RSV特异性结合分子和产生它们的方式 本发明涉及生物学和医学领域。
呼吸道合胞病毒(RSV)是常见的感冒病毒，属于副粘病毒科。RSV有毒力、容易传播，并且是2岁以下儿童的下呼吸道疾病的最常见病因。在一个RSV季节中，高达98％的日托儿童将被感染。感染RSV的儿童中0.5％至3.2％需要住院治疗。在美国，每年约有90,000例就医和4500例死亡。由于RSV导致住院治疗的主要风险因素是早产、慢性肺病、先天性心脏病、免疫机能不全和其他方面健康的6周龄以下的儿童。对RSV阳性细支气管炎没有有效治疗，只能进行足够营养和氧疗形式的支持性护理。抗病毒治疗如利巴韦林在RSV感染中无效。一种单克隆抗体帕丽珠单抗(也称为Synagis)注册用于预防RSV感染。帕丽珠单抗是遗传改造(人源化)的RSV融合蛋白的单克隆抗体。然而，帕丽珠单抗不总是有效。因此，本领域需要其他抗体和治疗来对抗RSV。
本发明的目的是提供对抗和/或预防RSV相关疾病的方式和方法。本发明的另一个目的是提供另选和/或改进的RSV抗体或其功能等同物，并提供能够产生RSV抗体或其功能等同物的稳定细胞。
本发明提供能够特异性结合RSV的抗体和其功能等同物。这类抗体和/或功能等同物在本文中也称为“抗-RSV抗体”或“RSV-特异性抗体”，它们能够特异性结合RSV的至少一种组分，例如RSV蛋白质的某表位。术语“特异性结合”不包括非特异性粘附。本发明抗-RSV抗体和功能等同物特别适合对抗和/或至少部分预防RSV感染和/或RSV感染的不良影响。本发明的一种特别优选的抗-RSV抗体是称为“D25”的抗体，它具有如图11A-D所示的重链区和轻链区。具体产生D25的抗原结合特性的D25的CDR序列见图11D。与已注册的抗-RSV抗体帕丽珠单抗相比，抗体D25似乎具有优异的性能(图8)。例如，D25在HEp-2细胞感染RSV的体外中和实验中的IC50值约为0.4-1.5ng/ml，而帕丽珠单抗的IC50值约为453ng/ml。
在本文中，将抗体的功能等同物定义为抗体的功能性部分、衍生物或类似物。
抗体的功能性部分定义为与所述抗体具有至少一种相同特性(种类相同，而量不一定相同)的部分。所述功能性部分能够与所述抗体结合相同抗原，但结合程度不一定相同。抗体的功能性部分优选包括单结构域抗体、单链抗体、单链可变区片段(scFv)、Fab片段或F(ab′)2片段。
抗体的功能性衍生物定义为经改造所得化合物的至少一种特性-优选抗原结合特性-种类基本相同，而量不一定相同的抗体。以多种方式，例如通过保守性氨基酸取代提供衍生物，其中氨基酸残基被性质(大小、疏水性等)基本相似的另一残基取代，使得总体功能不大可能受到严重影响。
本领域技术人员能够产生抗体的类似化合物。通过筛选肽文库或噬菌体展示文库进行这种操作。这种类似物基本上与所述抗体具有至少一种种类相同而量不一定相同的特性。
如本领域技术人员所熟知，抗体重链是构成免疫球蛋白分子的两种链类型中较大的那种类型。重链包括恒定区和可变区，其中可变区参与抗原结合。抗体的轻链是构成免疫球蛋白分子的两种链类型中较小的那种类型。轻链包括恒定区和可变区。可变区与重链可变区一起参与抗原结合。
互补决定区(CDR)是重链可变区和轻链可变区中的高变区。抗体的重链和连接的轻链的CDR一起形成抗原结合位点。
既然本发明认识到图11所示CDR序列提供所需RSV结合特性，技术人员就能够产生包含至少一个改变的CDR序列的变体。例如，应用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代包括用性质(大小、疏水性等)基本相似的另一种氨基酸取代一种氨基酸，使得总体功能不大可能受到严重影响。
也可能改变图11所示的至少一种CDR序列，以便产生与D25相比至少一种特性改变的变异抗体或其功能等同物。优选地，提供的抗体或功能等同物包含与图11所示CDR序列至少70％相同的CDR序列，以便至少部分保持、甚至改进D25的有利结合特性。优选改变图11所示CDR序列，以使得到的抗体或功能等同物与D25相比包含至少一种改进的特性，例如改进的结合亲和力、选择性和/或稳定性。因此，包含与图11所示CDR序列至少70％相同的氨基酸序列地变异抗体或其功能等同物属于本发明范围。本领域可获得各种改变氨基酸序列的方法。例如，人工合成具有所需CDR序列的重链或轻链序列。优选地，利用(例如)随机或定位诱变使编码CDR的核酸序列突变。
因此，本发明在第一个方面提供一种分离、合成或重组的能够特异性结合呼吸道合胞病毒的抗体或其功能等同物，其包括：
-重链CDR1序列，其包含与序列NYIIN至少70％相同的序列，和/或
-重链CDR2序列，其包含与序列GIIPVLGTVHYAPKFQG至少75％相同的序列，和/或
-重链CDR3序列，其包含与序列ETALVVSTTYLPHYFDN至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR1序列，其包含与序列QASQDIVNYLN至少85％相同的序列，和/或
-轻链CDR2序列，其包含与序列VASNLET至少70％相同的序列。
优选地，所述抗体还包含轻链CDR3序列，该序列含有与序列QQYDNLP至少70％相同的序列。
优选地，本发明抗体或功能等同物包含与图11D所示的至少一种CDR序列至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％相同的CDR序列。最优选地，本发明抗体或功能等同物包含与图11D所示的至少一种CDR序列至少95％相同的CDR序列。上述特别优选的抗体D25包含由图11D所示CDR序列组成的CDR序列。因此，本发明特别优选的实施方式提供一种分离、合成或重组的能够特异性结合呼吸道合胞病毒的抗体或其功能等同物，其包括：
-重链CDR1序列，其包含序列NYIIN，和/或
-重链CDR2序列，其包含序列GIIPVLGTVHYAPKFQG，和/或
-重链CDR3序列，其包含序列ETALVVSTTYLPHYFDN，和/或
-轻链CDR1序列，其包含序列QASQDIVNYLN，和/或
-轻链CDR2序列，其包含序列VASNLET。
优选地，所述抗体还包含含有序列QQYDNLP的轻链CDR3序列。
在一个实施方式中，提供的抗体或功能等同物包含如图11D所示的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列，或者与其至少70％、优选至少80％、更优选至少85％相同的序列。因此，进一步提供一种分离、合成或重组的抗体或其功能等同物，其包含含有与序列NYIIN至少70％相同的序列的重链CDR1序列，含有与序列GIIPVLGTVHYAPKFQG至少70％相同的序列的重链CDR2序列，含有与序列ETALVVSTTYLPHYFDN至少70％相同的序列的重链CDR3序列，含有与序列QASQDIVNYLN至少70％相同的序列的轻链CDR1序列，含有与序列VASNLET至少70％相同的序列的轻链CDR2序列和含有与序列QQYDNLP至少70％相同的序列的轻链CDR3序列。所述抗体或功能等同物优选包含与图11D所示的重链CDR序列和轻链CDR序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的CDR序列。也提供包含上述重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及上述轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或功能等同物。
也提供包含与图11所示重链序列至少70％相同的重链可变区氨基酸序列的抗体或其功能等同物。这类重链序列提供所需的RSV结合特性，如抗体D25所证明的那样。因此，还提供一种抗体或其功能等同物，其重链序列包含与序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALVVSTTYLPHYFDNWGQGTLVTVSS至少70％相同的序列。而且，与图11所示轻链序列至少70％相同的轻链可变区氨基酸序列提供所需的RSV结合特性，如抗体D25所证明的那样。因此，也提供一种抗体或其功能等同物，其具有与序列DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV至少70％相同的轻链序列。本发明抗体或功能性部分优选包含与图11所示重链序列和/或轻链序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。同源性越高，所述抗体或功能性部分越接近抗体D25。本发明抗体或功能性部分优选包含类似D25的重链和轻链的重链以及轻链。因此，还提供一种抗体或功能性部分，其包含与图11所示重链序列和轻链序列至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的重链序列和轻链序列。
一个实施方式提供一种抗体或其功能等同物，其包含由图11所示重链序列构成的重链序列和由图11所示轻链序列构成的轻链序列。或者，如本领域技术人员所熟知，可能产生缩短、但维持感兴趣的结合特性的重链或轻链序列。优选地，与初始的重链或轻链相比，产生的这种缩短的重链或轻链具有较短的恒定区。优选保持可变区不变。例如，基于图11所示重链序列或轻链序列产生Fab片段或F(ab′)2片段。因此，也提供至少包含图11所示序列的功能性部分的抗体功能等同物。所述功能性部分的长度为至少20个氨基酸，包含与图11D所示重链CDR1序列至少70％相同的序列，和/或与图11D所示重链CDR2序列至少75％相同的序列，和/或与图11D所示重链CDR3序列至少70％相同的序列，和/或与图11D所示轻链CDR1序列至少85％相同的序列，和/或与图11D所示轻链CDR2序列至少70％相同的序列。优选地，所述功能性部分还包含与图11D所示轻链CDR3序列至少70％相同的序列。
本发明的另一种特别优选的抗-RSV抗体是称为“AM14”的抗体，它具有如图14A所示的重链区和轻链区。具体产生AM14的抗原结合特性的AM14的CDR序列也参见图14A。
既然本发明认识到图14A所示CDR序列提供所需RSV结合特性，技术人员就能够产生包含至少一个改变的CDR序列的变体。例如，应用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代包括用性质(大小、疏水性等)基本相似的另一种氨基酸取代一种氨基酸，使得总体功能不大可能受到严重影响。
也可能改变图14A所示的至少一种CDR序列，以便产生与AM14相比至少一种特性改变的变异抗体或其功能等同物。优选地，提供的抗体或功能等同物包含与图14A所示CDR序列至少70％相同的CDR序列，以便至少部分保持、甚至提高AM14的有利结合特性。优选改变图14A所示CDR序列，以使得到的抗体或功能等同物与AM14相比包含至少一种改进的特性，例如改进的结合亲和力、选择性和/或稳定性。因此，包含与图14A所示CDR序列至少70％相同的氨基酸序列的变异抗体或其功能等同物属于本发明范围。本领域可获得各种改变氨基酸序列的方法。例如，人工合成具有所需CDR序列的重链或轻链序列。优选地，利用(例如)随机或定位诱变使编码CDR的核酸序列突变。
因此，本发明在一个方面提供一种分离、合成或重组的能够特异性结合呼吸道合胞病毒的抗体或其功能性部分、衍生物和/或类似物，其包括：
-重链CDR1序列，其包含与序列GFSFSHYA至少70％相同的序列，和/或
-重链CDR2序列，其包含与序列ISYDGENT至少70％相同的序列，和/或
-重链CDR3序列，其包含与序列ARDRIVDDYYYYGMDV至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR1序列，其包含与序列QDIKKY至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR2序列，其包含与序列DAS至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR3序列，其包含与序列QQYDNLPPLT至少70％相同的序列。
优选地，本发明抗体或功能等同物包含与图14A所示的至少一种CDR序列至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％相同的CDR序列。最优选地，本发明抗体或功能等同物包含与图14A所示的至少一种CDR序列至少95％相同的CDR序列。上述特别优选的抗体AM14包含由图14A所示CDR序列组成的CDR序列。因此，本发明特别优选的实施方式提供一种分离、合成或重组的能够特异性结合呼吸道合胞病毒的抗体或其功能等同物，其包括：
-重链CDR1序列，其包含序列GFSFSHYA，和/或
-重链CDR2序列，其包含序列ISYDGENT，和/或
-重链CDR3序列，其包含序列ARDRIVDDYYYYGMDV，和/或
-轻链CDR1序列，其包含序列QDIKKY，和/或
-轻链CDR2序列，其包含序列DAS，和/或
-轻链CDR3序列，其包含序列QQYDNLPPLT。
在一个实施方式中，提供的抗体或功能等同物包含如图14A所示的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列，或者与其至少70％相同的序列。因此，进一步提供一种分离、合成或重组的抗体或其功能等同物，其包含含有与序列GFSFSHYA至少70％相同的序列的重链CDR1序列，含有与序列ISYDGENT至少70％相同的序列的重链CDR2序列，含有与序列ARDRIVDDYYYYGMDV至少70％相同的序列的重链CDR3序列，含有与序列QDIKKY至少70％相同的序列的轻链CDR1序列，含有与序列DAS至少70％相同的序列的轻链CDR2序列和含有与序列QQYDNLPPLT至少70％相同的序列的轻链CDR3序列。所述抗体或功能等同物优选包含与图14A所示的重链CDR序列和轻链CDR序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的CDR序列。也提供包含上述图14A的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及上述图14A的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或功能等同物。
也提供包含与图14A所示重链序列至少70％相同的重链氨基酸序列的抗体或其功能等同物。这类重链序列提供所需的RSV结合特性，如抗体AM14所证明的那样。因此，还提供一种抗体或其功能等同物，其重链序列包含与序列EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS至少70％相同的序列。而且，与图14A所示轻链序列至少70％相同的轻链氨基酸序列提供所需的RSV结合特性，如抗体AM14所证明的那样。因此，也提供一种抗体或其功能等同物，其具有与序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV至少70％相同的轻链序列。本发明抗体或功能性部分优选包含与图14A所示重链序列和/或轻链序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。同源性越高，所述抗体或功能性部分越接近抗体AM14。本发明抗体或功能性部分优选包含类似AM14的重链和轻链的重链以及轻链。因此，还提供一种抗体或功能性部分，其包含与图14A所示重链序列和轻链序列至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的重链序列和轻链序列。
一个实施方式提供一种抗体或其功能等同物，其包含由图14A所示重链序列构成的重链序列和由图14A所示轻链序列构成的轻链序列。或者，如本领域技术人员所熟知，可能产生缩短、但维持感兴趣的结合特性的重链或轻链序列。优选地，与初始的重链或轻链相比，产生的这种缩短的重链或轻链具有较短的恒定区。优选保持可变区不变。例如，基于图14A所示重链序列或轻链序列产生Fab片段或F(ab′)2片段。因此，也提供至少包含图14A所示序列的功能性部分的抗体功能等同物。所述功能性部分的长度为至少20个氨基酸，包含与图14A所示的至少一种CDR序列至少70％相同的序列。
本发明的另一种特别优选的抗-RSV抗体是称为“AM16”的抗体，它具有如图14B所示的重链区和轻链区。具体产生AM16的抗原结合特性的AM16的CDR序列也参见图14B。
既然本发明认识到图14B所示CDR序列提供所需RSV结合特性，技术人员就能够产生包含至少一个改变的CDR序列的变体。例如，应用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代包括用性质(大小、疏水性等)基本相似的另一种氨基酸取代一种氨基酸，使得总体功能不大可能受到严重影响。
也可能改变图14B所示的至少一种CDR序列，以便产生与AM16相比至少一种特性改变的变异抗体或其功能等同物。优选地，提供的抗体或功能等同物包含与图14B所示CDR序列至少70％相同的CDR序列，以便至少部分保持、甚至提高AM16的有利结合特性。优选改变图14B所示CDR序列，以使得到的抗体或功能等同物与AM16相比包含至少一种改进的特性，例如改进的结合亲和力、选择性和/或稳定性。因此，包含与图14B所示CDR序列至少70％相同的氨基酸序列的变异抗体或其功能等同物属于本发明范围。本领域可获得各种改变氨基酸序列的方法。例如，人工合成具有所需CDR序列的重链或轻链序列。优选地，利用(例如)随机或定位诱变使编码CDR的核酸序列突变。
因此，本发明在一个方面提供一种分离、合成或重组的能够特异性结合呼吸道合胞病毒的抗体或其功能性部分、衍生物和/或类似物，其包括：
-重链CDR1序列，其包含与序列GFTFSSYN至少70％相同的序列，和/或
-重链CDR2序列，其包含与序列ISAGSSYI至少70％相同的序列，和/或
-重链CDR3序列，其包含与序列AREDYGPGNYYSPNWFDP至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR1序列，其包含与序列SSNIGAGYD至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR2序列，其包含与序列GNT至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR3序列，其包含与序列HSYDRSLSG至少70％相同的序列。
优选地，本发明抗体或功能等同物包含与图14B所示的至少一种CDR序列至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％相同的CDR序列。最优选地，本发明抗体或功能等同物包含与图14B所示的至少一种CDR序列至少95％相同的CDR序列。上述特别优选的抗体AM16包含由图14B所示CDR序列组成的CDR序列。因此，本发明特别优选的实施方式提供一种分离、合成或重组的能够特异性结合呼吸道合胞病毒的抗体或其功能等同物，其包括：
-重链CDR1序列，其包含序列GFTFSSYN，和/或
-重链CDR2序列，其包含序列ISAGSSYI，和/或
-重链CDR3序列，其包含序列AREDYGPGNYYSPNWFDP，和/或
-轻链CDR1序列，其包含序列SSNIGAGYD，和/或
-轻链CDR2序列，其包含序列GNT，和/或
-轻链CDR3序列，其包含序列HSYDRSLSG。
在一个实施方式中，提供的抗体或功能等同物包含如图14B所示的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列，或者与其至少70％相同的序列。因此，进一步提供一种分离、合成或重组的抗体或其功能等同物，其包含含有与序列GFTFSSYN至少70％相同的序列的重链CDR1序列，含有与序列ISAGSSYI至少70％相同的序列的重链CDR2序列，含有与序列AREDYGPGNYYSPNWFDP至少70％相同的序列的重链CDR3序列，含有与序列SSNIGAGYD至少70％相同的序列的轻链CDR1序列，含有与序列GNT至少70％相同的序列的轻链CDR2序列和含有与序列HSYDRSLSG至少70％相同的序列的轻链CDR3序列。所述抗体或功能等同物优选包含与图14B所示的上述重链CDR序列和上述轻链CDR序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的CDR序列。也提供包含上述图14B的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及上述图14B的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或功能等同物。
也提供包含与图14B所示重链序列至少70％相同的重链氨基酸序列的抗体或其功能等同物。这类重链序列提供所需的RSV结合特性，如抗体AM16所证明的那样。因此，还提供一种抗体或其功能等同物，其重链序列包含与序列EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSHISAGSSYIYYSDSVKGRFTVSRDNVRNSVYLQMNSLRAADTAVYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLVTVSS至少70％相同的序列。而且，与图14B所示轻链序列至少70％相同的轻链氨基酸序列提供所需的RSV结合特性，如抗体AM16所证明的那样。因此，也提供一种抗体或其功能等同物，其具有与序列QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVSDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCHSYDRSLSGSVFGGGTKLTV至少70％相同的轻链序列。本发明抗体或功能性部分优选包含与图14B所示重链序列和/或轻链序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。同源性越高，所述抗体或功能性部分越接近抗体AM16。本发明抗体或功能性部分优选包含类似AM16的重链和轻链的重链以及轻链。因此，还提供一种抗体或功能性部分，其包含与图14B所示重链序列和轻链序列至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的重链序列和轻链序列。
一个实施方式提供一种抗体或其功能等同物，其包含由图14B所示重链序列构成的重链序列和由图14B所示轻链序列构成的轻链序列。或者，如本领域技术人员所熟知，可能产生缩短、但维持感兴趣的结合特性的重链或轻链序列。优选地，与初始的重链或轻链相比，产生的这种缩短的重链或轻链具有较短的恒定区。优选保持可变区不变。例如，基于图14B所示重链序列或轻链序列产生Fab片段或F(ab′)2片段。因此，也提供至少包含图14B所示序列的功能性部分的抗体功能等同物。所述功能性部分的长度为至少20个氨基酸，包含与图14B所示的至少一种CDR序列至少70％相同的序列。
本发明的另一种特别优选的抗-RSV抗体是称为“AM23”的抗体，它具有如图14C所示的重链区和轻链区。具体产生AM23的抗原结合特性的AM23的CDR序列也参见图14C。
既然本发明认识到图14C所示CDR序列提供所需RSV结合特性，技术人员就能够产生包含至少一个改变的CDR序列的变体。例如，应用保守性氨基酸取代。保守性氨基酸取代包括用性质(大小、疏水性等)基本相似的另一种氨基酸取代一种氨基酸，使得总体功能不大可能受到严重影响。
也可能改变图14C所示的至少一种CDR序列，以便产生与AM23相比至少一种特性改变的变异抗体或其功能等同物。优选地，提供的抗体或功能等同物包含与图14C所示CDR序列至少70％相同的CDR序列，以便至少部分保持、甚至提高AM23的有利结合特性。优选改变图14C所示CDR序列，以使得到的抗体或功能等同物与AM23相比包含至少一种改进的特性，例如改进的结合亲和力、选择性和/或稳定性。因此，包含与图14C所示CDR序列至少70％相同的氨基酸序列的变异抗体或其功能等同物属于本发明范围。本领域可获得各种改变氨基酸序列的方法。例如，人工合成具有所需CDR序列的重链或轻链序列。优选地，利用(例如)随机或定位诱变使编码CDR的核酸序列突变。
因此，本发明在一个方面提供一种分离、合成或重组的能够特异性结合呼吸道合胞病毒的抗体或其功能性部分、衍生物和/或类似物，其包括：
-重链CDR1序列，其包含与序列GFNFHNYG至少70％相同的序列，和/或
-重链CDR2序列，其包含与序列VWYDGSKK至少70％相同的序列，和/或
-重链CDR3序列，其包含与序列VRDKVGPTPYFDS至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR1序列，其包含与序列NIGSET至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR2序列，其包含与序列DDD至少70％相同的序列，和/或
-轻链CDR3序列，其包含与序列QVWDRSNYHQV至少70％相同的序列。
优选地，本发明抗体或功能等同物包含与图14C所示的至少一种CDR序列至少75％，更优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％相同的CDR序列。最优选地，本发明抗体或功能等同物包含与图14C所示的至少一种CDR序列至少95％相同的CDR序列。上述特别优选的抗体AM23包含由图14C所示CDR序列组成的CDR序列。因此，本发明特别优选的实施方式提供一种分离、合成或重组的能够特异性结合呼吸道合胞病毒的抗体或其功能等同物，其包括：
-重链CDR1序列，其包含序列GFNFHNYG，和/或
-重链CDR2序列，其包含序列VWYDGSKK，和/或
-重链CDR3序列，其包含序列VRDKVGPTPYFDS，和/或
-轻链CDR1序列，其包含序列NIGSET，和/或
-轻链CDR2序列，其包含序列DDD，和/或
-轻链CDR3序列，其包含序列QVWDRSNYHQV。
在一个实施方式中，提供的抗体或功能等同物包含如图14C所示的三个重链CDR序列和三个轻链CDR序列，或者与其至少70％相同的序列。因此，进一步提供一种分离、合成或重组的抗体或其功能等同物，其包含含有与序列GFNFHNYG至少70％相同的序列的重链CDR1序列，含有与序列VWYDGSKK至少70％相同的序列的重链CDR2序列，含有与序列VRDKVGPTPYFDS至少70％相同的序列的重链CDR3序列，含有与序列NIGSET至少70％相同的序列的轻链CDR1序列，含有与序列DDD至少70％相同的序列的轻链CDR2序列和含有与序列QVWDRSNYHQV至少70％相同的序列的轻链CDR3序列。所述抗体或功能等同物优选包含与图14C所示的上述重链CDR序列和上述轻链CDR序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的CDR序列。也提供包含上述图14C的重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及上述图14C的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体或功能等同物。
也提供包含与图14C所示重链序列至少70％相同的重链氨基酸序列的抗体或其功能等同物。这类重链序列提供所需的RSV结合特性，如抗体AM23所证明的那样。因此，还提供一种抗体或其功能等同物，其重链序列包含与序列EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGMNWVRQAPGKGLEWVAVVWYDGSKKYYADSVTGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS至少70％相同的序列。而且，与图14C所示轻链序列至少70％相同的轻链氨基酸序列提供所需的RSV结合特性，如抗体AM23所证明的那样。因此，也提供一种抗体或其功能等同物，其具有与序列SYVLTQPPSVSLAPGGTAAITCGRNNIGSETVHWYQQKPGQAPVLVVYDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV至少70％相同的轻链序列。本发明抗体或功能性部分优选包含与图14C所示重链序列和/或轻链序列至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的重链可变区序列和/或轻链可变区序列。同源性越高，所述抗体或功能性部分越接近抗体AM23。本发明抗体或功能性部分优选包含类似AM23的重链和轻链的重链以及轻链。因此，还提供一种抗体或功能性部分，其包含与图14C所示重链序列和轻链序列至少70％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％相同的重链序列和轻链序列。
一个实施方式提供一种抗体或其功能等同物，其包含由图14C所示重链序列构成的重链序列和由图14C所示轻链序列构成的轻链序列。或者，如本领域技术人员所熟知，可能产生缩短、但维持感兴趣结合特性的重链或轻链序列。优选地，与初始的重链或轻链相比，产生的这种缩短的重链或轻链具有较短的恒定区。优选保持可变区不变。例如，基于图14C所示重链序列或轻链序列产生Fab片段或F(ab′)2片段。因此，也提供至少包含图14C所示序列的功能性部分的抗体功能等同物。所述功能性部分的长度为至少20个氨基酸，包含与图14C所示的至少一种CDR序列至少70％相同的序列。
本发明提供与现有技术抗体相比具有改进特性的RSV-特异性抗体或其功能等同物。本发明者成功产生具有低IC50值的RSV特异性抗体。这类抗体对RSV的亲和力特别高或特别强，因此特别适合对抗和/或至少部分预防RSV感染和/或RSV感染的不良影响。一个实施方式提供在HEp-2细胞感染RSV的体外中和实验中IC50值小于10ng/ml的抗体以及所述抗体的功能等同物。所述抗体或功能等同物的IC50值优选小于5ng/ml，更优选小于2ng/ml。在实施例所述的体外中和实验中，优选抗体D25的IC50值约为0.5-1.5ng/ml(参见图8)。
本发明抗体优选为人抗体。将人抗体用于治疗人能降低由于人个体对非人序列产生免疫反应所致的副作用的几率。在另一优选实施方式中，本发明的抗体或功能性部分、衍生物或类似物是嵌合抗体。以此方式，可以将感兴趣的序列，例如感兴趣的结合位点包括到本发明抗体或功能等同物内。
本发明还提供分离、合成或重组的编码本发明抗体或功能等同物的核酸序列或其功能性部分、衍生物或类似物。例如，这类核酸分离自能够产生本发明抗体的B细胞，如下文更详细地描述。优选的实施方式提供包含至少与图11、图12、图14A、图14B和/或图14B所示核酸序列的功能性部分至少70％同源的序列的核酸序列。所述核酸序列优选包含至少与图11、图12、图14A、图14B和/或图14B所示核酸序列的功能性部分至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％同源的序列。所述功能性部分的长度为至少30个核苷酸，优选至少50个核苷酸、更优选至少75个核苷酸。优选地，所述功能性部分编码图11D、图12、图14A、图14B和/或图14B所示的至少一种核酸序列。所述序列优选为CDR序列。
本发明的抗体或功能等同物特别适合用作药物或预防剂。本文也提供用作药物和/或预防剂的本发明抗体或其功能性部分、衍生物或类似物。在特别优选的实施方式中，所述抗体包括抗体D25、AM14、AM16和/或AM23，或其功能性部分、衍生物或类似物。所述药物或预防剂优选用于抵抗或至少部分预防RSV感染，或者抵抗或至少部分预防RSV感染的不良影响。因此，也提供本发明抗体、功能性部分、衍生物或类似物在制备用于至少部分治疗和/或预防RSV相关疾病的药物和/或预防剂中的应用，以及用于至少部分治疗和/或预防RSV相关疾病的方法，所述方法包括给予需要的个体治疗有效量的本发明抗体或功能等同物。所述抗体优选包括抗体D25、AM14、AM16和/或AM23，或其功能性部分、衍生物或类似物。
为了抵抗RSV，本发明抗体或功能等同物优选在发生RSV感染之前给予个体。或者，在个体已经感染RSV时给予本发明抗体或功能等同物。所述抗体或功能等同物优选给予患RSV相关疾病风险提高的个体，如早产儿、患有慢性肺病、先天性心脏病和/或免疫功能不全的个体，以及6周龄以下的儿童。老年人患RSV相关疾病的风险也升高。本发明抗体或功能等同物优选通过口服或者一次或多次注射给予。根据需要严格制定方案的临床试验中的临床剂量递增研究，设计用于本文所述治疗应用的本发明抗体和/或功能等同物的剂量范围。典型剂量为0.1至10mg/kg体重。在治疗应用中，本发明抗体或功能等同物一般与药学上可接受的载体、辅料、稀释剂和/或赋形剂联合使用。例如，合适载体的例子包括钥孔血蓝素(KLH)、血清白蛋白(如BSA或RSA)和卵清蛋白。本领域技术人员了解许多合适的油基和水基辅料。在一个实施方式中，所述辅料包括Specol。在另一实施方式中，所述合适的载体包括溶液，如盐水。
在另一实施方式中，使用编码本发明抗体或功能性部分的核酸。给予这种核酸后，通过宿主的细胞机器产生抗体或功能等同物。所产生的抗体或功能等同物能够预防和/或对抗RSV感染和/或RSV感染的不良影响。因此，本文也提供用作药物和/或预防剂的本发明核酸序列、功能性部分、衍生物和/或类似物。所述核酸优选用于对抗RSV。因此，还提供本发明核酸序列、功能性部分、衍生物和/或类似物在制备至少部分治疗和/或预防RSV相关疾病的药物和/或预防剂中的应用。
至少为本发明核酸的功能性部分指所述核酸的一部分，长度为至少30个碱基对、优选至少50个碱基对、更优选至少100个碱基对，其包含与本发明核酸相同的至少一种表达特征(种类相同，而量不一定相同)。所述功能性部分至少编码包含与图11D、图14A、图14B和/或图14C所示CDR序列至少70％相同的序列的氨基酸序列。
本发明还提供产生分离抗体的细胞，它能够产生本发明抗体、功能性部分、衍生物或类似物。实施例中详细描述了获得这类产生抗体的细胞的可能(而非限制性)方式。本发明人开发和使用新方法来提高产生RSV特异性抗体的细胞的稳定性。使用这种方法产生的RSV特异性抗体产生细胞至少稳定6个月。因此，本发明也提供能稳定至少9周、优选至少3个月、更优选至少6个月的本发明RSV特异性抗体产生细胞。
本发明者认识到，通过影响RSV特异性抗体产生细胞中BCL6和/或Blimp-1表达产物的量，能够实现所述抗体产生细胞的稳定性。BCL6和/或Blimp-1表达产物的量受直接或间接影响。优选地，对所述抗体产生细胞内BCL6和Blimp-1表达产物的量均作调节，因为这两种表达产物都涉及抗体产生细胞的稳定性。抗体产生细胞的稳定性定义为所述抗体产生细胞保持在某个发育阶段的能力(优选在所述细胞进入所述阶段后)。细胞的不同发育阶段包括至少一种不同的所述细胞的特征。例如，已知记忆B细胞在刺激后通过一些研究者称之为浆母细胞的阶段分化成抗体分泌型浆细胞。记忆B细胞、浆母细胞和浆细胞是其中B细胞具有不同特征的B细胞的不同发育阶段。记忆B细胞具有低增殖和低抗体分泌特性。与记忆B细胞相比浆母细胞具有较高的增殖水平和较高的抗体分泌水平，而浆细胞分泌高抗体水平，但不能增殖。使用本发明者所述的方法可能调节抗体产生细胞的复制寿命。在本文中，抗体产生细胞的复制寿命定义为B细胞和其后代细胞能够复制并且维持其产生抗体和/或发育成抗体产生细胞的能力的时间。优选延长抗体产生细胞的复制寿命，这意味着所述抗体产生细胞将不发生终末分化，或者与目前使用的相同种类的抗体产生细胞相比只在较长时间后才发生终末分化，并且在体外持续增殖。按照本发明，可能调节抗体产生细胞中BCL6和/或Blimp-1表达产物的量，使得该抗体产生细胞进入和/或保持在预定的细胞持续增殖的发育状态。因此，使用本发明方法可能延长抗体产生细胞的复制寿命，因为有可能将B细胞维持在发生复制的某个发育阶段。参见本申请人提交的PCT/NL2006/000625。本发明提供产生稳定的RSV特异性抗体产生细胞的方式和方法。
抗体产生细胞定义为能够产生和/或分泌抗体或其功能等同物的细胞，和/或能够发育成能够产生和/或分泌抗体或其功能等同物的细胞的细胞。在本文中，RSV特异性抗体产生细胞定义为细胞能够产生和/或分泌抗体或其功能等同物，所述抗体或其功能等同物能够特异性结合RSV和/或RSV组分，如RSV F(融合)蛋白、RSV G(附连)蛋白或RSV SH(小疏水)蛋白的表位。优选地，所述RSV特异性抗体产生细胞包括B细胞和/或B细胞衍生的浆细胞。B细胞在本文中称为抗体产生细胞，甚至在该B细胞处于抗体产量很低或根本不产生抗体的阶段，如活化或未经活化的原始B细胞或记忆B细胞，因为这种细胞能够发育成产生抗体的细胞，如浆母细胞和/或浆细胞。
本发明RSV特异性抗体产生细胞优选包含哺乳动物细胞。非限制性例子包括衍生自人个体、啮齿动物、兔、骆驼、猪、牛、山羊、马、猿、大猩猩的抗体产生细胞。所述抗体产生细胞优选包括人细胞、鼠细胞、兔细胞和/或骆驼细胞。
BCL6编码正常B细胞和T细胞的发育和成熟所需以及生发中心形成所需的转录阻抑蛋白。(Ye，1997)。BCL6在生发中心B细胞中高表达，而在浆细胞中几乎不表达。BCL6抑制活化B细胞向浆细胞的分化。转录阻抑蛋白B淋巴细胞诱导的成熟蛋白-1(Blimp-1)是B细胞发育成浆细胞必需的因子。Blimp-1的人变体称为Prdm1。如本文所用，任何提及Blimp-1的地方均包括Prdm1。Blimp-1驱动浆细胞分化。BCL6和Blimp-1互相抑制表达；因此在天然状况下，其中一种达到的表达水平高于另一种时，强制达到某分化状态。在人体中，从活化原始B细胞或记忆B细胞分化成浆细胞涉及BCL6的下调和Blimp-1的上调。在生发中心，细胞BCL6表达水平高，Blimp-1表达水平低。在静息的记忆细胞中，BCL6和Blimp-1的表达水平均较低。触发分化的信号引起Blimp-1上调，此种Blimp-1对抗BCL6的表达。BCL6和Blimp-1均表达的阶段很短，称为浆母细胞。随着Blimp-1水平的不断提高，BCL6表达消失，导致形成浆细胞。
在本发明的一个实施方式中，提供BCL6和Blimp-1共同表达的RSV特异性抗体产生细胞(意味着BCL6和Blimp-1均在所述抗体产生细胞中表达至少1天、优选至少1周、更优选至少6周、最优选至少3个月)。提供合适的信号时，所述RSV特异性抗体产生细胞能够增殖。已发现，BCL6和Blimp-1共同表达产生能够增殖和产生抗体的抗体产生细胞。BCL6和Blimp-1优选在B细胞，优选人B细胞中共同表达。BCL6和Blimp-1在B细胞中共同表达导致所述B细胞稳定在浆母细胞状阶段。浆母细胞类似于浆细胞，能够分泌抗体。然而，浆母细胞仍然能够增殖，而浆细胞已丧失增殖能力。因此，浆细胞不适合培养抗体产生细胞系。
一个优选的实施方式提供RSV特异性抗体产生细胞，其包含编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性核酸序列。外源性核酸在本文中定义为在天然情况下不属于细胞基因组的核酸序列。使用这类外源性核酸分子，可能在不依赖内源性BCL6表达的情况下调节抗体产生细胞中的BCL6浓度。因此，即使内源性BCL6的表达水平较低或者不表达(例如Blimp-1所致)，编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性核酸序列仍然能够产生足够影响抗体产生细胞稳定性的浓度的BCL6。所述编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列优选为为组成型活性，因此即使在所述细胞的内源性BCL6表达被内源性阻抑物如Blimp-1抑制时也能维持BCL6表达。最优选地，所述编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列的表达受阻抑物的外源性诱导物的调节，使得能够任意调节BCL6表达的程度。
优选地，如下文所详述，本发明RSV特异性抗体产生细胞包含编码Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性核酸序列。如果存在Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或类似物，则可能在低细胞密度的条件下培养浆母细胞。优选地，所述编码Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列的表达受阻抑物的外源性诱导物的调节，使得能够任意调节Bcl-xL表达的程度。因此，一个优选实施方式提供一种RSV特异性抗体产生细胞，其包含：
-编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性核酸序列，和/或
-编码Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性核酸序列。
所述RSV特异性抗体产生细胞优选同时包含编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性核酸序列和编码Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性核酸序列。优选地，所述编码BCL6、Bcl-xL或者BCL6或Bcl-xL的功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列的表达受外源性化合物诱导的激活物和/或阻抑物的调节。例如，使用诱导型启动子系统，例如Tet-on或Tet-off系统。
优选通过在RSV特异性抗体产生细胞中共同表达BCL6和Blimp-1产生本发明的稳定的RSV特异性抗体产生细胞。RSV特异性抗体产生细胞优选获自已接触RSV的个体。分离抗体产生细胞的方法是本领域已知的。例如，用标记物或标签作标记的RSV衍生化合物与接触RSV的个体的样品一起孵育，该样品包含抗体产生细胞。分离识别该标记的RSV衍生化合物的RSV特异性抗体产生细胞，同时洗掉未结合的细胞。随后，通过共同表达BCL6和Blimp-1使得到的RSV特异性抗体产生细胞稳定化。
一个实施方式包括，首先稳定来自RSV接触供者的全部抗体产生细胞，然后分离识别标记的RSV衍生化合物的细胞。在另一实施方式中，抗体产生细胞在其B细胞受体(BCR，抗体的膜表达形式)下游具有(荧光)标记物，所述受体在抗体产生细胞通过BCR结合未标记/未标签的抗原时传导信号。选择该标记物翻转的抗体产生细胞，随后通过共同表达BCL6和Blimp-1使其稳定。在另一实施方式中，在没有抗原衍生化合物可用，但有实验可用于筛选独特抗体时，通过共同表达BCL6和Blimp-1，任选还表达Bcl-XL来稳定全部/大批抗体产生细胞。按照这个实施方式，在L细胞存在下以低密度培养细胞，优选96孔板每孔中10至100个细胞(小批量培养物，MBC)。培养物上清液可直接用于筛选实验，例如ELISA、Western印迹或功能试验如ELISPOT，中和实验或细胞迁移实验。
在一个实施方式中，选择MBC，为了获得感兴趣抗体产生细胞的单克隆细胞系，对培养物进行有限稀释，优选在2-3周后，再次用优选实验筛选这些培养物的上清液。
如本领域技术人员所熟知，本领域可获得许多替换方法。上述实施方式是非限制性的。
因此，还提供一种产生抗体产生细胞的方法，其稳定至少三个月并且能够产生RSV-特异性抗体或其功能等同物，所述方法包括：
-提高能够产生RSV-特异性抗体或其功能等同物的细胞中的Blimp-1表达水平；和
-提高和/或维持所述细胞中的BCL6表达水平。
利用本发明方法，可能将RSV特异性记忆B细胞转变为浆母细胞样细胞，并稳定所述细胞，因此不会快速分化成浆细胞。这与浆细胞的天然发育不同，其中Blimp-1在记忆B细胞中的表达导致快速发育成浆细胞，从而抑制BCL6表达，因此得到的浆细胞几乎不表达BCL6。因此，本发明的一个实施方式包括在RSV特异性B细胞中共同表达BCL6和Blimp-1，产生能够增殖和产生抗体的细胞。所述RSV特异性B细胞中BCL6表达水平优选被调整到或维持在与浆母细胞相同或更高的水平。以此种方式产生RSV特异性B细胞的稳定培养物，该细胞保持产生RSV-特异性抗体的能力。优选通过加入抗-凋亡基因Bcl-xL，进一步稳定共同表达BCL6和Blimp-1的这些RSV特异性B细胞。通过引入Bcl-xL，现在可能在低细胞密度条件下培养浆母细胞。因此，本发明也提供一种在低细胞密度的条件下培养浆母细胞的方法，所述方法包括用本文所述的任何方法产生具有BCL6、Blimp-1和Bcl-xL表达水平的RSV特异性抗体产生细胞。
通过各种方式调节BCL6表达产物(优选BCL6蛋白)在RSV特异性抗体产生细胞中的含量。
在一个实施方式中，向抗体产生细胞提供能够直接或间接影响BCL6表达的化合物。优选向抗体产生细胞提供能够增强BCL6表达的化合物，以对抗Blimp-1表达期间的BCL6下调。这类化合物优选包含信号转导及转录活化蛋白5(STAT5)或其功能性部分、衍生物和/或类似物，和/或编码它们的核酸序列。STAT5是能够增强BCL6表达的信号转导蛋白。STAT5有两种已知形式STAT5a和STAT5b，它们由两种不同的串联基因编码。给予和/或激活STAT5导致BCL6水平提高。因此，STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物对BCL6表达的上调作用至少部分补偿了Blimp-1对BCL6的下调作用。因此，STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物能够直接影响BCL6表达。也可能间接影响BCL6表达。例如，这可通过调节能够直接或间接激活STAT5和/或调节STAT5表达的化合物的用量实现。因此，在一个实施方式中，提高内源性和/或外源性STAT5的表达和/或活性。例如，可能通过在能够激活STAT5的白介素(IL)2和/或IL4存在下培养抗体产生细胞，间接增强BCL6表达。
在一个实施方式中，向RSV特异性抗体产生细胞提供编码STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列，其中所述核酸序列具有组成型活性，这意味着STAT5不依赖(内源性)调节物的存在而持续表达。在内源性STAT5表达水平较低或不表达的情况下，优选施加编码STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性组成型活性核酸序列导致STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物的浓度足以增加BCL6表达。最优选地，向RSV特异性抗体产生细胞提供编码包含STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物的化合物，优选融合蛋白的核酸序列，其活性受阻抑物的外源性诱导物的调节，因此可随意调节BCL6表达的激活程度。提供诱导BCL-6的另一系统Tet-on系统，其中加入四环素和/或四环素衍生物诱导反式激活蛋白的活性，反式激活蛋白能诱导BCL6基因的转录，然后是BCL蛋白合成。在一个优选实施方式中，向抗体产生细胞提供编码雌激素受体(ER)和STAT5的融合蛋白ER-STAT5的核酸序列。此种融合蛋白无活性，因为它在胞浆中与热激蛋白形成复合物。STAT5不能以此种方式到达细胞核，无法提高BCL6表达。给予外源性诱导物4羟基-他莫昔芬(4HT)后，融合蛋白ER-STAT5与热激蛋白解离，因此STAT5能够进入细胞核并激活BCL6表达。
此外或或者，在能够直接或间接增强BCL6表达的化合物存在下培养所述抗体产生细胞，从而提高RSV特异性抗体产生细胞中的BCL6表达。
因此，一种实施方式提供一种产生RSV特异性抗体产生细胞的方法，所述方法包括：
-向RSV特异性抗体产生细胞提供能够直接或间接增强BCL6表达的化合物；和/或
-在能够直接或间接增强BCL6表达的化合物存在下培养RSV特异性抗体产生细胞。
能够直接或间接增强BCL6表达的所述化合物优选包含STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物。因此，本发明提供一种方法，其包括向所述RSV特异性抗体产生细胞提供STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物，或者编码STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列。在一个实施方式中，在将编码STAT5或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列引入所述细胞后，培养所述抗体产生细胞。例如，通过转染和/或病毒介导的基因转移将所述核酸序列引入所述细胞。本领域可获得将核酸序列引入细胞的许多另选方法，在这里无须进一步解释。
使用能够直接或间接增强BCL6表达的化合物，可能提高内源性BCL6的表达。然而，在一个优选的实施方式中，向抗体产生细胞提供编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列。如前所述，优选编码BCL6的外源性核酸，因为这能够在不依赖内源性BCL6表达的情况下调节细胞内的BCL6浓度。因此，即使内源性BCL6的表达水平较低或者不表达(例如Blimp-1所致)，编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性核酸序列仍然能够产生足够影响抗体产生细胞稳定性的浓度的BCL6。因此，本发明也提供一种方法，其包括向RSV特异性抗体产生细胞提供编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列。优选地，向所述抗体产生细胞提供编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的组成型活性核酸序列，从而在所述细胞的内源性BCL6表达被内源性阻抑物如Blimp-1抑制时，维持BCL6表达。最优选地，通过阻抑物的外源性诱导物调节编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的所述核酸序列的表达，从而随意调节BCL6的表达程度。例如，使用已有记载的诱导型启动子系统，例如Tet-on或Tet-off系统。
在另一优选的实施方式中，本发明提供一种方法，其中通过向RSV特异性抗体产生细胞提供编码E47或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列间接调节BCL6含量。E47编码的转录因子属于螺旋-环-螺旋蛋白质家族，即E-蛋白家族。有四种E-蛋白，即E12、E47、E2-2和HEB参与淋巴细胞发育。E12和E47由一种基因即E2A编码，但剪接不同。E-蛋白可被E蛋白抑制剂Id2和Id3，以及ABF-1抑制(Mathas S.，2006)。E蛋白被描述为肿瘤抑制剂，其过度表达能诱导凋亡。E47的特异性靶点之一是Socs1和Socs3基因。这些Socs基因被称为STAT5b的负调节基因，因而是BCL6的间接调节剂。换言之，E47在B细胞内的表达增强了Blimp-1表达，这导致B细胞向抗体产生表型(浆细胞)分化。
也通过各种方式调节Blimp-1在RSV特异性抗体产生细胞中的表达量。在一个实施方式中，向RSV特异性抗体产生细胞提供能够直接或间接影响Blimp-1表达的化合物。此外或或者，在能够直接或间接影响Blimp-1表达的化合物存在下培养抗体产生细胞。因此，本发明还提供一种方法，其包括向RSV特异性抗体产生细胞提供能够直接或间接影响Blimp-1表达的化合物。本发明还提供一种方法，其包括在能够直接或间接影响Blimp-1表达的化合物存在下培养所述抗体产生细胞。优选使用能够增强Blimp-1表达的化合物，以对抗BCL6表达期间Blimp-1的下调。所述化合物最优选包括IL-21。
在一个优选实施方式中，能够直接或间接影响Blimp-1表达的所述化合物包括信号转导及转录活化蛋白3(STAT3)蛋白或其功能性部分、衍生物和/或类似物，和/或编码它们的核酸序列。STAT3是参与B细胞发育和分化的信号转导蛋白。STAT3能够上调Blimp-1表达。因此，本发明还提供一种方法，其中能够直接或间接影响Blimp-1表达的所述化合物包括STAT3或其功能性部分、衍生物和/或类似物，或编码STAT3或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列。最优选地，通过阻抑物的外源性诱导物调节编码STAT3或其功能性部分、衍生物和/或类似物的所述核酸序列的表达，从而随意调节STAT3的表达程度。例如，使用诱导型启动子系统，例如Tet-on或Tet-off系统。在一个实施方式中，将包含STAT3、衍生物或类似物和ER的融合产物引入所述细胞，以便通过羟基他莫昔芬调节STAT3表达。
由于STAT3能够影响Blimp-1表达，也可能通过给予能够直接或间接调节STAT3的活性和/或表达的化合物间接调节Blimp-1表达。在一个实施方式中，向抗体产生细胞提供能够增强STAT3活性的化合物，以便间接提高Blimp-1的表达。因此，本发明还提供一种方法，其中向抗体产生细胞提供能够直接或间接增强STAT3活性的化合物。
因此，在一个实施方式中，向抗体产生细胞提供能够直接或间接激活STAT3的化合物，以便提高Blimp-1表达。
以各种方式激活STAT3。优选地，通过向抗体产生细胞提供细胞因子激活STAT3。在天然情况下参与B细胞分化的细胞因子能非常有效地调节STAT蛋白。STAT3的非常有效的激活物是IL-21和IL-6，而且已知IL-2、IL-7、IL-10、IL-15和IL-27也能激活STAT3。而且，参与先天免疫的Toll-样受体(TLR)也能够激活STAT3。因此，本发明的一个实施方式提供一种方法，其中能够直接或间接影响Blimp-1表达的所述化合物包括IL-21、IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、IL-15和/或IL-27。最优选使用IL-21，因为IL-21特别适合影响抗体产生细胞的稳定性。即使在BCL6对抗Blimp-1表达时，IL-21也能够上调Blimp-1表达。
此外或或者，使用突变的詹纳斯激酶(JAK)以激活STAT3。天然条件下，JAK自身被至少一种细胞因子激活后能够磷酸化STAT3。能够不依赖细胞因子的存在而激活STAT3的突变的詹纳斯激酶特别适用于本发明方法。
如前所述，在一个实施方式中能够增强Blimp-1表达的化合物包括编码STAT3或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列。存在编码STAT3或其功能性部分、衍生物和/或类似物的外源性核酸序列使得即使在内源性STAT3的表达非常低或不表达时，仍然持续存在STAT3或其功能性部分、衍生物和/或类似物。
也可能降低STAT5的表达和/或活性，以上调Blimp-1。如果STAT5的含量和/或活性降低，也降低BCL6表达的激活，这导致BCL6表达产物含量降低。由于BCL6和Blimp-1互相对抗表达，所以BCL6表达产物量减少导致Blimp-1表达产物量增加。因此，能够下调STAT5活性的化合物能够间接上调Blimp-1。例如，这类化合物包括细胞因子信号传导抑制蛋白(SOCS)。因此，在一个实施方式中，通过向所述细胞提供SOCS蛋白，和/或在所述细胞中激活SOCS蛋白，能上调RSV特异性抗体产生细胞中Blimp-1表达产物的含量。
在一个优选实施方式中，向RSV-特异性抗体产生细胞提供编码E47或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列时，STAT5的表达和/或活性降低。在高水平表达STAT5b的B细胞内表达E47干涉了分化和增殖，即通过E47和SOCS阻断STAT5导致BCL6水平降低，随后Blimp-1水平上升。Blimp-1水平上调导致增殖水平下降，并导致所涉及细胞向抗体产生细胞的分化。换言之，在B细胞内表达E47增强Blimp-1表达，这导致B细胞向抗体产生表型(浆细胞)分化。
至少STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6的功能性部分指与STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6相比，影响抗体产生细胞的稳定性的能力相同-种类相同、量不一定相同-的蛋白性分子。例如，STAT5蛋白或STAT3蛋白的功能性部分不含不参与或是很少参与所述能力的氨基酸。STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6的衍生物定义为经改变，所述蛋白质影响抗体产生细胞的稳定性的能力种类基本相同而量不一定相同的蛋白质。以多种方式，例如通过保守性氨基酸取代提供衍生物，其中一个氨基酸被性质(大小、疏水性等)基本相似的另一氨基酸取代，使得总体功能不大可能受到严重影响。例如，衍生物包括融合蛋白，如STAT5-ER或STAT3-ER融合蛋白，其活性取决于4羟基-他莫昔芬(4HT)的存在。STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6的类似物定义为影响抗体产生细胞稳定性的能力种类相同而量不一定相同的分子。所述类似物不一定衍生自所述STAT5蛋白、STAT3蛋白、Bcl-xL和/或BCL6。
在一个优选实施方式中，在向所述抗体产生细胞提供编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列之前，在IL-21存在下培养所述RSV特异性抗体产生细胞。优选在向所述细胞提供编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列之前，在IL-21存在下培养RSV特异性抗体产生细胞，优选B细胞，因为在这些实施方式中，稳定性、增殖和/或抗体产生得到特别改善。
在优选实施方式中，本发明提供一种影响本文所述RSV特异性抗体产生细胞的稳定性的方法，该方法还包括直接或间接提高所述抗体产生细胞中Bcl-xL表达产物的含量。例如，可通过向所述抗体产生细胞提供编码Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列或编码其他抗凋亡基因，包括但不限于Bcl-2的核酸序列实现上述目的。在另一实施方式中，通过向所述抗体产生细胞提供能够直接或间接提高Bcl-xL表达的化合物实现这一目的，所述化合物包括APRIL、BAFF、CD40、BCR刺激、细胞因子、生长因子或下游效应物样JNK和AKT(PKB)。
Bcl-xL是抗凋亡Bcl-2家族成员，Bcl2蛋白与所谓的仅含Bcl-2同源结构域3(BH3)的家族成员如Bax、Bak、Bim和Bad相互作用或对抗，在接受到固有死亡刺激后诱导细胞色素c释放(Boise，L.H.，1993)。因此，通过诸如Bcl-xL等蛋白质保护线粒体膜的完整性对于细胞存活至关重要。
已证明，STAT5激活能保护细胞免于发生细胞死亡。STAT5能够调节Bcl-xL的表达，这支持了STAT5的抗凋亡作用。STAT5通过Bcl-xL启动子内的STAT结合元件正调节Bcl-xL表达。在体内，在STAT5A/B-双缺陷小鼠的骨髓中没有Bcl-xL表达。而且，STAT5-介导的成红血细胞存活依赖于Bcl-xL的上调。近年来，已证明Bcl-xL在小鼠B细胞中的转基因过表达可促进B细胞存活和非恶性浆细胞灶。
本发明方法特别适合产生包含能够增殖和分泌抗体的RSV特异性抗体产生细胞的细胞培养物。在一个实施方式中，使用RSV特异性记忆B细胞，以产生离体B细胞培养物。所述记忆B细胞优选是人细胞，以便产生人抗体。所述B细胞优选来源于个体，所述个体之前接触过呼吸道合胞病毒。在一个实施方式中，利用本领域已知方法由外周血样品和/或扁桃体样品分离RSV特异性B细胞。例如，通过选择(磁珠分选)B细胞标记物CD19和/或CD22和(随后)选择细胞表面IgG和/或CD27和/或负选择IgM、IgD和/或IgA，分离记忆B细胞。在生发中心B细胞中，BCL6表达水平高，而Blimp-1表达水平低。抗体分泌细胞的自然发育包括Blimp-1表达上调。由于Blimp-1抑制BCL6表达，所以在天然情况下Blimp-1上调导致BCL6下调。在本发明的一个优选实施方式中，Blimp-1表达上调，而BCL6表达至少部分维持。这导致产生共同表达BCL6和Blimp-1的RSV特异性抗体产生细胞。所述RSV特异性抗体产生细胞能够增殖和分泌抗-RSV抗体，因此适用于离体B细胞培养。在另一优选实施方式中，通过Bcl-xL保护所述抗体产生细胞不发生凋亡。本发明RSV特异性抗体产生细胞提供长时间保持稳定并且不发生终末分化的优点。本发明所述的抗体产生细胞稳定至少一周，优选至少一个月，更优选至少三个月，最优选至少六个月。优选在CD40L存在下培养本发明B细胞，因为CD40L有利于大部分B细胞的增殖。在一个实施方式中，与生发中心B细胞相比，BCL6表达维持在基本相同或较高的水平，因为显著的BCL6表达以及Blimp-1表达产生具有优选的增殖和抗体产生特性和/或稳定性的抗体产生细胞。在优选实施方式中，所述BCL6表达和/或Blimp-1表达伴随着Bcl-xL表达，产生更优选的增殖和抗体产生特性和/或稳定性。
因此，一个实施方式提供一种产生RSV特异性抗体产生细胞的方法，所述细胞稳定至少一周，优选至少一个月，更优选至少三个月，更优选至少六个月，所述方法包括：
-提供RSV特异性记忆B细胞；
-提高所述细胞中Blimp-1的表达水平；和
-提高和/或维持所述细胞中的BCL6表达水平。
还提供一种产生RSV特异性抗体产生细胞的离体方法，所述方法包括提高RSV特异性记忆B细胞中Blimp-1的表达水平，以及提高和/或维持所述细胞中的BCL6表达水平。优选地，将所述BCL6和Blimp-1表达水平调节到和/或维持在与浆母细胞相比基本相同或较高的水平。在优选实施方式中，用BCL6和Bcl-xL转导所述B细胞。因此，还提供一种产生稳定至少三个月的RSV特异性抗体产生细胞的方法，所述方法包括：
-向能够产生RSV特异性抗体的B细胞提供BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物。
-向所述B细胞提供Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或类似物；和
-培养所述B细胞。
优选向所述B细胞提供编码BCL6或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列，以及编码Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列。
优选在能够增加Blimp-1表达的化合物，例如IL-21、IL-2、IL-6、Il-7、IL-10、IL-15、IL-27或突变的詹纳斯激酶存在下培养所述B细胞。优选使用IL-21，因为这种细胞因子特别适合用本发明方法增强Blimp-1表达和稳定抗体产生细胞。而且，为了提高转导效率，优选在用编码BCL6和/或Bcl-xL，或其功能性部分、衍生物和/或类似物的核酸序列转导所述B细胞之前，在IL-21存在下培养所述B细胞。
在一个实施方式中，向所述B细胞提供SOCS蛋白或其功能性部分、衍生物和/或类似物，或者编码它们的核酸，因为SOCS蛋白或其功能性部分、衍生物和/或类似物能够间接增强Blimp-1表达。在另一可选或额外的实施方式中，向所述B细胞提供E47或其功能性部分、衍生物和/或类似物，或者编码它们的核酸。如前所述，作为E47或其功能性部分、衍生物和/或类似物水平提高的结果，Socs蛋白功能增强，并且间接提高Blimp-1表达。
在实施例中记载了特别优选的实施方式。按照一个特别优选的实施方式，首先在IL-21存在下培养RSV特异性B细胞。接着，用编码BCL6的核酸和编码Bcl-xL的核酸对所述B细胞进行转导反应。优选使用离心转导(spin transduction)。最优选地，混合包含至少一种感兴趣核酸的B细胞和病毒，然后离心该混合物，以实现高转导效率。转导后，在不存在IL-21且存在IL-4和L-细胞的条件下培养B细胞3-5天，以便表达BCL6。接着，按照这个优选实施方式，再次用编码BCL6的核酸和编码Bcl-xL的核酸对所述B细胞进行转导反应。然后，再次在不存在IL-21且存在IL-4和L-细胞的条件下培养B细胞3-5天，以便表达BCL6。接着，分离表达BCL6和Bcl-xL的细胞，再次将IL-21给予该培养物，以增强增殖和抗体产生。优选筛选培养物上清液中Bcl-6、Blimp1和Bcl-XL表达细胞分泌的抗体在体外对RSV的中和能力/活性/反应性。优选通过，例如有限稀释培养进一步选择产生这些抗体的抗体产生细胞。由此获得稳定的同时表达BCL6和Blimp-1的RSV特异性B细胞。在体外培养的条件下，所述B细胞能够在至少六个月的期间增殖和产生抗体。
一个实施方式提供了一种本发明方法，该方法还包括选择和/或分离RSV-特异性抗体或其功能等同物。在一个实施方式中，选择和分离IgM产生细胞和IgG产生细胞。优选地，选择和/或分离IgG产生细胞。
用本发明方法产生的RSV-特异性抗体产生细胞适合产生抗RSV的抗体。然而，在一个优选实施方式中，由所述细胞中分离编码Ig重链和/或轻链的基因并在第二种细胞，例如中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系或293(T)细胞中表达。所述第二种细胞在本文中也称为生产者细胞，优选适合商业抗体生产。所述生产者细胞的增殖得到能够产生RSV-特异性抗体的生产者细胞系。优选地，所述生产者细胞系适合产生用于人的化合物。因此，所述生产者细胞系优选不含病原体，例如病原性微生物。
本发明方法优选用于产生稳定至少一周、优选至少一个月、更优选至少三个月、更优选至少六个月的抗体产生细胞，以便进行商业抗体生产。最优选地，产生了能够产生单克隆抗体的稳定细胞系。优选利用由(例如)样品分离的记忆B细胞，通过选择CD19和/或CD22(B细胞标记物)和细胞表面IgG和/或CD27(以标记记忆细胞)和/或通过对IgM、IgD和/或IgA进行负选择来进行此种操作。而且，利用RSV或源白RSV的组分，例如RSVF蛋白、G蛋白和/或SH蛋白，在结合试验中选择RSV特异性抗体产生细胞。随后，按照此种优选的实施方式，在所述RSV特异性抗体生产细胞中共同表达Blimp-1和BCL6，产生能够特异性结合RSV(的组分)的细胞的培养物。在另一优选实施方式中，还向所述B细胞提供Bcl-xL或其功能性部分、衍生物和/或类似物。
如果只使用一种记忆B细胞，则获得产生单克隆抗体的本发明细胞系。也可能从能够产生抗RSV抗体的B细胞得到能够生产单克隆抗体的细胞系。用本发明方法产生稳定的B细胞培养物后，分离能够产生抗RSV特异性抗原的抗体的B细胞，优选在第二种细胞系中表达来自所述B细胞的编码Ig重链和/或轻链的基因的至少功能性部分。优选地，在第二种细胞系中表达来自所述B细胞的Ig重链编码基因的至少功能性部分和Ig轻链编码基因的至少功能性部分。
在一个实施方式中，由曾经接触过RSV的个体获得的抗体产生细胞，优选但不一定是记忆B细胞可用于本发明方法。以此方式，可能离体产生感兴趣的人抗体。
因此，还提供一种产生能够特异性结合和/或中和呼吸道合胞病毒的抗体的方法，所述方法包括：
-利用本发明方法生产能够产生RSV特异性抗体的抗体产生细胞；和
-获得所述抗体产生细胞产生的抗体。
也提供可通过本发明方法获得的分离或重组的抗体，以及分离或重组的抗体产生细胞，或其功能等同物。所述抗体优选包括抗体D25、AM14、AM16和/或AM23，或其功能性部分、衍生物或类似物。
一旦获得本发明的RSV特异性抗体产生细胞后，优选人工分离和/或产生编码所述细胞的Ig轻链和/或重链的基因的至少功能性部分。在一个实施方式中，提供至少包含图11、图12、图14A、图14B和/或图14C所示核酸序列的功能性部分的核酸序列。所述功能性部分优选包含图11D、图12、图14A、图14B和/或图14C所示的至少一个核酸序列。所述功能性部分优选编码图11D、图12、图14A、图14B和/或图14C所示的至少一个CDR。
还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含与序列CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGATGGTCTCCTGCCAGGCCTCTGGAGGCCCCCTCAGAA、ACTATATTATCAAC、TGGCTACGACAGGCCCCTGGACAAGGCCCTGAGTGGATGGGA、GGGATCATTCCTGTCTTGGGTACAGTACACTACGCACCGAAGTTCCAGGGC、AGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACAGACACAGCCTACATCCATCTGATCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGACG、GAAACAGCTCTGGTTGTATCTACTACCTACCTACCACACTACTTTGACAAC、TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG和/或CAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAAGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGATGGTCTCCTGCCAGGCCTCTGGAGGCCCCCTCAGAAACTATATTATCAACTGGCTACGACAGGCCCCTGGACAAGGCCCTGAGTGGATGGGAGGGATCATTCCTGTCTTGGGTACAGTACACTACGCACCGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACAGACACAGCCTACATCCATCTGATCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCGACGGAAACAGCTCTGGTTGTATCTACTACCTACCTACCACACTACTTTGACAACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG的至少一部分至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的重链序列，所述部分具有至少15个核苷酸。所述重链序列优选源自抗体D25。所述重链序列优选包含与图11D所示序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的序列。本文也提供包含由任何上述重链序列构成的重链序列的分离、合成或重组的核酸序列。
还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含与序列GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAGCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGC、CAGGCGAGTCAGGACATTGTCAACTATTTAAAT、TGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTAC、GTTGCATCCAATTTGGAGACA、GGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTAGTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACATATTATTGT、CAACAATATGATAATCTCCCA、CTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAAAGA和/或GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCAGCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTGTCAACTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGTTGCATCCAATTTGGAGACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTAGTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCAACATATTATTGTCAACAATATGATAATCTCCCACTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAAAGA的至少一部分至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的轻链序列，所述部分具有至少15个核苷酸。所述轻链序列优选源自抗体D25。
所述轻链序列优选包含与图11D所示序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的序列。本文也提供包含由任何上述轻链序列构成的重链序列的分离、合成或重组的核酸序列。
还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含与序列GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCT、GGATTCAGCTTCAGTCACTATGCC、ATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTT、ATATCTTATGATGGAGAAAATACA、TATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACAGTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTCTATATTACTGT、GCGAGAGACCGCATAGTGGACGACTACTACTACTACGGTATGGACGTC、TGGGGCCAAGGGGCCACGGTCACCGTCTCCTCAG和/或GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCAGCTTCAGTCACTATGCCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCTTATGATGGAGAAAATACATATTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACAGTGTCTCTGCAAATGAACAGCCTGAGACCTGAGGACACGGCTCTATATTACTGTGCGAGAGACCGCATAGTGGACGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGGCCACGGTCACCGTCTCCTCA的至少一部分至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的重链序列，所述部分具有至少15个核苷酸。所述重链序列优选源自抗体AM14。本文也提供包含由任何上述重链序列构成的重链序列的分离、合成或重组的核酸序列。
还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含与序列GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGT、CAGGACATTAAGAAGTAT、TTAAATTGGTATCATCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTGAGCTCCTGATGCAC、GATGCATCC、AATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGGGGATCTGGGACAGATTTTACTCTCACCATTAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGGAACATATTACTGT、CAACAGTATGATAATCTGCCTCCGCTCACT、TTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAAC和/或GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAAGAAGTATTTAAATTGGTATCATCAGAAACCAGGGAAAGTCCCTGAGCTCCTGATGCACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGGGGATCTGGGACAGATTTTACTCTCACCATTAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGGAACATATTACTGTCAACAGTATGATAATCTGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTG的至少一部分至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的轻链序列，所述部分具有至少15个核苷酸。所述轻链序列优选源自抗体AM14。本文也提供包含由任何上述轻链序列构成的重链序列的分离、合成或重组的核酸序列。
还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含与序列GAGGTGCAGCTGGTGGAGACCGGGGGAGGCCTGGCCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT、GGATTCACATTCAGTAGTTATAAC、ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACAC、ATTAGTGCGGGTAGTAGTTACATA、TACTACTCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGTCAGGAACTCAGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGCTGACACGGCTGTGTATTACTGT、GCGAGAGAGGATTATGGTCCGGGAAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGACCCC、TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG和/或GAGGTGCAGCTGGTGGAGACCGGGGGAGGCCTGGCCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACATTCAGTAGTTATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCACACATTAGTGCGGGTAGTAGTTACATATACTACTCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAACGTCAGGAACTCAGTATATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGCTGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGATTATGGTCCGGGAAATTATTATAGTCCTAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA的至少一部分至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的重链序列，所述部分具有至少15个核苷酸。所述重链序列优选源自抗体AM16。本文也提供包含由任何上述重链序列构成的重链序列的分离、合成或重组的核酸序列。
还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含与序列CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGAGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGC、AGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGAT、GTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTAT、GGCAACACT、AATCGGCCCTCAGGGGTCTCCGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGC、CACTCCTATGACAGAAGCCTGAGTGGT、TCAGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAG和/或CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGAGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCAACACTAATCGGCCCTCAGGGGTCTCCGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCACTCCTATGACAGAAGCCTGAGTGGTTCAGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTC的至少一部分至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的轻链序列，所述部分具有至少15个核苷酸。所述轻链序列优选源自抗体AM16。本文也提供包含由任何上述轻链序列构成的重链序列的分离、合成或重组的核酸序列。
还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含与序列CAGGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAAATGTGGTCAAGCCTGGGACGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCGACT、GGATTCAACTTCCATAACTACGGC、ATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTT、GTTTGGTATGATGGAAGTAAGAAA、TACTATGCAGACTCCGTGACGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTTTATTATTGT、GTGAGAGATAAAGTGGGACCGACTCCCTACTTTGACTCC、TGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTATCCTCAG和/或GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAAATGTGGTCAAGCCTGGGACGTCCCTGAGACTGTCCTGTGCAGCGACTGGATTCAACTTCCATAACTACGGCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTTGTTTGGTATGATGGAAGTAAGAAATACTATGCAGACTCCGTGACGGGCCGATTCGCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACTCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTTTATTATTGTGTGAGAGATAAAGTGGGACCGACTCCCTACTTTGACTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCGAGT的至少一部分至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的重链序列，所述部分具有至少15个核苷酸。所述重链序列优选源自抗体AM23。本文也提供包含由任何上述重链序列构成的重链序列的分离、合成或重组的核酸序列。
还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含与序列TCCTATGTGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCACTGGCCCCAGGAGGGACGGCCGCGATCACCTGTGGAAGAAAC、AACATTGGAAGTGAAACT、GTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTAT、GATGATGAC、GACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGT、CAGGTGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGTA、TTCGGCGGAGGGACCAAGTTGACCGTCCTAG和/或TCCTATGTGCTGACTCAGCCCCCCTCGGTGTCACTGGCCCCAGGAGGGACGGCCGCGATCACCTGTGGAAGAAACAACATTGGAAGTGAAACTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATGACGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAGGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGGAGTAATTATCATCAGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTC的至少一部分至少70％、优选至少80％、更优选至少90％同源的轻链序列，所述部分具有至少15个核苷酸。所述轻链序列优选源自抗体AM23。本文也提供包含由任何上述重链序列构成的重链序列的分离、合成或重组的核酸序列。
也提供编码与至少图11、图14A、图14B和/或图14C所示氨基酸序列的功能性部分至少70％、优选至少80％、更优选至少90％相同的氨基酸序列的核酸序列，所述部分具有至少5个氨基酸残基。所述核酸序列优选编码与图11D所示的重链CDR序列1、2和/或3和/或轻链CDR序列1或2至少80％相同的氨基酸序列。在另一优选实施方式中，所述核酸序列编码与图14A、图14B和/或图14C所示的至少一种CDR序列至少80％相同的氨基酸序列。在一个优选实施方式中，所述核酸序列编码与图11A所示重链序列、与图14A所示重链序列、与图11B所示重链序列、与图14C所示重链序列、与图11A所示轻链序列、与图14A所示轻链序列、与图14B所示轻链序列和/或与图14C所示轻链序列至少70％相同的氨基酸序列。
因此，还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含编码与图11A-D所示氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少85％相同的氨基酸序列的序列。所述核酸序列优选编码与图11A-D所示的重链CDR序列1、2和/或3和/或轻链CDR序列1或2至少80％相同的氨基酸序列。一个实施方式提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含编码与氨基酸序列NYIIN至少70％相同、和/或与序列GIIPVLGTVHYAPKFQG至少75％相同、和/或与序列ETALVVSTTYLPHYFDN至少70％相同、和/或与序列QASQDIVNYLN至少85％相同、和/或与序列VASNLET至少70％相同、和/或与序列QVQLVQSGAEVKKPGSSVMVSCQASGGPLRNYIINWLRQAPGQGPEWMGGIIPVLGTVHYAPKFQGRVTITADESTDTAYIHLISLRSEDTAMYYCATETALVVSTTYLPHYFDN WGQGTLVTVSS至少70％相同、和/或与序列DIQMTQSPSSLSAAVGDRVTITCQASQDIVNYLNWYQQKPGKAPKLLIYVASNLETGVPSRFSGSGSGTDFSLTISSLQPEDVATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIKRTV至少70％相同的氨基酸序列的序列。
本发明核酸序列优选与任何上述序列至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％同源。
还提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含编码与图14A-C所示氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少85％相同的氨基酸序列的序列。所述核酸序列优选编码与图14A、14B和/或14C所示CDR序列至少70％相同的氨基酸序列。一个实施方式提供一种分离、合成或重组的核酸序列，所述核酸序列包含编码以下氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列至少70％相同：GFSFSHYA、ISYDGENT、ARDRIVDDYYYYGMDV、QDIKKY、DAS、QQYDNLPPLT、EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSHYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGENTYYADSVKGRFSISRDNSKNTVSLQMNSLRPEDTALYYCARDRIVDDYYYYGMDVWGQGATVTVSS、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIKKYLNWYHQKPGKVPELLMHDASNLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDIGTYYCQQYDNLPPLTFGGGTKVEIKRTV、GFTFSSYN、ISAGSSYI、AREDYGPGNYYSPNWFDP、SSNIGAGYD、GNT、HSYDRSLSG、EVQLVETGGGLAQPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSHISAGSSYIYYSDSVKGRFTVSRDNVRNSVYLQMNSLRAADTAVYYCAREDYGPGNYYSPNWFDPWGQGTLVTVSS、QSVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVSDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCHSYDRSLSGSVFGGGTKLTV、GFNFHNYG、VWYDGSKK、VRDKVGPTPYFDS、NIGSET、DDD、QVWDRSNYHQV、EVQLVESGGNVVKPGTSLRLSCAATGFNFHNYGMNWVRQAPGKGLEWVAVVWYDGSKKYYADSVTGRFAISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDKVGPTPYFDSWGQGTLVTVSS和SYVLTQPPSVSLAPGGTAAITCGRNNIGSETVHWYQQKPGQAPVLVVYDDDDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDRSNYHQVFGGGTKLTV。
本发明核酸序列优选与任何上述序列至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％同源。
如上文所述，本发明核酸序列特别适合在核酸表达系统中表达本发明的抗体或其功能性部分、衍生物或类似物，优选D25、AM14、AM16、AM23或其功能性部分、衍生物和/或类似物。本发明核酸序列优选在细胞中表达，更优选在适合抗体生产的生产者细胞中表达。
在以下实施例中进一步解释本发明。这些实施例不限制本发明范围，仅仅用于阐述本发明。
实施例
材料和方法
维持和分离人B细胞
使用标准方法，从源自血液库的暗黄层分离CD19阳性人B细胞(其他来源可以是含有抗凝因子的新鲜血液，或者淋巴器官如扁桃体或脾脏)。简要说，利用菲可(ficoll)密度分离法(英国白金汉郡的安玛西亚公司(Amersham，Buckinghamshire，UK))分离总外周血单核细胞(PBMC)。通过生产商描述的MACS细胞分选技术(荷兰乌得勒支的密特异公司(Miltenyi，Utrecht，Netherlands))，利用CD22标记的珠正选择B细胞。随后利用CD19、CD27、IgD、IgM和IgA的单克隆抗体(mAb)(美国新泽西州富兰克林湖的BD公司(Becton Dickinson，BD，Franklin Lakes，NJ，USA))的适当组合对细胞染色。然后，用FACSAria(BD)分选CD19和CD27阳性且IgM、IgA和IgD阴性的记忆B细胞(图1)。除记忆B细胞外，可以用合适的标记物分离其他B细胞亚组，例如原始细胞、滤泡细胞、记忆细胞、抗体产生细胞、中心母细胞、中心细胞、生发中心细胞、浆母细胞、浆细胞、边缘区细胞、窦状隙周细胞或移行B细胞(这些亚组中许多亚组只在小鼠中测定过)。
细胞培养
洗涤分选的细胞，并在铺有经80格雷照射的表达CD40L的L细胞(5x104个细胞/毫升；由法国先林葆雅公司(Schering Plough France，DardillyFrance)的J.Banchereau博士提供)的24孔板上，使用完全培养基(含有8％胎牛血清(FCS)和青霉素/链霉素的伊可夫改良的D极限必需培养基(Iscove’s Modified D Minimal Essential Medium))培养(1.5-2x105个细胞/毫升)。除非另有说明，这些表达CD40L的L细胞总是用包含8％FCS的培养基培养。为了制备用于逆转录病毒转导的B细胞，在小鼠IL-21(50ng/ml，美国明尼苏达州密得兰明尼阿波利斯的R&D公司(R&D，Minneapolis，MN，USA))存在下培养细胞36小时。转导后，优选在IL-21存在下培养细胞，然而细胞对IL-4、IL-15和IL-10(不排除其他细胞因子)有响应。例如，IL-4诱导的B细胞扩增低于IL-21，在某些实验中可能需要较低的细胞分裂水平。
逆转录病毒构建物和重组逆转录病毒的产生
以前记载过STAT5a和b的组成型活性突变体。编码这些突变体和野生型STAT5b的DNA获自T.Kitamura(日本东京的IMSUT公司(IMSUT，Tokyo，Japan))。鼠成纤维细胞的衰老拯救筛选中，Bcl-6被鉴定为抗增殖p19ARF-p53信号转导的抑制剂。Bcl-XL被鉴定为抗凋亡因子，它由Korsmeyer博士(美国波士顿的HH医学研究所(Howard Hughes MedicalInstitute，Boston，US))友情提供。将这些DNA连接到以前记载的LZRS-接头-IRES-GFP(或IRES-YFP或IRES-NGFR)载体中(Heemskerk等，1997；Heemskerk等，1999)。也可使用IRES-YFP(黄色荧光蛋白)或IRES-NGFR(神经生长因子受体)替代IRES-GFP(绿色荧光蛋白)标记物。NGFR是NGFR的信号转导失能突变体，由C.Bonini博士友情提供。使用NGFR的单克隆抗体(美国加州芒廷维尤的克罗玛普公司(Chromaprobe，Mountain View，CA，US)或密特异公司(Miltenyi))观察表达NGFR的细胞。
为了产生重组逆转录病毒，使用Fugene-6(荷兰阿尔密耳的罗氏诊断荷兰公司(Roche Diagnostics Netherlands，Almere，Netherlands))，按照生产商方案，将逆转录病毒质粒转染到辅助性的无病毒兼嗜性生产者细胞系Phoenix-A中，该细胞系是人胚肾细胞系293的衍生物(Kinsella和Nolan，1996)(由加利福尼亚州帕洛阿尔托的斯坦福大学的G.Nolan博士(Dr.G.Nolan，Stanford University，Palo Alto，CA)友情馈赠)。两天后，通过加入2μg/ml嘌呤霉素(加利福尼亚州帕洛阿尔托的BD克隆泰克实验室公司(Becton Dickinson Clontech Laboratories))开始选择转染的细胞。转染后10-14天，将6x106细胞接种到一个10cm的皮氏培养皿中(马萨诸塞州贝德福德的BD发现实验室设备公司(Becton Dickinson Discovery Labware，Bedford，MA))，其中含有10ml不含嘌呤霉素的完全培养基。第二天，更换新鲜培养基，第三天，收获逆转录病毒上清液，离心并以无细胞等份试样形式冻存于-70℃。这种方法提供一种可重现的快速、大规模和高效价逆转录病毒生产方法，其产量超过3x106个感染性病毒颗粒/毫升。
逆转录病毒转导
如以前记载(Heemskerk等，1997；Heemskerk等，1999)进行重组人纤连蛋白片段CH-296转导方法(RetroNectinTM；日本大津的塔卡拉公司(Takara，Otsu，Japan))。用0.3ml 30μg/ml重组人纤连蛋白片段CH-296室温处理2小时或4℃处理过夜，以便包被非组织培养处理的24孔板(荷兰Badhoevedorp的克斯塔公司(Costar，Badhoevedorp，Netherlands))。使用不同大小的肺组织培养平板时，按比例使用试剂。取出CH-296溶液，然后在室温下与磷酸缓冲盐水(PBS)配制的2％人血清白蛋白(HSA)一起培育30分钟，然后用PBS洗涤一次。将为逆转录病毒转导制备的5x105个B细胞接种到不含FCS和L-细胞的0.25ml RPMI中，与0.25ml融化的逆转录病毒上清液混合。对于Bcl-6Bcl-XL双转导而言，混合125μl Bcl-6-IRES-NGFR(或IRES-YFP)(Shvarts A.等，Genes Dev.，2002)和125μl Bcl-XL-IRES-GFP(美国波士顿儿童医院的HH医学研究所(Howard Hughes Medical Institute，Childrens Hospital，Boston，USA)的S.Korsmeyer提供)，并加入细胞中。然后，该培养物以1800rpm、25℃离心60分钟，37℃培育6小时。接下来，取出0.25ml上清液，加入0.25ml新鲜的逆转录病毒上清液。该培养物再次以1800rpm、25℃离心60分钟，37℃培育过夜。第二天早晨，将细胞转移到24孔组织培养板(克斯塔公司(Costar))中，在存在人IL-4(50ng/ml)或小鼠IL-21(50ng/ml，美国明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D公司(R&D，Minneapolis，MN，USA))的正常条件下培养3-5天。通过截短的神经生长因子受体的信号转导失能突变体(ΔNGFR，由意大利米兰圣拉夫尔医院(St.Raphael Hospital，Milan，Italy)的C.Bonini提供)的抗体染色或GFP和/或YFP的(共)表达确定转导效率。选择含有感兴趣转基因的细胞进行进一步实验。
流式细胞术
将FITC、PE，PERCP，PE-Cy5，APC或APC-Cy7直接标记的人分子IgD、IgG、CD3、CD19、CD20、CD27、CD38、CD40、CD45、CD56、CD70、CD80、CD86、HLA-DR(BD)的抗体，以及用PE(DAKO)直接标记的IgM、κ轻链、λ轻链、CD138用于流式细胞术分析。用LSRII(BD)分析染色细胞，用FlowJo计算机软件(TS公司(Tree Star，Inc.))加工FACS数据。
增殖实验
由FACSAria上的新鲜PBMC分离原始和记忆B细胞：
原始B细胞：CD19-Pe-Cy7pos，CD27-APC neg，IgD-PE pos
记忆B细胞：CD19-Pe-Cy7pos、CD27-APC pos、IgD-PE neg、IgA-FITCneg
用PBS洗涤细胞，重悬于0.5ml不含FCS的RPMI(37℃)。将等量的含有2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯(CFSE)的IMDM加入细胞混合物中，37℃培育7分钟。用冰冷的FCS洗涤细胞，以终止细胞的标记。将细胞重悬于500μl IMDM-8％FCS，并在存在或不存在IL-21的情况下与L细胞一起培养。未标记细胞用作对照。
36小时后(刚好在转导前)，分析一部分细胞的CFSE含量。用Bcl-6-IRES-NGFR离心转导其余细胞，培养3天，用LSRII分析其CFSE含量。用FlowJo软件(TS公司)分析数据。
用高速单细胞分选分离抗原特异性人B细胞
除上述从MBC开始(即100个细胞/培养孔)的记忆B细胞分离法之外，也可用荧光标记的抗原培育人记忆B细胞并根据抗原识别进行分选。例子是分离结合藻红蛋白(PE)标记的破伤风类毒素的B细胞(由德国柏林的A.Radbruch(A.Radbruch，Berlin，Germany)提供)(图4)。以1个细胞/孔培养细胞，并检查TT结合。然而，可使用任何其他标记的抗原。
测定Bcl-6和Bcl-XL转导细胞的长期培养导致的B细胞受体(BCR)表达改变
已知在体外培养期间分化的B细胞中BCR的膜表达消失，在EBV转化的B细胞中也观察到这种现象。因此，对于用Bcl-6和Bcl-XL转导并在IL-21存在下培养的B细胞进行GFP、NGFR、CD19、κ和/或λ或IgG染色，或用标记的破伤风类毒素染色。为了证明BCR表达的有用性，我们用FACSAria(BD)以1个细胞/孔(96孔板)分选TT-PE(Radbruch)结合细胞，然后接种于含有L细胞和IL-21的培养基。三周后，用FACS Canto(BD)检测长出克隆的破伤风类毒素结合。至此，收获细胞并在96孔板中用GFP、NGFR、CD19和TT-PE染色。
开发分泌抗体的Bcl-6和Bcl-XL双阳性B细胞系
建立能产生单克隆抗体并且是100％Bcl-6和Bcl-XL双阳性的B细胞系。首先，用IL-21诱导增殖和分化来实现这一目的。同时，用Bcl-6-IRES-NGFR和Bcl-XL-IRES-GFP逆转录病毒转导这些细胞。在IL-4上维持这些细胞3-4天。随后，用其中一种或两种逆转录病毒转导的细胞表达该转基因，因而表达NGFR或GFP蛋白。可利用LSRII(BD)观察NGFR和/或GFP的表达。如果必要，可再次转导细胞，以获得更多数量的表达两种转基因的细胞。无论是否进行第二次转导，均用FACS Aria(BD)分选表达两种转基因的细胞，在存在IL-21和2500-5000L细胞/孔的条件下用96孔板进行培养，细胞密度范围为10-500个细胞/孔。到第5天，这些小批量培养物(MBC)在培养物上清液中分泌相当多的抗体，这些抗体随后可用于筛选目的。筛选可基于感兴趣抗原的可用技术，例如ELISA/EIA/RIA、Western印迹或直接功能实验，如中和细胞因子封闭实验。筛选和选择识别感兴趣抗原(在我们的实验中是TT和RSV)的MBC后，以0.5-1个细胞/孔的密度在存在IL-21的96孔板中亚克隆细胞。亚克隆通常进行2-3周，可通过有限稀释(LD)培养物或流式细胞术(FACSAria)单细胞分选进行。
RSV A-2病毒母液和HEp2细胞系
大量培养RSV A-2病毒(由乌得勒支WKZ(WKZ，Utrecht)的G.vanBleek友情提供)和HEp2细胞系(阿姆斯特丹AMC的临床实验室(ClinicalLaboratory，AMC，Amsterdam))，并冻存于液氮。
T175 Falcon培养瓶中，用正常培养基培养HEp2贴壁细胞系，然后冻存等份试样。
为了获得较高效价的RSV母液，接种HEp2细胞并培养达到50-60％铺满。在室温下利用45’将原始RSV母液(1/20稀释，总体积5ml)加到HEp2细胞上。加入15ml新鲜培养基，在打开瓶盖的情况下将细胞放入37℃、5％CO2，o/n。第二天早晨，小心去除培养物上清液，加入15ml含有1％FCS的培养基。旋紧瓶盖，将细胞放入37℃、5％CO2中孵育24-36小时。RSV诱导的合胞体清晰可见时，大部分合胞体仍然保持完成，收集培养基，过滤(0.22μm)，在室温下1450rpm离心，然后迅速冷冻样品并储存于液氮中。可通过立即加入含有1％FCS的新培养基并且在4-6小时后冷冻获得第二收集物。
用于ELISA的RSV裂解物
用RSV A-2感染HEp2细胞获得的病毒母液可用于分离RSV蛋白。用PBS小心洗涤第一个孔，并用胰蛋白酶消化。洗掉胰蛋白酶(吉布科公司(Gibco))，用1％辛基葡糖苷裂解细胞沉淀(一个T175培养瓶的细胞沉淀用2ml辛基葡糖苷处理)。用注射器和针头匀浆化悬液(上下10次)，在冰上培育1小时，然后在4℃用2L TBS缓冲液pH 7.4，o/n透析。离心除去细胞碎片后，获得上清液。测定蛋白质含量为3.6mg/ml，以20μg/ml(50μl)的浓度用于ELISA。
测定RSV母液的TCID50和PFU
为了测定TCID50，将104个HEp2接种于96孔板，用2或10步连续稀释的RSV病毒以4-plo感染HEp2。2-3天后，去除培养物上清液，在室温下用80％丙酮固定细胞10’。除去丙酮后，干燥固定的细胞层，保持4℃或冻存于-20℃。为了对RSV HEp2细胞染色，首先用PBS 0.1％吐温20配制的5％奶粉封闭平板。然后洗涤平板3次，接着在37℃与多克隆山羊抗-RSV-HRP(1∶500，美国缅因州索科的生物设计公司(Biodesign，Saco，ME，US))一起培育3-5小时，彻底洗涤。接下来，在室温下用AEC底物孵育该孔30’。感染的灶点染成红色，可通过光学显微镜肉眼观察并计数。使用标准Excel软件确定TCID50。
为了确定病毒的空斑形成单位(PFU)数值，在24孔板中，将1x105/mlHEp2细胞与用含1％FCS的培养液10倍连续稀释(10-3-10-7)的RSV病毒母液一起于37℃培育45’(200μl)，然后用0.5ml手温的0.25％海斑(seaplaque)琼脂(拜载酶公司(Biozyme))覆盖细胞和病毒。琼脂糖层能防止病毒通过培养基散播到未感染细胞上。由此，病毒只能感染相邻细胞，这些细胞最终被病毒杀死，在HEp2细胞单层中形成空斑。用1％结晶紫溶液对固定的细胞(96％乙醇-100％乙酸-10％甲醛6∶2∶1)染色，以观察这些空斑。对空斑进行计数(至少由两个不同个体进行计数)，确定PFU数值。
呼吸道合胞病毒(RSV)中和抗体的选择
为了获得抗-呼吸道合胞病毒(RSV)B细胞克隆，从源自血液库的暗黄层分离两位捐献者的外周血细胞(PBMC)(捐献者B62和B63)。用FACSAria(BD)分选CD19posIgMnegIgDnegIgAnegCD27pos细胞之前(图1)，用MACS珠和柱(密特异公司)分离CD22+细胞。细胞与L细胞一起培养，除非另有说明。在IL-21存在下培养细胞36小时，然后只用Bcl-6-IRES-NGFR转导。12小时后收集细胞，在IL-4存在下培养3天，然后用MACS珠(密特异公司)分选NGFR表达细胞并立即用Bcl-XL-IRES-GFP转导。洗涤不结合MACS珠的B细胞，并用Bcl-6和Bcl-XL同时转导。12小时后收集细胞，汇集并在IL-4存在下培养3天，然后在FACSAria上根据GFP和NGFR表达进行分选。洗涤细胞，并在IL-21存在下，以100细胞/孔的密度在96孔板(克斯塔公司(Costar))中培养。
利用感染RSV的HEp2细胞裂解物ELISA筛选Bcl-6和Bcl-XL双转导B细胞培养物的RSV结合情况，用RSV微量中和实验进行平行检测。简要说，将104个HEp2细胞接种于含有完全培养基的平底96孔板(克斯塔公司)。第二天，用37℃预孵育30分钟的RSV病毒和细胞培养物上清液的混合物在室温下替换培养基1小时。总体积为25μl，RSV终末浓度为0.1MOI。1小时后，用PBS将病毒上清液混合物稀释9倍，并用100μlIMDM/5％FCS替换。2天后，用80％丙酮固定细胞，并用多克隆抗-RSV-HRP(生物设计公司(Biodesign))染色。使用H2O2和AEC，感染RSV的细胞产生红色。使用光学显微镜观察感染的细胞，如果必要进行计数。使用山羊多克隆抗-RSV(马萨诸塞州剑桥(Cambridge，MA)的Abcam公司)作为RSV中和的对照。
VH和VL区的RT-PCR和克隆
用微量试剂盒(荷兰芬络的凯杰公司(Qiagen，Venlo，TheNetherlands))从约5x105个B细胞分离总RNA。在20μl含有1X第一链缓冲液、500μM dNTP、250ng随机六聚体、5mM DTT、40U RNasin(普洛麦格公司(Promega))和200U SuperScript III RT(英杰公司(Invitrogen))的体系中逆转录250ng总RNA。用超纯水将cDNA稀释10X，在50μl含有20mMTris-HCL、50mM KCL、2.5mM MgCl2、250μM dNTP、1U AmpliTaq金标DNA聚合酶(应用生物系统公司(Applied Biosystems Inc.))和25pmol各引物的溶液中对2.5μl cDNA进行PCR。PCR条件如下：96℃进行8分钟变性步骤，然后是35个下述循环：96℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟；最后是72℃延伸10分钟。
按照生产商推荐方案，在琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，纯化并克隆到pCR2.1TA克隆载体中。用BigDye终止子化学(应用生物系统公司)和Vector-NTI软件(英杰公司)进行序列分析。
为了排除逆转录酶和/或DNA聚合酶诱发的突变，进行若干项独立的cDNA转化和PCR反应，并进行单独克隆和序列分析。用Vector-NTI毗连群快车(Vector-NTI Contig Express)软件确定共有序列。
为了在293T细胞中表达重组蛋白质抗体，用pCDNA3.1(+)Zeo(英杰公司)产生全长重链和轻链构建物。通过PCR扩增克隆D25的重链先导序列和VH区，引入5’-NheI位点和3’-XhoI位点，从而构建重链表达载体。由同一种cDNA扩增IgG1恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)，同时引入5’-XhoI和3’-NotI位点。通过三点连入NheI/NotI消化的pCDNA3.1(+)Zeo获得全长重链表达载体。用引物通过PCR扩增轻链先导序列、VL区和轻链恒定区，引入5’-NheI和3’-NotI位点，从而产生全长轻链表达构建物。将后一产物克隆到NheI/NotI消化的pCDNA3.1(+)Zeo中获得全长轻链表达载体。
进行序列分析，以确认该表达构建物的正确性。
用重链和轻链表达载体对293T细胞进行瞬时双转染(Fugene-6，德国罗氏公司(Roche，Germany)或脂质转染试剂LTX(Lipofectamine LTX)，英杰公司)，从而获得重组单克隆抗体。用感染RSV的Hep2细胞的培养物上清液进行FACS染色(48小时)，以显示抗体与RSV F-蛋白的功能性结合。
用于PCR扩增的寡核苷酸是：
VH区：
VH1-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGG-3′
VH1B-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAGM-3′
VH2A-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGACACACTTTGCTMCAC-3′
VH2B-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAAC-3′
VH3-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC-3′
VH3B-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGARYTKKGRCTBHGC-3′
VH4-正向 5’-AAATCGATACCACCATGAAACACCTGTGGTTCTT-3′
VH5-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGGGTCAACCGCCATC-3′
VH6-正向 5’-AAATCGATACCACCATGTCTGTCTCCTTCCTC-3′
Cγ-反向 5′-GGGTCTAGACAGGCAGCCCAGGGCCGCTGTGC-3′
Vκ区：
Vk1-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGACATGAGGGTCCCY-3’
Vk1B-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGACATGAGRGTCCYY-3’
Vk2-正向 5’-AAATCGATACCACCATGAGGCTCCCTGCTCAG-3’
Vk3-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGAARCCCCAGCGCA-3’
Vk4-正向 5’-AAATCGATACCACCATGGTGTTGCAGACCCAG-3’
Ck-反向 5’-GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3’
Vλ区：
Vl1aecb 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGTCCCCTCTCCTCC-3’
Vl1g 5’-AAATCGATACCACCATGGCCGGCTTCCCTCTCCTCC-3’
Vl2/10 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCTGCTCCTCC-3’
Vl3jpah 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCGCTCTCCTGC-3’
Vl5/7 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACTCCTCTCCTTC-3’
Vl6/9 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCTCCTCTCCTTC-3’
Vl3rm 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATCCCTCTCCTCC-3’
Vl3l 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGACCCCTCTCTGGC-3’
Vl3e 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGCCACACTCCTGC-3’
Vl4c 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGGTCTCCTTCTACC-3’
Vl8a 5’-AAATCGATACCACCATGGCCTGGATGATGCTTCTCC-3’
Cl2/7 5’-GATCGCGGCCGCTTATCAWGARCATTCTGYAGGGGCCACTG-3’
用于构建表达载体的寡核苷酸是：
重链表达载体：
VH1-L-NheI： 5’-GCGGCTAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGG-3’
JH4/5-XhoI： 5’-GCGCTCGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3’
CHfw-XhoI： 5’-CGCGCTCGAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3’
CHrev-NotI：5’-GATCGCGGCCGCTTATCATTTACCCGGRGACAGGGAGAGGC-3’
轻链表达载体：
VK1-L-NheI： 5’-GCGGCTAGCCACCATGGACATGAGGGTCCCY-3’
CK-NotI：5’-GATCGCGGCCGCTTATCAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3’
EBV RT-PCR
为了检验强效增殖反应是否与EBV的存在相关，进行EBV RT-PCR。RT步骤如上所述。PCR条件如下：94℃7分钟变性步骤，然后是30个下述循环：94℃30秒，62℃(HPRT1)、52℃(LMP-1)和58℃(EBNA1/2)30秒，72℃30秒；最后在72℃延伸7分钟。用于RT-PCR的寡核苷酸如下：HPRT1正向(5`-TATGGACAGGACTGAACGTCTTGC-3`)和HPRT1反向(5’-GACACAAACATGATTCAAATCCCTGA-3`)；LMP-1正向：(5`-GCGACTCTGCTGGAAATGAT-3`)和LMP-1反向(5`-GACATGGTAATGCCTAGAAG-3`)；EBNA1/2正向(5`-AGCAAGAAGAGGAGGTGGTAAG-3`)和EBNA1/2反向(5`-GGCTCAAAGTGGTCTCTAATGC-3`)。
除RT-PCR外，我们还在用QIAmp分离试剂盒(凯杰公司)分离的细胞沉淀和上清液DNA上直接进行PCR。
实施例1
结果
B细胞表型
人记忆B细胞作为分离治疗性药物的平台的应用依赖于在相当长的时间内培养和测试这些细胞的能力。可以在实验室条件下培养和维持人B细胞，但维持时间不足以扩增、选择和克隆针对感兴趣抗原的单个B细胞系。我们根据对人B细胞的遗传修饰开发永生化技术。我们研究了STAT5的下游靶点。一个靶点是Bcl-6。Bcl-6能抑制B细胞向增殖受阻的浆细胞分化。Bcl-6的过度表达保持与BLIMP1的平衡，BLIMP1是用IL-21刺激B细胞能强效增强其表达(通过STAT3起效)的转录因子。就诱导Ig产生细胞(CD20-CD38+)的发育而言BLIMP1是必需的，而Bcl-6可阻止这一过程(细胞保持CD20表达，所谓的生发中心表型)。
为了研究B细胞区域内某些细胞群可能的时滞(skewing)，刺激新鲜的记忆和原始人B细胞之前进行CFSE标记揭示出，所有细胞开始分裂，所有B细胞群被等同转导(图2)。显示了用Bcl-6转导并且在IL-21和IL-4存在下培养的记忆B细胞。在36小时时，原始B细胞的转导水平较低，分裂速度较慢，但再培养3天后，与记忆B细胞完全相同(数据未显示)。
接下来，我们证明Bcl-6，以及Bcl-XL(STAT5的抗凋亡下游靶点)、CD40L信号传导和IL-21存在下，能长时间(＞3个月)维持人IgG记忆B细胞的CD20+CD38dull表型(图3)。
此外，Bcl-6Bcl-XL B细胞的表型对应于活化B细胞(见表1，例如3TT+B细胞克隆的FACS染色)，因为这些细胞中CD80、CD86和HLA-DR高表达。
与IL-21和CD40L信号传导一起培养的三种不同Bcl-6Bcl-XL B细胞
克隆的测定
染色 结果 染色 结果
CD2 阴性 CD69 阴性
CD5 阴性 CD70 阳性
CD7 阴性 CD71 阳性
CD10 阳性 CD73 阴性
CD20 阳性 CD80 阳性/高
CD21 阳性 CD86 阳性
CD22 阳性 CD95 阳性/高
CD23 阴性/5％阳性 CD126 阴性
CD24 阴性 CD132(共同γ) 阳性
CD25 阳性 CD138 阴性/2％阳性
CD27 阴性/低 CD154(CD40L) 8％阳性
CD28 阴性 ICOSL 阳性
CD30 阳性(56-74％) IgM 阴性
CD38 阳性/中等 IgG 阳性
CD40 阳性 HLA-DR 阳性(高)
CD44 阳性 κ 阳性/阴性
CD45 阳性 λ 阳性/阴性
CD45RA 阳性/高 IL21-R 阳性
抗体膜表达
经抗原结合或κ和λ染色测定，Bcl-6Bcl-XL转导的EBV阴性细胞保持BCR表达阳性(图3和4)。因此，这类细胞特别适合在长期培养后分离和/或筛选所需的特异性，例如利用标记抗原进行筛选，因为这类细胞将通过其BCR结合所述标记抗原。用FACSAria对结合PE标记的TT的Bcl-6和Bcl-XL双转导B细胞进行单细胞分选，从而进行验证。三周后，在96孔板中用合适的标记物和TT-PE对单细胞分选的克隆进行染色，并用FACSCanto(BD)测定结合(图4)。结论是，在需要B细胞上存在B细胞受体的情况下，例如筛选实验中，优选用Bcl-6和Bcl-XL转导B细胞，而不用EBV感染。
细胞分裂和生长曲线
Bcl-6Bcl-XL转导的B细胞每天平均分裂0.6次。分裂速率因捐献者和培养物细胞密度而异(图5a)。抗-RSV克隆D25的分裂速率为每天0.47次(图5b)。可以低于1个细胞/96孔板培养细胞，用于克隆目的。
Bcl-6Bcl-XL B细胞的抗体分泌
Bcl-6Bcl-XL转导的B细胞平均分泌1μg/ml抗体，这足以供应临床前研究的需要量(图6)。令人惊讶的是，D25抗-RSV克隆产生的抗体是其他测试细胞系的三倍。
测定EBV含量
对与IL-21和CD40L信号传导一起培养的Bcl-6Bcl-XL细胞系的mRNA进行EBV RT-PCR。在用此种永生化技术获得的细胞系中，未曾检测到EBV基因转录物(数据未显示)。
选择步骤
由于生长和BCR表达的稳定性，这些细胞特别适合分离抗原特异性B细胞。它给予我们使用几种不同的选择和克隆方法的机会。一种是引入Bcl-6和Bcl-XL后通过标记的感兴趣抗原的FACS或磁珠分选立即获得抗原特异性细胞，从而提高产生多抗原特异性B细胞克隆的概率。另一种选择是以低细胞密度(如100细胞/孔)批量培养纯化的Bcl-6Bcl-XL转导的记忆(或任何其他)B细胞。可收集这些100细胞/孔培养物的上清液，并检测其特异性。发现100细胞/孔培养物能够识别抗原，然后通过有限稀释培养物进行亚克隆，获得单克隆细胞系。使用这两种方法，我们可分离到超过40个识别破伤风类毒素(TT)的B细胞克隆。因此，根据TT与BCR的结合用FACSAria选择这些克隆，或者通过ELISA筛选一系列培养物进行选择，直到分离到单个抗-TT单克隆细胞系(未显示)。
RSV中和抗体的选择
来自捐献者B63的25个100细胞/孔的培养物完全阻断RSV感染和复制。中和100细胞/孔培养物之一D10产生强效的抗-RSV抗体，我们通过有限稀释培养进行克隆。单克隆抗体之一D25用于后续研究。经市售ELISA(阿姆斯特丹伞奎公司(Sanquin，Amsterdam)，未显示)测定具有IgG1重链和κ轻链的单克隆抗体D25(图7)能非常有效地阻断RSV感染，其IC50值为0.5-1.5ng/ml(±10pM)，而临床所用的标准抗-RSV抗体(米迪缪尼公司开发的帕丽珠单抗)的IC50为0.453μg/ml(3.02nM)(H.Wu等，2005J.Mol.Biol.和A.Mejias等，2005 Antimicrob.Agents Chemother.)(图8)。
抗原识别
除中和实验外，还测定D25对感染RSV的HEp2细胞的结合。用常规病毒产生方案感染HEp2细胞。用胰蛋白酶消化感染RSV的HEp2细胞，并用25-50μl培养物上清液培育。洗涤细胞，用小鼠-抗-人IgG-PE(BD或杰克逊公司(Jackson))染色，以测定D25抗体与感染细胞的结合。r-BiopharmELISA对照抗体用作内标。图9a显示D25与感染RSV的完整HEp2细胞的结合。
由于RSV包膜(膜)蛋白包括两种蛋白质，即G蛋白和F蛋白，所以检测D25与用不具有RSV F或RSV G蛋白的假型的VSV病毒(John K Rose友情提供)感染细胞的结合。如图9b所示，D25强效结合于感染VSV-F蛋白的EL-4细胞。尝试研究D25与帕丽珠单抗识别的表位时，将感染VSV-F蛋白的EL-4细胞与用量递增的D25或帕丽珠单抗一起孵育。洗涤细胞，用3种小鼠-抗-RSV-F抗体(大科公司(Dako))的混合物染色。与小鼠-抗RSV-F抗体竞争性结合感染的VSV-F细胞的帕丽珠单抗相反，D25结合未受影响(数据未显示)。
图9c显示帕丽珠单抗(Synagis)和D25以浓度依赖方式结合于感染的HEp2细胞。由于这两种抗体均以1∶1结合其靶蛋白，所以与感染的HEp2细胞的结合没有差异。
RSV抗原结合与中和克隆的频率
我们计算，对捐献者B63而言结合RSV的抗原特异性记忆B细胞的频率为17％，中和RSV的抗原特异性细胞的频率为6％。D25结合的构象表位不同于帕丽珠单抗识别的表位。这点可以从图10看出，其中D25不结合包被在ELISA平板上的裂解的RSV感染细胞裂解物递呈的变性线性表位，而帕丽珠单抗结合于变性(F)蛋白。
抗体片段的分离和纯化
我们能够从若干B细胞系，包括高RSV中和克隆D25获得高达500ml的体积。这些培养物上清液含有至少2μg/ml，因此，我们应该能够获得足够的纯化抗体，以进行临床前(动物)研究。用蒙太奇(Montage)抗原纯化试剂盒(美国马萨诸塞州比尔里卡的密理博公司(Millipore，Billerica，MA，USA))和HiTrap蛋白质A HP柱(比利时代根的GE健康护理公司(GEHealthcare，Diegem，Belgium))进行纯化。
此外，通过Lipofectamine LTX(英杰公司)，利用在pCDA3.1蛋白质表达载体中亚克隆的D25的重链和轻链转染293T细胞。上清液中的IgG含量约为22μg/ml(总体积50ml)。克隆的D25B细胞系表达抗体的核苷酸序列产生的此种抗体也识别感染的HEp2细胞(数据未显示)。
抗体序列
图11a显示B63D10-D25克隆的重链和轻链核苷酸和氨基酸序列。使用标准的RT-PCR和抗体特异性引物，测定重链(Vh1-69)和轻链(VkIO8/O18)序列。使用TOPO载体克隆全部抗体序列，序列控制后，亚克隆到pCDNA3.1哺乳动物蛋白表达载体(英杰公司)中。图11b和11c描述了该克隆的VH和VL4链，星号表示与在亲和成熟和进一步B细胞选择期间必然出现的与Vh1-69种系序列相比的突变。
总之，我们显示了利用转基因Bcl-6和Bcl-XL对人记忆B细胞进行分离、表征和长期培养。它们是我们分离具有独特特性的抗体，例如抗-RSV单克隆抗体B63D10-B25所必需的工具。由于B细胞来自人来源，所以它们不难被开发成治疗性药物。
实施例2
如前所述(p44‘抗体序列’)，将D25重链和轻链克隆到标准表达载体中。为了产生能够最大程度表达蛋白质的表达构建物，由GENEART(德国雷根斯堡(Regensburg，Germany))对D25重链和轻链序列进行密码子优化。在这种方法中，产生额外的限制性位点，以简化将来的克隆步骤，但最重要的是，优化翻译成氨基酸序列的核苷酸密码子，以便最大程度翻译成蛋白质。因此，优化了核苷酸序列但氨基酸序列保持不变。实施例4显示了源自纯化的B细胞上清液的D25、重组D25和GENEART优化的D25的中和能力。它们都能有效中和RSV。
与原始D25序列相比，GENEART所作的修饰见图12。
实施例3
进行了体外RSV中和实验后，我们在体内模型中检测了D25单克隆抗体。曾记载用于体内抗RSV测试的模型是BALB/c小鼠和棉鼠(Sigmodon hispidus)(Mejias A等，Antimicrobial Agents and chemotherapy 2004；第1811页，JohnsonS等，JID 1997；第1215页和Wu H等，JMB 2007：第652页)。很明显，BALB/c小鼠模型是最弱的模型，但由于棉鼠难以获得和饲养，我们首先在BALB/c小鼠中建立D25测试。
方案：BALB/c中的RSV特异性抗体，5天
实验设计：
第-1天.I.P.注射100μl抗体
第0天.I.N感染1x107pfu RSV A2(50μl)
第1-5天，检查小鼠的总体健康状况并称重
第5天，尸解，收集BAL、血液和肺
通过静脉穿刺抽血
通过气管收集2.0ml BAL
收集肺
立即对BAL材料(1ml)开始TCID50。
将1ml BAL材料(ELISA细胞因子/RT-PCR)冷冻于-80C
对制备的肺材料(1ml)进行TCID50
将1ml肺材料(ELISA细胞因子/RT-PCR)冷冻于-80C
收集/离心血液，对血清进行hIgG ELISA，储存于-80C
结果见图13：
(A)通过鼻喷雾进行RSV刺激(1x107 RSV-A2颗粒)前一天，对动物IP注射不同量的Synagis(米迪缪尼公司)、纯化D25或IgG1对照抗体(优莱卡公司(Eureka))(表3)。(图13B)从第5天起测定小鼠血清中的人IgG水平，抗体血清水平在5天中下降；表4显示半衰期概述。图13D描述第5天治疗和未治疗动物的肺灌洗液(BAL)中的病毒效价，而图13E描述治疗和未治疗小鼠的外周血中T和B细胞数量。图13F显示未治疗和治疗动物的肺和支气管浸润(通常主要是嗜曙红细胞)的组织切片。
结论/结果：
根据(线性)计算估计D25半衰期是5-9天：在第0天注射60和30μg抗体(分别为2和1mg/kg)，在第5天检测到33或16μg(小鼠的总体积1,5)。以第0天每只动物注射0,5mg/kg开始时，在第5天Ig水平从15μg下降到11μg，这表明半衰期为9天(表4)。
表4
TCID50实验测定的病毒效价表明，在对照动物中可检测到1x104PFU，而在Synagis(2mg/kg)或D25(2、1和0,5mg/kg)治疗的动物中检测不到病毒。
用Synagis或D25治疗的动物维持较高的外周血CD4T细胞和B220B细胞百分数。Synagis(2mg/kg)治疗的动物的％CD4T细胞低于D25治疗的动物。虽然这可能并不显著，但需要注意的是，与对照治疗动物相比用低剂量D25(1和0,5mg/kg)治疗的动物能保持高水平的B和T细胞。
虽然组织学数据(图13F)不是定量数据，但能够看出与对照相比Synagis和D25降低了免疫细胞向肺内和支气管周围的内流。比较D25和Synagis时，D25治疗的动物中细胞浸润到肺内和支气管周围的情况较少。
为了在棉鼠中检测D25，在NVI(荷兰比多芬(Bilthoven，Netherlands))建立实验来比较在RSV-X病毒刺激前用Synagis和D25预治疗的动物。
实施例4
除B63-D10-D25以外，我们由同一捐献者(B63)分离到三种新的强效RSV中和抗体(AM14、AM16和AM23)。将最初根据RSV中和选择并冻存于液氮的100细胞/孔批量B细胞培养物解冻，检测培养物上清液对感染RSV的HEp2细胞的结合。我们检测与感染的Hep2细胞的结合，因为它是抗体识别天然寡聚RSV膜蛋白如F和G蛋白的标记物，并可用作中和的良好预测指标。检测结合时，对细胞进行单细胞培养，筛选结合以获得克隆。将所有三种抗体克隆到最初为D25构建的GENEART载体中。此外，诸如D25等抗体都能识别RSV-F蛋白(未显示)。在293T细胞中克隆和表达后，纯化重组蛋白(核苷酸和氨基酸序列见图14A、B和C)。在Vero和HEp2细胞上检测抗体对几种主要RSV分离物的中和(图15)。所有三种抗体均为IgG1同种型。AM14具有κ轻链，而AM16和AM23具有λ轻链。所有三种抗体如D25在其抗体可变区中均含有体细胞高度突变，这提示它们在体内的生发中心反应期间已经历亲和成熟，这是产生独特抗体序列的过程。
结果见图15-I和15-II：用源自纯化的B细胞系上清液的D25(sD25)、重组纯化的D25(rD25)、重组GENEART密码子优化的D25(rD25GA)、AM14、AM16、AM23(均为纯化的重组蛋白)和Synagis进行RS病毒中和实验。在两种不同细胞系(图15-I)Vero和(图15-II)Hep2细胞上，用不同抗体检测病毒的抗体中和能力：A2(A)、X(B)和2006/1(C)是RSV亚型A，而病毒Z(D)和2007-2(E)是亚型B。将100TCID50的每种病毒加入用DMEM/1％FCS连续稀释的抗体溶液中，37℃培育1小时，然后加入100ul Vero或HEp2细胞(1x106/ml)。不洗掉病毒抗体混合物。三天后，去除上清液，在室温下用80％丙酮固定细胞10’。除去丙酮后，干燥固定的细胞层，保持4℃或冻存于-20℃。为了对感染RSV的HEp2细胞染色，先用PBS 0.1％吐温20配制的5％奶粉封闭平板，然后洗涤平板3次，接着在37℃与多克隆山羊抗RSV-HRP(1∶500，美国缅因州索科的生物设计公司)一起培育3-5小时，充分洗涤。接下来，在室温下用AEC底物孵育所有孔30’。感染的灶点染成红色，可通过光学显微镜肉眼观察并计数。
结果/结论
所有抗体都能中和RSV A和B毒株(表5)。通常，不同D25抗体能有效中和RSV病毒，但可观察到较小的实验间差异。AM14与D25效力相同，而AM16与Synagis效力相同。然而，AM23能非常有效地中和RSV A毒株，但它中和RSV B毒株的效力较差，但仍与Synagis相当。
表5IC50值(ng/ml)
在Vero或HEp2细胞上每种抗体对RS病毒亚型A的IC50值计算为对三种病毒株(A2、X和2006-1)的平均50％中和值。在Vero或HEp2细胞上每种抗体对RS病毒亚型B的IC50值计算为对两种病毒株(2007-2和Z)的平均50％中和值。一式三份地进行各中和实验，并重复两次(也显示在图15A和B中)。
sD25＝纯化B细胞产生的培养物上清液
rD25＝纯化的重组D25
rD25 GA＝293T细胞上清液和GENEART密码子优化的重组D25
实施例5
抗-RSV抗体的协同和阻断作用
为了分析D25、Synagis或新AM抗体组是否互相干扰对RSV F蛋白的识别，我们用浓度递增的未标记抗体预先孵育感染RSV的HEp2细胞，直到它们达到最大结合平台。我们为每种抗体确定平台期，在平台期Ig量增加时结合不再增加。(未显示)。洗涤后，将样品与标准剂量(3pmol)的PE标记的D25或APC标记的Synagis一起孵育。该剂量也达到最大结合。
结果
如图16所示，用未标记的Synagis或D25预孵育感染RSV的HEp2细胞时，标记的Synagis和D25与这些细胞的结合水平降低。而且，Synagis能略微降低AM16诱导的结合。D25结合被AM23强烈阻断，但相反的是，用AM14预孵育后强烈增强D25结合。这表明D25识别的表位通常未完全暴露，但AM14与其天然表位结合后增强其暴露。这证明这两种抗体可一起发挥作用并增强中和作用。
附图简要说明
图1
人IgG阳性记忆B细胞的分离。利用菲可密度分离法(安玛西亚公司)从暗黄层分离的PBMC与抗-CD22磁珠一起孵育，然后用MACS柱(密特异公司)分离。然后，将CD22阳性细胞与人CD19、CD27、IgM、IgD和IgA的抗体(BD)一起孵育。用高速单细胞分选技术(FACSAria，BD)分选呈IgM、IgD、IgA阴性和CD19、CD27阳性的细胞。
图2
CFSE染色。分离新鲜人记忆B细胞，用CSFE标记，用IL-21刺激36小时，然后用Bcl-6-IRES-NGFR转导。细胞与IL-21再共同孵育3天，然后测定CFSE含量。每次细胞分裂时稀释CFSE染料。
图3
用Bcl-6和Bcl-XL或只用Bcl-XL转导的人B细胞的例子。在经辐射的表达CD40L和细胞因子IL-21的L细胞上维持细胞。左图显示通过κ和λ染色测定的BCR表达(93％的κλ阳性细胞为IgG同种型，未显示)。右图的X轴表示CD38表达，Y轴表示CD20表达。CD38dullCD20+染色表明是记忆或生发中心B细胞；CD38+CD20-染色表明是浆母细胞。
图4
永生化的抗原特异性人B细胞的分离。如图1所示分离人记忆B细胞，随后用Bcl-6-IRES-NGFR和Bcl-XL-IRES-GFP转导。用FACSAria分离表达NGFR、GFP并能结合PE-标记的破伤风毒素的细胞。在96孔平底培养板中，在经辐射的L细胞和IL-21存在下对细胞进行单细胞培养，然后利用FACS Canto(BD)根据TT-PE结合进行选择。
图5
6XL B细胞克隆的累积细胞生长和分裂速率。在IL-21和经辐射的L细胞的存在下培养来自(A)两个抗-TT克隆和(B)一个抗-RSV克隆(B63D10-D25)的B细胞。
图6
用1,0ml含有8％FCS和青/链霉素的IMDM，以200,000细胞/24孔板开始培养新鲜培养物。所用FCS为正常(海克隆公司(HyClone))或超低牛IgGFCS(吉布科公司(Gibco))。3天后，更换培养物上清液，将细胞数量调整到200,000细胞/毫升。显示了在3个连续时间点上测量的3天内的平均IgG产量，没有显著性差异(p值为0.2)。
图7
为了确定D25抗-RSV克隆的轻链表型，用κ-藻红蛋白或λ-藻红蛋白(BD)抗体对D25B细胞系染色。只有κ-藻红蛋白抗体结合该细胞系，表明该抗体具有κ轻链。
图8
用Bcl-6Bcl-XL阳性人记忆B细胞培养来自捐献者B63的100细胞/孔培养物。其中一个培养物D10显示出强烈的中和作用。制备源自LD的单克隆细胞系，一个D25有效中和RSV A-2病毒。这里显示了D25与帕丽珠单抗(synagis)和多克隆山羊抗-RSV的比较。未显示用IL-21和CD40L信号传导培养的Bcl6Bcl-XL转导的B细胞克隆的无关培养物上清液，它能产生高水平抗体，但不阻断RSV感染。将D25克隆用于进一步表征。
图9
在图9a中：以10-12e6细胞/T175培养瓶(Nunc)的密度，用IMDM/5％FCS接种HEp2细胞。第二天，用5ml含RSV病毒(1.0MOI)的培养基替换培养基，室温培育45’，然后加入20ml新鲜培养基，37℃o/n培养细胞。第三天，用IMDM/1％FCS替换培养基，盖紧盖子37℃o/n培养。第四天，用PBS洗涤细胞并用胰蛋白酶处理。为了染色感染的细胞，用培养物上清液进行初步孵育。用抗人IgG-PE(BD)进行第二次孵育。用LSRII(BD)分析细胞。作为阳性对照，使用市售ELISA试剂盒(r-Biopharm)的阳性对照。
在图9b中：用具有RSV F或G蛋白假型的VSV病毒(John Rose友情提供)感染EL-4细胞，并用D25培养物上清液培育。洗涤细胞，用抗-人IgG-PE(杰克逊公司)培育，以测定D25与感染细胞的结合。只检测到D25与具有RSV F蛋白假型的VSV病毒感染细胞的结合。
图9c显示帕丽珠单抗(Synagis)和D25以浓度依赖方式结合于感染的HEp2细胞。显示的是平均荧光强度(MFI)。
图10
多克隆山羊抗-RSV(阳性对照)、帕丽珠单抗(synagis)和D25与包被的HEp2感染细胞裂解物的结合。
图11
D25克隆的序列分析。11a显示重链和轻链可变区的核苷酸和预测的氨基酸序列。11b/c显示与预测种系相比D25重链和轻链序列。星号表示可能在选择和B细胞克隆的体内亲和成熟过程中发生的突变。
图12
由BCL6BCL-xL转导的B细胞系克隆和表达重组人抗体。已经在D25抗体有关内容中记载过这一过程(图11)。这里显示了与原始D25序列相比的GENEART核苷酸修饰，需要注意这些突变不改变D25抗体的氨基酸组成。
图13
用源自纯化的B细胞上清液的D25和Synagis刺激BALB/c小鼠。(A)通过鼻喷雾进行RSV刺激(1x107RSV-A2颗粒)前一天，对动物IP注射不同量的Synagis(米迪缪尼公司)、纯化D25或IgG1对照抗体(优莱卡公司(Eureka))(表3)。(B)从第5天起测定小鼠血清中的人IgG水平，抗体血清水平在5天中下降(C)；表4显示半衰期概述。图13D描述第5天治疗和未治疗动物的肺灌洗液(BAL)中的病毒效价，而图13E描述治疗和未治疗小鼠的外周血中T和B细胞数量。(F)显示未治疗和治疗动物的肺和支气管浸润(通常主要是嗜曙红细胞)的组织切片。
图14
三种新的强效RSV中和抗体(A)AM14、(B)AM16和(C)AM23的核苷酸和氨基酸序列。
图15
用源自纯化的B细胞系上清液的D25(sD25)、重组纯化的D25(rD25)、重组GENEART密码子优化的D25(rD25GA)、AM14、AM16、AM23(均为纯化的重组蛋白)和Synagis进行RS病毒中和实验。在两种不同细胞系(图15-I)Vero和(图15-II)Hep2细胞上，用不同抗体检测病毒的抗体中和能力：A2(A)、X(B)和2006/1(C)是RSV亚型A，而病毒Z(D)和2007-2(E)是亚型B。将100TCID50的每种病毒加入用DMEM/1％FCS连续稀释的抗体溶液中，37℃培育1小时，然后加入100ul Vero或HEp2细胞(1x106/ml)。
图16
固定量(3pmol)的APC标记的Synagis和PE标记的rD25与感染RSV的HEp2细胞的相对结合，HEp2细胞用浓度递增的所示未标记抗体预孵育。
参考文献
Banchereau，J.，de Paoli，P.，Valle，A.，Garcia，E.，Rousset，F.，(1991).“依赖白介素4和CD40抗体的长期人B细胞系”(Long term humanB cell lines dependent on interleukin-4 and antibody to CD40)，Science 251，70-2。
Boise，L.H.，M.Gonzalez-Garcia，C.E.Postema，L.Ding，T.Lindsten，L.A.Turka，X.Mao，G.Nunez和C.B.Thompson.(1993).“Bcl-x，用作凋亡性细胞死亡的主要调节物的bcl-2相关基因”(Bcl-x，a bcl-2-related genethat functions as a dominant regulator of apoptotic cell death).Cell 74：597。
Dadgostar，H.，Zarnegar，B.，Hoffmann，A.，Qin，X.F.，Truong，U.，Rao，G.，Baltimore，D.和Cheng，G.(2002).“在B淋巴细胞中多种信号途径在CD40调节的基因表达中的合作”(Cooperation of multiplesignaling pathways in CD40-regulated gene expression in B lymphocytes).Proc.Natl.Acad.Sci USA 99，1497-1502。
Heemskerk等，1997：J.Exp.Med.第186卷，第1597-1602页。
Heemskerk等，1999：Cell Immunol.第195卷，第10-17页。
Kinsella和Nolan，1996：Hum.Gene Ther.第7卷，第1405-1413页。
Malisan，F.，Briere，F.，Bridon，J.M.，Harindranath，N.，Mills，F.C.，Max，E.E.，Banchereau，J.，Martinez-Valdez，H.(1996).“在CD40活化的天然人B细胞中白介素10诱导免疫球蛋白G同种型转换重组”(Interleukin-10 induces immunoglobulin G isotype switch recombination inhuman CD40-activated naive B lymphocytes)，J.Exp.Med.183，937-47。
Mathas S，Janz M，Hummel F，Hummel M，Wollert-Wulf B，Lusatis S，Anagnostopoulos I，Lietz A，Sigvardsson M，Jundt F，Johrens K，BommertK，Stein H，Dorken B(2006).“HLH蛋白ABF-1和Id2固有地抑制转录因子E2A介导霍奇金淋巴瘤中肿瘤B细胞的重编程”(Intrinsic inhibition oftranscription factor E2A by HLH proteins ABF-1 and Id2 mediatesreprogramming of neoplastic B cells in Hodgkin lymphoma).Nat Immunol.7，207-215。
Mejias A等，《抗微生物剂和化疗》(Antimicrobial Agents andchemotherapy)2004；1811页，Johnson S等，JID 1997；1215页。
Wu H等，JMB 2007：652页。
Shvarts A.等，2002：Genes Dev.第16卷，第681-686页。
Traggiai，E.，Becker，S.，Subbarao，K.，Kolesnikova，L.，Uematsu，Y.，Gismondo，M.R.，Murphy，B.R.，Rappuoli，R.，Lanzavecchia，A.(2004).“从记忆B细胞制备人单克隆抗体的有效方法：有效中和SARS冠状病毒”(An efficient method to make human monoclonal antibodies from memoryB cells：potent neutralization of SARS coronavirus).Nature Medicine第10卷，第8期，871-875。
Ye，B.H.，Cattoretti，G.，Shen，Q.，Zhang，J.，Hawe，N.，de Waard，R.，Leung，C.，Nouri-Shirazi，M.，Orazi，A.，Chaganti，R.S.等(1997).“BCL-6原癌基因控制生发中心形成和Th2型炎症”(The BCL-6 proto-oncogenecontrols germinal-centre formation and Th2-type inflammation).Nat Genet 16，161-170。