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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810195429.9 (22)申请日 2018.03.09 (71)申请人 江西农业大学 地址 330045 江西省南昌市青山湖区经济 技术开发区 (72)发明人 周慧颖贺晓鹏贺浩华朱昌兰 彭小松傅军如陈小荣边建民 欧阳林娟胡丽芳 (74)专利代理机构 南昌洪达专利事务所 36111 代理人 张荣 (51)Int.Cl. C12P 19/04(2006.01) C12P 19/22(2006.01) C12P 19/14(2006.01) (54)发明名称 一种测定稻米支。
2、链淀粉精细结构的优化方 法 (57)摘要 本发明优化了利用酶法测定稻米支链淀粉 精细结构的方法。 本发明采用-淀粉酶、 异淀粉 酶、 普鲁兰酶等三种酶对稻米支链淀粉进行酶 解， 对其酶解反应条件进行了摸索和优化， 从而 获得-淀粉酶水解率、 平均链长、 平均外链长、 平均内链长、 A链与B链的比值等稻米支链淀粉结 构参数。 利用本发明优化的方法， 能够高效、 快 速、 精确测定稻米支链淀粉精细结构， 对稻米支 链淀粉结构和特性的测定和研究提供技术支撑。 权利要求书1页 说明书4页 附图5页 CN 108410919 A 2018.08.17 CN 108410919 A 1.一种测定稻米支链淀。
3、粉精细结构的优化方法， 其特征在于： (1) 利用 -淀粉酶作用于稻米支链淀粉的 -1,4-糖苷键， 形成后 -限制糊精， 并获得 -淀粉酶水解率， 对其酶解反应过程中 -淀粉酶的最适酶用量、 最适反应时间和最适反应 温度进行优化； 对于0.1 g的稻米支链淀粉， 测定 -淀粉酶水解率时， -淀粉酶的最适用量 为500 U， 最适反应时间为48 h， 最适反应温度为37 ； (2) 利用普鲁兰酶作用稻米支链淀粉的 -1,6-糖苷键使支链淀粉脱支成为直链片 段， 获得平均链长， 对其酶解反应过程中普鲁兰酶的最适酶用量、 最适反应时间和最适反应 温度进行优化； 对于22 mg的稻米支链淀粉， 测定。
4、平均链长时， 普鲁兰酶的最适用量为4 U， 最适反应时间为24 h， 最适反应温度为37 ; (3) 首先利用异淀粉酶作用于 -1,6-糖苷键， 先水解 -限制糊精中大于三个葡萄糖单 位构成的侧链， 再用普鲁兰酶进一步水解两个以上葡萄糖单位构成的侧链， 经过异淀粉酶 和普鲁兰酶共同作用后， -极限糊精完全脱支， 获得A链与B链的比值， 对其酶解反应过程中 异淀粉酶和普鲁兰酶的最适酶用量和最适反应时间； 对于1 mL质量浓度为1 mg/mL的稻米 -极限糊精溶液， 测定A链与B链的比值时， 异淀粉酶的最适用量为100 U， 普鲁兰酶的最适 用量为1 U， 二者的最适反应时间均为24 h。 权利要。
5、求书 1/1 页 2 CN 108410919 A 2 一种测定稻米支链淀粉精细结构的优化方法 技术领域 0001 本发明涉及一种优化方法， 具体为一种测定稻米支链淀粉精细结构的优化方法。 背景技术 0002 支链淀粉作为稻米淀粉最主要的组分， 是稻米品质和淀粉理化特化的主要决定因 素。 支链淀粉的精细结构包括平均链长、 平均外部链长、 平均内部链长、 A链与B链的比值 （每 条B链上所具有的A链数目） 、 链长和链长分布等参数。 目前对稻米支链淀粉精细结构的研究 主要是利用凝胶层析法、 荧光糖电泳法 （基于毛细管电泳、 基于测序仪） 等测定支链淀粉的 链长和链长分布。 利用酶法测定支链淀粉结。
6、构是采用 -淀粉酶、 异淀粉酶、 普鲁兰酶等三种 酶对支链淀粉进行酶解， 从而获得 -淀粉酶水解率、 平均链长、 平均外链长、 平均内链长、 A 链与B链的比值等支链淀粉结构参数， 这些参数可更好地反映支链淀粉的精细结构。 已有研 究利用酶法对葛根、 银杏及慈姑的支链淀粉结构进行了测定， 而在水稻中利用酶法测定支 链淀粉的结构鲜见研究报道。 此外， 前人在利用酶法测定葛根、 银杏及慈姑的支链淀粉结构 的具体过程中， 酶解反应条件存在一定差异， 如在测定 -淀粉酶水解率时采用的 -淀粉酶 用量分别是500 U、 500 U、 325 U， 测定A链与B链的比值时采用的异淀粉酶用量分别是2 U、 。
7、80 U、 80 U， 且对酶解的最佳反应时间没有明确。 优化酶法测定稻米支链淀粉精细结构的酶 解反应条件， 对于了解支稻米链淀粉的精细结构， 揭示稻米食用品质形成的机理都具有应 用价值。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种测定稻米支链淀粉精细结构的优化方法。 0004 本发明采用的技术方案如下： 一种测定稻米支链淀粉精细结构的优化方法， 其特 征在于： (1) 利用 -淀粉酶作用于稻米支链淀粉的 -1,4-糖苷键， 形成后 -限制糊精， 并获得 -淀粉酶水解率， 对其酶解反应过程中 -淀粉酶的最适酶用量、 最适反应时间和最适反应 温度进行优化。 对于0.1 g的稻米支链淀粉， 测定。
8、 -淀粉酶水解率时， -淀粉酶的最适用量 为500 U， 最适反应时间为48 h， 最适反应温度为37 ； (2) 利用普鲁兰酶作用支链淀粉的 -1,6-糖苷键使支链淀粉脱支成为直链片段， 获 得平均链长， 对其酶解反应过程中普鲁兰酶的最适酶用量、 最适反应时间和最适反应温度 进行优化。 对于22 mg的稻米支链淀粉， 测定平均链长时， 普鲁兰酶的最适用量为4 U， 最适 反应时间为24 h， 最适反应温度为37 ; (3) 首先利用异淀粉酶作用于 -1,6-糖苷键先水解 -限制糊精中大于三个葡萄糖单 位构成的侧链， 再用普鲁兰酶进一步水解两个以上葡萄糖单位构成的侧链， 经过异淀粉酶 和普鲁兰。
9、酶共同作用后， -极限糊精完全脱支， 获得A链与B链的比值， 对其酶解反应过程中 异淀粉酶和普鲁兰酶的最适酶用量和最适反应时间;对于1 mL质量浓度为1 mg/mL的稻米 -极限糊精溶液， 测定A链与B链的比值时， 异淀粉酶的最适用量为100 U， 普鲁兰酶的最适 说明书 1/4 页 3 CN 108410919 A 3 用量为1 U， 二者的最适反应时间均为24 h。 0005 本发明优化了 -淀粉酶、 异淀粉酶、 普鲁兰酶等三种酶测定稻米支链淀粉精细结 构时的酶解反应条件， 其特征在于优化结果如下： (1) 测定 -淀粉酶水解率时， 当 -淀粉酶用量为500 U， 反应时间达48 h时开始。
10、， 反应 体系中所产生的还原力基本上达到一个平稳值， 水解程度达到最大， 随后还原力不再而增 加。 且反应体系温度为37 时的还原力均大于20 时的还原力。 对于0.1 g的稻米支链淀 粉， 测定 -淀粉酶水解率时， -淀粉酶的最适用量为500 U， 最适反应时间为48 h， 最适反应 温度为37 ； (2) 测定平均链长时， 当酶用量为4 U时， 反应时间达24 h时开始， 反应体系中所产生 的还原力基本上达到一个平稳值， 水解程度达到最大， 随后还原力不再增加。 且反应体系温 度为37 时的还原力均大于20 时的还原力。 对于22 mg的稻米支链淀粉， 测定平均链长 时， 普鲁兰酶的最适用。
11、量为4 U， 最适反应时间为24 h， 最适反应温度为37 ； (3) 测定A链与B链的比值时， 当异淀粉酶用量为100 U， 普鲁兰酶用量为1 U ， 二者反 应时间达到24 h时， 反应体系中所产生的还原力基本上达到一个平稳值， 水解程度达到最 大， 随后还原力不再增加。 对于1 mL质量浓度为1 mg/mL的稻米 -极限糊精溶液， 测定A链与 B链的比值时， 异淀粉酶的最适用量为100 U， 普鲁兰酶的最适用量为1 U， 二者的最适反应 时间均为24 h。 0006 本发明的优点是： 本发明优化酶法测定稻米支链淀粉精细结构的酶解反应条件， 可高效、 快速、 精确测定稻米支链淀粉精细结构，。
12、 对稻米支链淀粉结构和特性的测定和研究 提供技术支撑， 揭示稻米食用品质形成的机理都具有应用价值。 附图说明 0007 图1为 -淀粉酶水解率测定时 -淀粉酶用量与还原力生成的关系示意图。 0008 图2为 -淀粉酶水解率测定时酶解反应时间与还原力生成的关系示意图。 0009 图3为 -淀粉酶水解率测定时不同反应温度下的还原力示意图。 0010 图4为平均链长测定时普鲁兰酶用量与还原力生成的关系示意图。 0011 图5为平均链长测定时酶解反应时间与还原力生成的关系示意图。 0012 图6为平均链长测定时同反应温度下的还原力示意图。 0013 图7为A链与B链比值测定时异淀粉酶用量与还原力生成的。
13、关系示意图。 0014 图8为A链与B链比值测定时异淀粉酶酶解反应时间与还原力生成的关系示意图。 0015 图9为A链与B链比值测定时普鲁兰酶用量与还原力生成的关系示意图。 0016 图10为A链与B链比值测定时普鲁兰酶酶解反应时间与还原力生成的关系示意图。 具体实施方式 0017 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明， 这些实施例仅用于举例说明 本发明， 而不对本发明的范围构成任何限制。 0018 实施例中所涉及的 -淀粉酶 （EC 3.2.1.2） 、 普鲁兰酶 （EC 3.2.1.41） 、 异淀粉酶 （EC 3.2.1.68） 为Sigma-Aldrich公司产品， 其余试剂均。
14、为国产分析纯； 仪器均为实验室常 用仪器。 本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 说明书 2/4 页 4 CN 108410919 A 4 0019 实施例1： -淀粉酶酶解反应条件的优化及稻米支链淀粉 -淀粉酶水解率的测定 (1) 每个供试品种取5 mL离心管4个， 加入纯化的支链淀粉0.1 g分散于5 mL浓度为 0.02 mol/L， pH 5.0的醋酸缓冲溶液中， 分别加入300、 400、 500、 600 U的 -淀粉酶， 同时加 入12滴甲苯防止微生物生长， 37 水浴保温约48 h后， 将反应液沸水浴灭酶25 min， 冷却 后测定体系中的还原力 （麦芽糖当量） ，。
15、 以还原力不再增加的最低酶用量为优化酶用量 （图 1） ， 每个样品重复测定3次。 由图1可知， 对于0.1 g的稻米支链淀粉， 测定 -淀粉酶水解率时 -淀粉酶的最适酶用量为500 U。 0020 (2) 每个供试品种取5 mL离心管1个， 加入纯化的支链淀粉0.1 g分散于5 mL浓度 为0.02 mol/L， pH 5.0的醋酸缓冲溶液中， 加入优化酶用量的 -淀粉酶， 同时加入12滴甲 苯防止微生物生长， 37 水浴保温， 测定4 h至60 h不同反应时间点酶解反应所产生的还 原力， 以还原力不再增加的最短时间为优化反应时间 （图2） ， 每个样品重复测定3次。 由图2 可知， 对于0。
16、.1 g的稻米支链淀粉， 测定 -淀粉酶水解率时的最适酶解时间为48 h。 0021 (3) 根据所购 -淀粉酶的质检报告， -淀粉酶的推荐反应温度为20 ， 前人采用 -淀粉酶进行水解反应时， 采用的反应温度为37 。 为此， 在 -淀粉酶酶用量和反应时间 优化的基础上， 设置20 和37 两种温度， 测定不同品种在两种反应温度下酶解产生的 还原力， 明确 -淀粉酶的最佳温度 （图3） ， 每个样品重复测定3次。 由图3 可知， 对于0.1 g的 稻米支链淀粉， 测定 -淀粉酶水解率时的最适反应温度为37 。 0022 在反应条件优化的基础上， 测定反应体系中的总糖和还原力， 重复3次， 以。
17、不加酶 的样品同样处理作为对照， 计算稻米支链淀粉 -淀粉酶水解率， 公式如下： -淀粉酶水解率还原力 （麦芽糖当量） 100/总糖 （麦芽糖当量） 实施例2： 普鲁兰酶反应条件的优化及稻米支链淀粉平均链长、 平均外链长、 平均内链 长的测定 (1) 每个供试品种取5 mL离心管4个， 称取22 mg纯支链淀粉， 加入浓度为0.05 mol/L, pH 5.0的醋酸缓冲液5 mL， 充分混匀后加入2、 4、 6、 8 U的普鲁兰酶， 液面以12滴甲苯防止 微生物生长， 37 水浴保温约24 h后， 将反应液沸水浴灭酶20 min， 冷却后测定体系中的 还原力， 以还原力不再增加的最低酶用量为优。
18、化酶用量 （图4） ， 每个样品重复测定3次。 由图 4可知， 对于22 mg的稻米支链淀粉， 测定CL时的普鲁兰酶最适酶用量为4 U。 0023 (2) 每个供试品种取5 mL离心管1个， 称取22 mg纯支链淀粉， 加入浓度为0.05 mol/L, pH 5.0的醋酸缓冲液5 mL， 充分混匀后加入优化酶用量的普鲁兰酶， 同时加入12 滴甲苯防止微生物生长， 37 水浴保温， 测定4 h至32 h不同反应时间段内酶解反应所产 生的还原力， 以还原力不再增加的最短时间为优化反应时间 （图5） ， 每个样品重复测定3次。 由图5可知， 对于22 mg的稻米支链淀粉， 测定CL的最适酶解时间为2。
19、4 h。 0024 (3) 根据所购普鲁兰酶的质检报告， 普鲁兰酶的推荐反应温度为25 ， 前人采用 -淀粉酶、 普鲁兰酶进行水解反应时， 采用的反应温度为37 。 为此， 在普鲁兰酶酶用量和 反应时间优化的基础上， 设置25和37 两种温度， 测定不同品种在两种反应温度下酶解 产生的还原力， 明确普鲁兰酶酶解反应的最佳温度 （图6） ， 每个样品重复测定3次。 由图6可 知， 对于22 mg的稻米支链淀粉， 测定CL的最适反应温度为37 。 0025 在反应条件优化的基础上， 测定反应体系中的总糖和总还原力， 重复3次， 以不加 酶的样品同样处理作为对照计算平均链长 （CL） ， 同时根据所。
20、测定的 -淀粉酶水解率可以计 说明书 3/4 页 5 CN 108410919 A 5 算出支链淀粉的平均外链长 （ECL） 和平均内链长 （ICL） ， 公式如下： CL=产物中的总糖 （葡萄糖当量） /产物中的总还原力 （葡萄糖当量） ECLCL -淀粉酶水解率+2.0 ICL(CL-ECL)-1.0 实施例3： 支链淀粉A链与B链比值酶解反应条件的优化及测定 将测定 -淀粉水解率时的最终反应液加入3倍体积无水甲醇， 冰浴30 min后6 000 r/ min离心5 min， 倾去上清液， 加入75%的甲醇冲洗沉淀， 37 恒温干燥后用研钵磨成细粉， 获得支链淀粉 -极限糊精。 称取5 m。
21、g -极限糊精粉末于2 mL离心管中， 加入200 L蒸馏 水， 沸水浴中加热搅拌10 min后， 加入浓度为0.04 mol/L， pH 4.5的醋酸缓冲液， 再次置沸 水浴中加热搅拌10 min， 冷却至室温， 制成1 mg/mL的 -极限糊精溶液。 0026 (1) 每个供试品种取2 mL离心管5个， 量取 -极限糊精溶液1 mL， 首先分别加入2、 10、 50、 100、 150 U的异淀粉酶进行第一步脱支水解， 37 水浴保温， 24 h后将反应液置沸 水浴中25 min灭酶， 冷却后测定反应液中的还原力， 以还原力不再增加的最低酶用量为异 淀粉酶优化酶用量 （图7） ， 每个样品。
22、重复测定3次。 由图7 可知， 对于1 mL浓度为1 mg/mL的 稻米 -极限糊精溶液， 测定A链与B链的比值时异淀粉酶的最适酶用量为100 U。 0027 (2) 每个供试品种取2 mL离心管1个， 量取 -极限糊精溶液2 mL， 加入优化酶用量 的异淀粉酶， 同时加入12滴甲苯防止微生物生长， 37 水浴保温， 测定4 h至32 h不同反 应时间段内酶解反应所产生的还原力， 以还原力不再增加的最短时间为优化反应时间 （图 8） ， 此时反应液中的还原力为C1， 每个样品重复测定3次。 由图8可知， 对于1 mL浓度为1 mg/ mL的 -极限糊精溶液， 测定A链与B链的比值时的最适酶解时。
23、间为24 h。 0028 (3) 异淀粉酶用量和反应时间优化的基础上， 每个供试品种取2 mL离心管4个， 取 异淀粉酶水解后的反应液 1 mL， 再次加入0.6、 0.8、 1、 1.2 U普鲁兰酶第二步脱支水解， 37 水浴保温， 24 h后将反应液置沸水浴中25 min灭酶， 冷却后测定反应液中的还原力， 以还 原力不再增加的最低酶用量为普鲁兰酶优化酶用量 （图9） ， 每个样品重复测定3次。 由图9可 知， 对于1 mL异淀粉酶水解后的反应液， 测定A链与B链的比值普鲁兰酶的最适酶用量为1 U。 0029 (4) 在异淀粉酶用量和反应时间优化的基础上， 每个供试品种取2 mL离心管1个。
24、， 取异淀粉酶水解后的反应液1 mL， 向每个供试品种的体系中加入优化酶用量的普鲁兰酶， 测定4 h至32 h不同反应时间点酶解反应所产生的还原力， 以还原力不再增加的最短时间 为优化反应时间 （图10） ， 此时反应液中的还原力为C2， 每个样品重复测定3次。 由图10可知， 对于1 mL异淀粉酶水解后的反应液， 测定A链与B链的比值时的最适酶解时间为24 h。 0030 根据测定的C1、 C2可计算出稻米支链淀粉的A链与B链的比值， 公式如下： C1=B+0.5A。 0031 C2=B+A。 说明书 4/4 页 6 CN 108410919 A 6 图1 图2 说明书附图 1/5 页 7 CN 108410919 A 7 图3 图4 说明书附图 2/5 页 8 CN 108410919 A 8 图5 图6 说明书附图 3/5 页 9 CN 108410919 A 9 图7 图8 说明书附图 4/5 页 10 CN 108410919 A 10 图9 图10 说明书附图 5/5 页 11 CN 108410919 A 11 。