一种香菇菌多糖及制备方法 【技术领域】
本发明涉及香菇菌多糖技术领域，更具体涉及一种香菇菌多糖，同时还涉及香菇真菌液体深层发酵培养基及制备方法，香菇真菌液体发酵培养，氮源对香菇菌多糖产量的影响，得到其发酵时的最隹氮源配比条件，为香菇菌多糖工业化生产提供了重要依据。香菇菌多糖作为原料药，制成注射剂、口服制剂，可供临床上广泛应用。
背景技术
目前国内从香菇中提取多糖的途径有如下二种：一种是香菇多糖，为担子菌纲伞菌科香菇子实体提取分离的多糖。一种是1982年以来，四川抗菌素研究所、河南省医药工业研究所从液体深层发酵培养的香菇菌丝和菌液中提取的多糖。名为“香菇菌多糖”，以区别于从子实体所提取的香菇多糖。
香菇菌多糖(Lentinus Edodes Mycelia Polysacharide)是由一种特殊的香菇真菌，经液体深层发酵培养及分离纯化得到的胞内、胞外多糖，重均分子量为4-9万。香菇菌多糖的主要成份是甘露聚糖肽，即a-键合的甘露糖与肽的结合体，还有葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖，肽链则由天门冬氨酸.丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸等18种L型氨基酸组成。香菇菌多糖的化学结构是：β-D[1→3]葡萄糖残基为主链，侧链为[1→6]葡萄糖残基的葡聚糖。
香菇菌多糖具有提高人体免疫力功能、抗衰老、抗炎、降血糖、抗血栓等多种功能；可以预防和治疗乙肝、肿瘤、反复感冒(上呼吸道感染)、牛皮癣，扁平疣、眼部葡萄膜炎、口腔溃疡等各种因免疫功能低下引起的疾病；可配合癌症的化疗放疗、防止癌细胞转移。
香菇真菌经深层发酵产生的香菇菌多糖具有抗肿瘤作用，全球的科学家对香菇菌多糖的研究日益广泛和深入。
【发明内容】
鉴于现有的香菇真菌深层发酵产糖能力低、生产成本高等存在的缺点和不足，本发明的目的是在于提供了一种香菇菌多糖，配方合理，在保证香菇菌多糖质量和疗效的前题下，提高了产品得率，香菇菌多糖产量比传统配方提高了50～100％。
本发明的另一个目的是在于提供了一种香菇菌多糖的制备方法，该方法具有简便、成本低廉、质量稳定等特点。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
研究香菇真菌液体发酵培养基的氮源对香菇菌多糖产量的影响，通过改进培养基的配方，香菇真菌菌丝在富营养化的条件下，可以有效地合成香菇菌多糖。
香菇粉含有蛋白质、氨基酸、脂肪、粗纤维、维生素B1、维生素B2、维生素C、烟酸、钙、磷、铁等成分。其中蛋白质含量在菌类食物中是最高的。氨基酸中有组氨酸、谷氨酸、丙氨酸、核酸等18种氨基酸。
本发明解决香菇真菌液体发酵培养技术中菌种繁殖缓慢，菌丝质量不高、生产菌球的时间长、菌球大小不一、生产成本较高的技术缺陷。提供一种解决上述问题的香菇真菌液体深层发酵培养方法，本发明涉及的培养基用于发酵罐培养基。
其设计构思包括：(1)将母种在母种培养基内进行培养；(2)将在母种培养基内培养长满试管的菌丝移种到茄子瓶培养基内进行扩大培养，培养条件为：温度24-26±1℃，培养10-20天。(3)将茄子瓶菌种充分打碎后移种到液体培养基中进行一级摇瓶的扩大培养，培养5-10天，培养温度24-26±1℃；(4)将一级摇瓶内的菌液移入二级摇瓶液体培养基中进行扩大培养5-10天，培养温度24-26±1℃；(5)将二级摇瓶出来的菌液移入一级培养基种子罐中培养5-12天，培养温度24-26±1℃；(6)将一级培养基种子罐中培养物移入二级培养基种子罐中培养4-10天，培养温度24-26±1℃；(7)将二级培养基种子罐中培养物移入发酵培养基罐中培养4-10天，培养温度24-26±1℃。
提取步骤：发酵终点放罐的料液通过板框压滤、菌丝破壁处理、滤液经浓缩、除去蛋白、加入乙醇提取，离心得沉淀，烘干，精制.即可得到符合质量要求的香菇菌多糖；香菇菌多糖产量比传统配方提高50～100％。
其技术具体措施是：
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料组成：
原料 重量份
葡萄糖 1.8-3.5
香菇粉 0.5-3
小分子甘露聚糖 0.2-0.5
酵母膏 0.1-0.2
蛋白胨 0.1-0.02
微量盐 0.1-0.15
饮用水 至2000L。
所述的香菇粉在配制前要预处理，香菇子实体粉碎后，，取60-80目香菇粉1份加815倍水，控制加热温度80～100℃，搅拌1～3小时，过滤，冷却后滤液用浓盐酸调PH1～3，加热80～95℃酸解1～3小时，冷却后用30～40％浓度的NaOH液中和至PH6.5～7.0时，过滤取滤液。
所述的微量盐为磷酸氢二钾、硫酸镁、维生素B1、氯化锰、氯化锌、硫酸铜、氯化亚铁。
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料组成：
原料 重量份
葡萄糖 2-3
香菇粉 0.9-2.5
小分子甘露聚糖 0.25-0.4
酵母膏 0.13-0.18
蛋白胨 0.18-0.01
微量盐 0.11-0.14
饮用水 至2000L。
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料组成：
原料 重量份
葡萄糖 1.8
香菇粉 0.5
小分子甘露聚糖 0.2
酵母膏 0.1
蛋白胨 0.1
微量盐 0.1
饮用水 至2000L。
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料组成：
原料 重量份
葡萄糖 2.5
香菇粉 1.0
小分子甘露聚糖 0.2
酵母膏 0.1
蛋白胨 0.1
微量盐 0.1
饮用水 至2000L。
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料组成：
原料 重量份
葡萄糖 2.5
香菇粉 2.0
小分子甘露聚糖 0.25
酵母膏 0.12
蛋白胨 0.1
微量盐 0.1
饮用水 至2000L。
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料组成：
原料 重量份
葡萄糖 3.5
香菇粉 2.5
小分子甘露聚糖 0.25
酵母膏 0.12
蛋白胨 0.12
微量盐 0.1
饮用水 至2000L。
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料组成：
原料 重量份
葡萄糖 3.5
香菇粉 3.0
小分子甘露聚糖 0.5
酵母膏 0.12
蛋白胨 0.12
微量盐 0.1
饮用水 至2000L。
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基的制备方法，其步骤是：
(1)先将蛋白胨、酵母膏准确称量后，用热水(45～60℃)溶解桶中。
(2)再称量葡萄糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、甘露聚糖(小分子)、微量盐放入桶中溶解。
(3)先将香菇粉预处理：香菇子实体粉碎后，在配制前要预处理，取60-80目香菇粉1份加8-15倍水，控制加热温度80～100℃，搅拌1～3小时，过滤，冷却后滤液用浓盐酸调PH1～3，加热80～95℃酸解1～3小时，冷却后，用30～40％浓度的NaOH液中和至PH6.5～7.0时，过滤取滤液。
(4)再取香菇水解液、饮用水配至所需体积2000L，倒入罐中灭菌；发酵、提取得到香菇菌多糖。
根据临床需要，利用常规技术可制成主要包括片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸剂、口服液、注射剂等。
本发明与原有技术相比具有以下优点和效果：
1.充分满足了真菌发酵的基本营养条件，真菌生长必须有3种氮源同时存在，即植物氮源(香菇粉)、动物氮源(蛋白胨)和微生物氮源(酵母膏)，本发明结果证明植物氮源(香菇粉)对其产糖起主导作用。
2.通过培养基的改进，香菇菌多糖产量比传统配方提高50～100％。
3.菌丝生长粗壮，菌球大小均匀，菌丝量增加40～70％。
4.香菇菌多糖作为原料药，制成片剂、颗粒剂、胶囊、滴丸剂、口服剂、注射剂等。可供临床上广泛应用。
【附图说明】
图1为一种香菇真菌深层发酵制备香菇菌多糖工艺流程图
【具体实施方式】
实施例1：
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料制成：
葡萄糖 36kg 香菇粉 10kg 蛋白胨 2kg 酵母膏 2kg
小分子甘露聚糖 4kg 微量盐 2kg 饮用水2000L PH6.0～7.5
一种香菇真菌深层发酵制备香菇菌多糖方法，其步骤是：
A.种子1：取0或1或2或3或4℃的低温下保藏香菇菌种接入灭菌后茄子瓶中培养基斜面10～30支，培养条件为：温度25或26或27℃，培养10或13或15或17或18或20天；将茄子瓶菌种充分打碎后立即移种到液体培养基中进行一级摇瓶的扩大培养，培养温度25或26或27℃，将一级摇瓶内生长5或7或9或10天的菌液移入二级摇瓶液体培养基中进行扩大培养，培养温度25或26或27℃，将二级摇瓶出来的菌液移入一级培养基种子罐中培养5或7或9或11或12天。
B.一级罐培养2：将二级摇瓶出来的菌液移入一级培养基种子罐中培养温度25或26或27℃，培养5或6或8或10或12天，通气量1∶1～1.5v/v.h，搅拌为50或60或72或79或85或92或100r/min，间歇搅拌。
C.二级罐培养3：将一级培养基种子罐中培养物移入二级培养基种子罐中培养温度25或26或27℃，培养4或5或6天，通气量1∶1～1.5v/v.h，搅拌为50或56或62或70或78或84或91或97或100r/min，间歇搅拌。
D.发酵罐培养4：将二级培养基种子罐中培养物移入发酵培养基罐中培养温度25或26或27℃培养4或5或6天或7或8或9或10天，通气量1∶1～1.5v/v.h，搅拌为50或56或61或68或74或79或85或93或100r/min，间歇搅拌。
E.板框过滤5：发酵终结放罐的料液，通过板框压滤，将发酵液和菌丝体分离。
F.菌丝提取6：用胶体磨粉碎，放入带有夹层和搅拌的搪玻璃罐中，加水至菌丝重量的5或6或7或8或9或10倍，加热保温70或73或77或79或82或85℃，搅拌4或5或6小时，用板框将上述菌丝提取液压滤。
G.浓缩7：过滤发酵过滤液和菌丝破壁处理的过滤液经薄膜真空浓缩至原体积1/3～1/10。
H.除蛋白8：加入蛋白酶，保温50或55或64或68或72或77或80℃，0.5～3小时，除去蛋白。
J.醇沉9：加入4倍或5倍于溶液体积的92％乙醇，沉淀香菇菌多糖，8～10小时。
K.离心10：抽取上清，离心得沉淀，即得香菇菌多糖粗品。
L.精制11：收香菇菌多糖糖粗品后，加入4倍或5倍重量的75、77、80、85、90、92％乙醇，沉淀香菇菌多糖，8～10小时后。
M.离心12：抽取上清，离心得沉淀。
N.干燥13：将沉淀放入烘箱中控制温度60或65或70或75或80或85℃烘干。即得香菇菌多糖。(请见原料成品检验报告书)
原料成品检验报告书
报告书编号：200811YCPP001
检品名称 香菇菌多糖 检品规格 原料 供样单位 发酵车间 检品数量 14.1kg 供货批号 20081001 有效期 2年 检验项目 全检 收检日期 2008年10月29日 检验依据 WS1-XG-026-2002 报告日期 2008年11月02日
检验项目 标准规定 检验结果
[性状] 应为灰黄色粉末，无臭， 为灰黄色粉末，无
臭，
有引湿性。 有引湿性.符合规定
[鉴别] (1)应呈正反应 呈正反应
(2)应有葡萄糖，甘露糖斑点 有葡萄糖，甘露糖斑点
符合规定
[检查]
蛋白质 应符合规定 符合规定
淀粉与糊精 应符合规定 符合规定
干燥失重 不得过10.0％ 6.1％符合规定
分子量 应为40000～90000 符合规定
重金属 应符合规定 符合规定
单糖 不得过10％(以干品计) 8.4％符合规定
微生物限度 应符合规定 符合规定
[含量测定]
总糖 不得少于40％(以干品计)46.4％符合规定
多糖 不得少于30％(以干品计)38.0％符合规定
结论：本品按照WS1-XG-026-2002标准检验，结果符合规定。
主要材料来源：
(1)香菇菌种来源：CE-09菌株或HO4-4菌株由河南省医药工业研究所购买或市售普通香菇栽培菌种；L241-4力：河南信阳农专食用菌实验室购买；L9608：河南省农科院购买；CR04：福建三明真菌研究所购买，普通香菇菌种均可：
(2)香菇粉：白花菇或普通香菇，由湖北十堰市房县购买。
实施例2
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料制成：
葡萄糖50kg 香菇粉20kg 蛋白胨2kg 酵母膏2kg小分子甘露聚糖4kg 微量盐2kg 饮用水2000L PH 6.0～7.5
其制备步骤与实施例1相同。
实施例3
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料制成：
葡萄糖50kg 香菇粉40kg 蛋白胨2kg 酵母膏2.4kg小分子甘露聚糖5kg 微量盐2kg 饮用水2000L PH 6.0～7.5
其制备步骤与实施例1相同。
实施例4
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料制成：
葡萄糖60kg 香菇粉50kg 蛋白胨2.4kg 酵母膏2.4kg小分子甘露聚糖50kg 微量盐2kg 饮用水2000L PH 6.0～7.5
其制备步骤与实施例1相同。
实施例5：
一种香菇菌多糖香菇真菌液体深层发酵培养基，它由以下重量份原料制成：
葡萄糖70kg 香菇粉60kg 蛋白胨2.4kg 酵母膏2.4kg小分子甘露聚糖10kg 微量盐2kg 饮用水2000L PH 6.0～7.5
其制备步骤与实施例1相同。
实施例6：香菇菌多糖口服液的制备
取香菇菌多糖原料10g，加纯化水10000ml溶解，除菌过滤或灭菌，分10ml或20ml灌装，即得。口服每次1-2支，每日1-2次。
或取香菇菌多糖原料10g，加纯化水100000ml溶解，除菌过滤(或灭菌)，分100ml灌装，即得。口服，每次10-20ml，每日1-2次。
口服液制备时可加入适量的助溶剂和抑菌剂。
实施例7：香菇菌多糖颗粒剂(冲剂)地制备
取香菇菌多糖原料10g，加入约10000g辅料(如淀粉，糊精，白砂糖，乳糖，硫酸钙，聚乙烯吡咯烷酮，交联羧甲基纤维素钠，微晶纤维素，羟丙纤维素，羟丙甲纤维素等)，制粒、烘干、整粒、装袋(每袋含香菇菌多糖2.5mg或5mg或10mg或15mg)，口服，每次1-2袋，每日1-2次。
实施例8：香菇菌多糖胶囊的制备
取香菇菌多糖原料10g，加入适宜辅料(如淀粉，糊精，白砂糖，乳糖，硫酸钙，聚乙烯吡咯烷酮，交联羧甲基纤维素钠，微晶纤维素，羟丙纤维素，羟丙甲纤维素等)700g或1000g或1300g，制粒，烘干，按每个胶囊含香菇菌多糖原料2.5mg或或5mg或10mg或15mg灌装胶囊，即得。口服每次1-2粒，每日1-2次。
实施例9：香菇菌多糖片剂的制备
取香菇菌多糖原料10g，加入适宜(如淀粉，糊精，白砂糖，乳糖，硫酸钙，聚乙烯吡咯烷酮，交联羧甲基纤维素钠，微晶纤维素，羟丙纤维素，羟丙甲纤维素等)混合，制粒，烘干，加入适量(0.5-1％w/w)润滑剂，崩解剂(如硬脂酸镁，滑石粉，羧甲基淀粉钠，交联羧甲基纤维素钠等)干配，按每片含香菇菌多糖原料2.5mg，5mg，10mg，15mg，压片，可进行包衣(薄膜衣或糖衣或肠溶衣)，以改善片的外观或口感，即得。每次1-2片，每日1-2次。
实施例10：香菇菌多糖滴丸或微丸的制备
取香菇菌多糖原料10g，加入适量辅料(如聚乙二醇-6000，泊洛沙姆，PVP-K30等)混合熔融，制成每粒含0.5mg或1mg或2.5mg或5mg或10mg或15mg的滴丸或微丸，即得，每次1-2粒，每日1-2次。
实施例11：香菇菌多糖注射液的制备
取香菇菌多糖10g，用10000ml注射用水溶解(可加入适宜辅料作为助溶剂)，用微孔滤膜过滤，灌装至安瓶中(每支含香菇菌多糖1mg或2mg或3mg)，灭菌，即得。肌注或输液稀释后滴注，每次1支，每周1-2次，三个月为一疗程。
实施例12：药效学，药理及动物实验结果
药效学试验治疗慢性病毒性肝炎作用：选择慢性病毒性肝炎28病例，香菇菌多糖为治疗组，同时用云芝肝泰冲剂治疗慢性病毒性肝炎28病例为对照组。经过三个月的临床观查，治疗组用药后S.G.P.T下降率为88％，而对照组则为52％。对HbsAg滴度下降方面治疗组为31.25％，照组则为19.05％。两组对比相差明显(P＞0.05)，结果表明：香菇菌多糖在治疗慢性病毒性肝炎改善肝病，保肝护肝方面有很好疗效。
香菇菌多糖动物实验：
香菇菌多糖对动物肝脏的药理作用：
①对正常小白鼠SGPT(即血清谷丙转氨酶)的影响：取体重20～25克之健康小白鼠28只，按体重随机分成3组，按表1之剂量给药，末次给药后次日从眼眶取血，按改良金氏法测定SGPT，结果表明香菇菌多糖25mg/kg/d可明显降低正常小白鼠SGPT，与对照组比较，平均降低27.6％；12.5mg/kg/d没有发现有降SGPT作用，仍在正常范围之内。
表1腹腔注射香菇菌多糖对正常小白鼠SGPT的影响
药物 动物(只) 剂量(mg/kg/d×4d) SGPT(u％±SE) 香菇菌多糖 9 25 173.0±11.8** 香菇菌多糖 9 12.5 238.0±23.7 生理盐水 10 242.0±17.2
**与生理盐水对照比较P＞0.01
②对CCL4肝损伤小白鼠SGPT的影响：取体重20～25克之健康小白鼠30只，按体重随机分成3组，按表2之剂量给药，并与线药第1和第4日腹腔注射0.1％CCL4花生油溶液0.1ml/10g体重，末次给药后，次日从眼眶取血，按改良金氏法测定SGPT，结果表明香菇菌多糖可使因CCL2造成的小白鼠SGPT值明显降低，与CCL对照组比较降低52.2％.
表2腹腔注射香菇菌多糖对CCL4肝损伤小白鼠SGPT的影响
药物 动物(只) 剂量(mg/kg/d×4d) SGPT(u％±SE) 香菇菌多糖+CCL4 10 25 165.0±23.7** 生理盐水+CCL4 10 345.0±34.5△△ 生理盐水 10 273.0±32.3
**与生理盐水+CCL4组比较P＜0.01△△与生理盐水组比较P＜0.01
③对CCL4肝损伤大白鼠SGPT的影响：取体重150～200克之健康大白鼠40只，按体重随机分成4组，按表3之剂量给药，第4天给药后2小时，第1、2、3组再分别口服25％CCL4花生油溶液0.2ml/100g体重，20小时后断头取血，按改良金氏法测定SGPT，结果表明口服香菇菌多糖25mg/kg/d×d和50mg/kg/4d×4d都可使因CCL4肝损伤引起的在大白鼠SGPT值明显降低，分别比CCL4对照组比较降低21.3％和18.1％。
表3口服香菇菌多糖对CCL4肝损伤大白鼠SGPT的影响
药物 动物(只) 剂量(mg/kg/d×4d) SGPT(u％±SE) 香菇菌多糖+CCL4 10 25 500.0±51.2** 香菇菌多糖+CCL4 10 50 520.7±27.7 生理盐水+CCL4 10 635.5±15.7△△ 生理盐水 10 214.1±15.1
**与生理盐水+CCL4组比较P＜0.05△△与生理盐水组比较P＜0.001
通过以上实验结果证明，给大、小白鼠口服或腹腔注射香菇菌多糖能明显降低因CCL4损伤肝脏引起的SGPT升高，其最适剂量约为20～50mg/kg/d×d，香菇菌多糖具有明显的保肝作用。