具有高产D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶L20A及其突变方法 【技术领域】
本发明涉及一种具有高产D-塔格糖能力的L-阿拉伯糖异构酶的突变体酶及其突变方法，以及利用该突变体酶生产D-塔格糖的技术，属于生物工程、基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂。D-塔格糖属于天然稀有糖的一种，在许多食品中都发现少量存在，如高温灭菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶制品等。2000年美国食品与药物管理局(FDA)确定D-塔格糖为普遍公认安全食品(GRAS)，并正式批准作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中；随后联合国粮农组织和世界卫生组织的联合食品添加剂委员会第57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂；欧盟也于2003年批准D-塔格糖在欧洲上市。
目前，国内对于D-塔格糖生产的研究还处于起步阶段，国外对其研究已较为深入，方法主要有两种：化学法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化学法生产的。由于一方面化学法生产存在许多不利因素，如化学污染物多，碱性条件下异构化反应副产物多，分离困难等；另一方面由于消费者消费观念的转变，天然食品的需求日益增长，因此近年来对D-塔格糖生产的研究集中在生物法上。
研究发现L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4，缩写为L-AI)可以催化D-半乳糖转化为D-塔格糖，是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。但是L-AI是一种非专一性酶，它可以分别催化L-阿拉伯糖和D-半乳糖为L-核酮糖和D-塔格糖。研究表明L-AI催化L-阿拉伯糖的效率明显高于D-半乳糖。本发明所使用的来源于(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-AI酶是一种高耐热性酶，具有工业应用前景。因此，进一步提高该酶催化D-半乳糖转化生产D-塔格糖的能力将赋予其更好的应用潜能。
【发明内容】
本发明的一个目的是：提供提高来源于解纤维热酸菌(Acidothermuscellulolytics)ATCC 43068的L-AI酶产D-塔格糖能力的方案。
本发明的另一个目的是：提出具有更高生产D-塔格糖能力的单突变体酶L20A，及其构建方法。
同时本发明还提供了一种利用该单突变体酶L20A生产D-塔格糖的方法。
本发明的技术方案：一种L-可拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A，将来源于解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolytics)ATCC 43068的L-阿拉伯糖异构酶L-AI酶(其基因序列详见Appl Microbiol Biotechnol DOI10.1007/s00253-009-2322-z)，进行突变所得的单突变体酶L20A；其为L-AI酶基因中第20位的亮氨酸Leu突变成了丙氨酸Ala，命名为L20A；它相比于野生型L-AI酶具有更高的产D-塔格糖的能力。
所述的L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A的制备方法，根据ATCC43068的L-AI酶基因序列，设计突变引物，对L-AI酶进行定点突变，测定DNA序列，鉴定出第20位Leu密码子突变成Ala密码子，并将其表达于大肠杆菌中，经诱导即得L-阿拉伯糖异构酶的单突变体酶L20A；步骤为：
(1)定点突变
利用重叠延伸PCR技术，以表达载体pET-22b(+)-araA为原始模版，经PCR1，PCR2及PCR3，引入L20A突变点，定点突变的引物为：
上游外侧引物：5’-TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3’，
下游外侧引物：5’-TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3’，
正向突变引物：5’-CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3’，下划线为突变碱基，
反向突变引物：5’-CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3’，下划线为突变碱基，
PCR1反应体系为：10×PCR buffer 5μL，2mM dNTP 4μL，10μM上游外侧引物1μL，10μM反向突变引物1μL，模版DNA 1μL，5U/mL taq plus 0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR2反应体系为：10×PCR buffer 5μL，2mM dNTP 4μL，10μM下游外侧引物1μL，10μM正向突变引物1μL，模版DNA 1μL，5U/mL taq plus 0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR1、PCR2扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min的35个循环；最后72℃保温10min；
PCR1、PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测，割胶回收纯化；
PCR3反应体系为：10×PCR buffer 10μL，2mM dNTP 8μL，10μM上游外侧引物1μL，10μL下游外侧引物1μL，PCR1纯化产物10μL，PCR2纯化产物10μL，5U/mL taq plus 1μL，加入双蒸水至100μL；
PCR3扩增条件为：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸5min；随后进行94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min的35个循环；最后72℃保温10min。
(2)突变体载体质粒的构建
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶NdeI和HindIII消化后连接至载体pET-22b(+)，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养，后提取突变质粒，将突变质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，突变质粒经测序鉴定为正确的突变；
(3)突变体的表达
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按2％接种量接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中；37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入0.4mM终浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，并在30℃继续振荡培养12h后，将发酵液于4℃、1000rpm离心10min收集菌体；
(4)单突变体酶的纯化
将步骤(3)收集的突变体菌体重悬于Tris-HCl缓冲液中，经超声波破碎后，于4℃、1000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清，经强阴离子交换柱Q-Sepharose进行初步纯化，随后收集活性部分再经分子筛Sephodex S200纯化，得到单突变体酶L20A的纯酶制品。
本发明的有益效果：本发明构建了一个有工业经济价值的单突变体酶L20A，实现了L-AI酶活力的提高，比野生型L-AI酶更有利于D-塔格糖的工业化生产。
【附图说明】
图1野生型L-AI酶和单突变体酶L20A地D-塔格糖转化图。▲表示野生型L-AI酶；■表示单突变体酶L20A。
【具体实施方式】
实施例1：本例说明单突变体酶L20A的制备。
(1)定点突变
利用重叠延伸PCR技术，以表达载体pET-22b(+)-araA为原始模版，经PCR1，PCR2及PCR3，引入L20A突变点，定点突变的引物为：
上游外侧引物：5’-TATATAAGCTTTCACCACGGCCGCGATGC-3’，
下游外侧引物：5’-TTATCCATATGACCGACCTGCCCTATCCG-3’，
正向突变引物：5’-CAGCATGCGTACGGCGAGGACGT-3’(下划线为突变碱基)
反向突变引物：5’-CGCCGTACGCATGCTGACTGC-3’(下划线为突变碱基)
PCR1反应体系为：10×PCR buffer 5μL，2mM dNTP 4μL，10μM上游外侧引物1μL，10μM反向突变引物1μL，模版DNA 1μL，5U/mL taq plus 0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR2反应体系为：10×PCR buffer 5μL，2mM dNTP 4μL，10μM下游外侧引物1μL，10μM正向突变引物1μL，模版DNA 1μL，5U/mL taq plus 0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR1、PCR2扩增条件为：94℃预变性4min；随后进行94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min的35个循环；最后72℃保温10min。
PCR1、PCR2扩增产物经琼脂糖电泳检测，并通过胶回收纯化。
PCR3反应体系为：10×PCR buffer 10μL，2mM dNTP 8μL，10μM上游外侧引物1μL，10μL下游外侧引物1μL，PCR1纯化产物10μL，PCR2纯化产物10μL，5U/mL taq plus 1μL，加入双蒸水至100μL。
PCR3扩增条件为：94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸5min；随后进行94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min的35个循环；最后72℃保温10min。
(2)突变体载体质粒的构建
经琼脂糖电泳胶回收纯化后的PCR3扩增产物经限制性内切酶NdeI和HindIII消化后连接至载体pET-22b(+)，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基培养过夜后，挑单克隆于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养，后提取突变质粒，将突变质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，突变质粒经测序鉴定为正确的突变。
(3)突变体的表达
挑取转入表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)的单克隆于含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按2％接种量接种至含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中；37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8时，加入0.4mM终浓度的IPTG进行诱导表达，并在30℃继续振荡培养12小时后，将发酵液于4℃、1000rpm离心10min收集菌体。
(4)突变体酶的纯化
将表达的突变体菌体重悬于Tris-HCl缓冲液中，经超声波破碎后，于4℃、1000rpm离心20min去除细胞碎片，收集上清，经强阴离子交换柱Q-Sepharose进行初步纯化，随后收集并浓缩活性部分再经分子筛Sephodex S200纯化，得到单突变体酶L20A的纯酶制品，经SDS-PAGE检测为单一条带。
实施例2：本例说明酶活分析。
1)酶活的测定方法：半胱氨酸-咔唑法测定L-AI的活力：取适当稀释的酶液20μL，加入装有980μL预先用50mM Tris-HCL(pH6.0)配置的50mM D-半乳糖溶液中，在75℃水浴中反应10min后，于冰上终止反应。取适当稀释的反应液50μL，加入950μL去离子水，加入200μL 1.5％的盐酸-半胱氨酸溶液，再加入6mL 75％的硫酸，混匀，然后加入200μL 0.12％的咔唑酒精溶液，立即混匀并于60℃水浴保温10min后冰浴终止反应，在560nm处测定吸光度。一个酶活单位的定义为在该条件下每分钟生成1μmol D-塔格糖所需的酶量。
2)酶活的比较：将突变体酶L20A的纯酶制品与野生型L-AI纯酶制品相比，可以发现：突变体酶L20A的产D-塔格糖的能力明显上升，其酶活为野生型的2.2倍；而其产L-核酮糖的能力，与野生型相比基本保持不变，说明该突变体酶L20A对催化生产D-塔格糖的底物专一性有明显改善作用。
实施例3：利用突变体酶L20A转化生产D-塔格糖。
在两份50mM Tris-HCl配置的终浓度为50mM的D-半乳糖溶液中，每份中分别加入一定量的野生型L-AI酶或突变体酶L20A，使反应体系中酶活为0.1U/mL，75℃水浴条件下进行转化反应，分别在1、2、4、6、8、10、12、24小时取样，煮沸10min灭酶，1000rpm离心10min，取上清后利用高效液相色谱(HPLC)测定生成的D-塔格糖含量。
HPLC进行产物分析的色谱条件为：Agilent 1200 HPLC色谱仪，色谱柱Shodex NH2P-504E，Shodex RI-101示差折光检测器，流动相为65％(V/V)乙腈水溶液，柱温35℃，流速1mL/min。
结果列于图1，突变体酶L20A与野生型L-AI相比，其催化速度显著提高，转化率提高了8％。突变体酶L20A反应1h，其转化率达50％；反应4h，转化率即达到最高61％；而野生型L-AI酶反应1h，其转化率只有20％；10h以后反应才达到平衡，最高转化率为53％。