 （5） 上清液通过截留分子量为 6000Da 的超滤膜超滤除盐， 截留液 180喷雾干燥， 得到牦牛乳糖巨肽 2.07g， 蛋白回收率为 6.9%， 牦牛乳糖巨肽纯度为 98.32%， 唾液酸含量为 6.54mg/g。 0060 实施例 6 ： 一种牦牛乳小分子肽的制备方法， 包括

21、以下步骤 ： 0061 （1） 取实施例 5 步骤 （4） 中离心后沉淀 57g， 配置成 10% 的溶液 570mL， 调 pH8.5 ； 添加 1.14g 复合蛋白酶， 在 65酶解 1 个小时 ； 0062 （2）酶解结束后， 100， 灭酶 5min ； 冷却至 50左右， 以无机酸调 pH 为 4.1， 10000g 离心力， 离心 5min ； 用平均截留分子量为 6000Da 的超滤膜， 除高分子蛋白 ； 180干 燥透过液， 得到牛乳酪蛋小分子肽 23.12g， 蛋白回收率， 77%。 0063 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103382497 B 6