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1、(10)授权公告号 CN 1884301 B (45)授权公告日 2012.02.29 CN 1884301 B *CN1884301B* (21)申请号 200510077737.4 (22)申请日 2005.06.24 C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 39/085(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军军事医学科学院 微生物流行病研究所 地址 100071 北京市丰台区东大街 20 号 (72)发明人。
2、 姜永强 郑玉玲 王建丽 马茹 宁保安 ULRICH BRINKMANN et al.A frcombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fvfragment.Proc. Natl. Acad. USA90.1993,907538-7542. 郝淮杰， 郑玉玲， 余多慰， 马茹， 姜永强 . 单链 二硫键稳定抗体靶向超抗原 SEA（D227A） 分子 的表达、 纯化及鉴定 . 细胞与分子免疫学杂志 21 3.2005,21(3),269-270, 272. Yoram Reiter et al.Antitumor activi。
3、ty and pharmacokinetics in mice of arecombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fvfragment.CANCER RESEARCH15.1994,152714. (54) 发明名称 一种具有靶向功能的超抗原 , 其制备方法及 用途 (57) 摘要 本发明公开了一种具有靶向功能的超抗原， 还公开了该超抗原的制备方法及用途。该超抗原 包括靶向部分和超抗原部分， 其中靶向部分为可 与LeY家族糖类抗原结合的源于B3单克隆抗体的 基因工程抗体， 超抗原部分为葡萄球菌肠毒素 A。 该超抗原的制备。
4、方法， 包括连接 B3 抗体的 VH 和 VL 片段， 含有抗体基因片段的重组载体的构建， 含有抗体及超抗原基因片段重组载体的构建， 具 有靶向功能的超抗原融合蛋白的表达， 纯化等步 骤。本发明所获得的重组超抗原具备了导向和杀 伤肿瘤细胞的双重功能， 有可能发展为有效的肿 瘤免疫治疗靶向药物。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘红霞 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 3 页 CN 1884301 B1/1 页 2 1. 一种具有靶向功能的超抗原， 包括靶向部分和超抗原部分， 其特征在于靶向部分为 可与 LeY 家。
5、族糖类抗原结合的二硫键稳定单链抗体 (B3ds-scFv)， 超抗原部分为葡萄球菌 肠毒素 A(SEA) 或其突变体 (SEAD227A)。 2. 权利要求 1 所述具有靶向功能的超抗原的制备方法， 包括以下步骤 ： (1) 通过 PCR 连接 B3 抗体的 VH 和 VL 片段 ； (2)将PCR产物克隆至表达载体， 构建包含B3ds-scFv单链抗体基因片段的重组表达载 体 ； (3) 将 SEA(D227A) 基因片段亚克隆至上述重组表达载体， 构建包含 B3ds-scFv-SEA 片 段的重组表达载体 ； (4) 将上述构建的重组表达载体转化大肠杆菌， 并诱导表达， 获得包涵体 ； (。
6、5) 将包涵体变性、 复性并纯化， 得到 B3ds-scFv-SEA(D227A) 融合蛋白。 3. 根据权利要求 2 所述方法， 其中所述表达载体为 pET22b， 所述大肠杆菌为 BL21(DE3)。 4. 根据权利要求 2 所述方法， 其中所述诱导表达方法为 IPTG 诱导表达。 5. 权利要求 1 所述具有靶向功能的超抗原在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用， 其中所 述肿瘤为在肿瘤细胞表面有与单克隆抗体 B3 相对应的 LeY 家族糖类抗原表达的肿瘤。 6. 根据权利要求 5 所述应用， 其中所述肿瘤为结肠癌。 权 利 要 求 书 CN 1884301 B1/7 页 3 一种具有靶向功能的。
7、超抗原， 其制备方法及用途 技术领域 0001 本发明涉及一种具有靶向功能的超抗原， 具体地说涉及一种含有二硫键稳定单链 抗体的靶向超抗原， 还涉及该超抗原的制备方法及用途。 背景技术 0002 葡萄球菌肠毒素 A(staphylococcalenterotoxinA SEA) 是金黄色葡萄球菌的产 物， 是一种重要的细菌性超抗原。由于 SEA 诱导的 CTL(cytotoxic Tlymphocytes) 对肿 瘤细胞有强大的杀伤作用 (Kalland T， Dohlsten M， AbrahmsenL， et al.Targeting of superantigens.Cell Bioph。
8、ys.1993 Jan-Jun ； 22(1-3) ： 147-164 ； Hansson J， Ohlsson L， Persson R， et al.Genetically engineered superantigens astolerable antitumor agents.Proc Natl Acad Sci U S A.1997Mar 18 ； 94(6) ： 2489-2494 ； Dohlsten M.， Hedlund G.， Akerblom E.， et al.antibody-targeted superantigens ： adifferent class of a。
9、nti-tumor agents.Proc Natl Acad Sci U S A.1991 October 15 ； 88(20) ： 9287-9291)。 因此应用 SEA 的抗肿瘤治疗得到了人们的热切关注。但是 SEA 在对肿瘤细胞进行杀伤的 同时对正常细胞也具有毒性， 并且只能对 MHCII+的肿瘤分子进行杀伤。单克隆抗体制备 技术为肿瘤的导向治疗带来了希望。单克隆抗体 B3 是对应于 LeY 家族中一种糖类抗原 的鼠源抗体， 这种抗原在许多肿瘤细胞表面都有表达， 包括结肠癌、 胃癌、 卵巢癌、 乳腺癌、 肺癌以及一些表皮癌细胞。由于 mAb B3 只与极少部分的正常细胞发生作用， 。
10、因此是一种 很理想的进行肿瘤导向治疗的抗体 (Brinkmann U， Pai LH， FitzGerald DJ， Willingham M， Pastan I.B3(Fv)-PE38KDEL， a single-chain immunotoxin that causescomplete regression of a human carcinoma in mice.Proc Natl Acad Sci U S A.1991 Oct1 ； 88(19) ： 8616-8620.)。但单克隆抗体分子量大、 穿透力差， 限制了其导向治疗的效果。而 小分子基因工程抗体的出现较好的解决了上述问题， 。
11、国外源于 mAbB3 的小分子抗体导向的 免疫毒素 (B3-PE) 已进入临床试验 (Pai LH， BatraJK， FitzGerald DJ， Willingham MC， Pastan I.Antitumor effects of B3-PE andB3-LysPE40 in a nude mouse model of human breast cancer and the evaluation ofB3-PE toxicity in monkeys.Cancer Res.1992 Jun 1 ； 52(11) ： 3189-3193.)， 如单链抗体 (ScFv)， 二硫键稳定抗体 。
12、(dsFv)(Rajagopal V， Pastan I， Kreitman RJ.A form ofanti-Tac(FV)which is both single-chain and disulfide stabilized ： comparison with itssingle-chain and disulfide-stabilized homologs.Protein Eng.1997Dec ； 10(12) ： 1453-1459.)。前者是由一条 Linker 连接 VH 和 VL 分子， 后者 VH 和 VL 的连接则是通过一对链间二硫键 (Reiter Y， Brinkman。
13、n U， Jung SH， Lee B， Kasprzyk PG， King CR， Pastan I.Improved binding and antitumor activity of arecombinant anti-erbB2 immunotoxin by disulfide stabilization of the Fv fragment.JBiol Chem.1994 Jul 15 ； 269(28) ： 18327-18331.)。然而， VH 和 VL 短暂的分离 导致 ScFv 的不稳定进而影响了与其连接的毒素的稳定性 ； dsFv 相对于 ScFv 较稳定， 但是 复性后。
14、的低产量限制了它的临床应用。而二硫键稳定单链抗体 sc-dsFv 是近期报道的一种 说 明 书 CN 1884301 B2/7 页 4 新型基因工程抗体， 其 VH 和 VL 之间同时由一条 Linker 和一对二硫键进行连接， 兼具 ScFv 产量高和dsFv稳定性高的优点， 因而更具优势(Bera TK， Onda M， Brinkmann U， Pastan I.A bivalentdisulfide-stabilized Fv with improved antigen binding to erbB2.J Mol Biol.1998 Aug21 ； 281(3) ： 475-483.。
15、)。 0003 到目前为止， 尚未有可与LeY家族糖类抗原结合的源于B3单克隆抗体的基因工程 抗体， 与葡萄球菌肠毒素 A(D227A) 融合表达， 制备靶向超抗原的报道。也未见 B3 二硫键稳 定单链抗体 sc-dsFv 与其它蛋白 ( 毒素、 超抗原 ) 融合的报道。 发明内容 0004 为了克服葡萄球菌肠毒素 A 抗肿瘤治疗中对正常细胞具有毒性， 且杀伤肿瘤细胞 种类少的缺点， 本发明提供一种高效的具有靶向功能的超抗原。 0005 本发明的具有靶向功能的超抗原由两部分组成， 其特征在于靶向部分为可与 LeY 家族糖类抗原结合的源于 B3 单克隆抗体的基因工程抗体， 超抗原部分为葡萄球菌肠。
16、毒 素 A 或其突变体 (D227A)。所述基因工程抗体为 B3 二硫键稳定抗体 (dsFv)、 单链抗体 (scFv) 或二硫键稳定单链抗体 (ds-scFv)。其中靶向功能部分优选源于 B3 单克隆抗体 的二硫键稳定单链抗体 B3ds-scFv， 超抗原部分为葡萄球菌肠毒素 A(SEA)， 两部分结合为 B3ds-scFv-SEA。 0006 本发明还公开了上述具有靶向功能的超抗原的制备方法， 包括以下步骤 ： 0007 首先是通过重叠 PCR 技术， 连接 B3 抗体的 VH 和 VL 片段， 并将 PCR 产物克隆至原 核表达载体， 如 pET22b， 构建 B3ds-scFv-pET。
17、22b 重组表达载体 ； 将测序正确的 SEA(D227A) 基因片段经酶切连接亚克隆至上述获得的重组表达载体 B3ds-scFv-pET22b， 构建包含 B3ds-scFv-SEA-pET22b 片段的重组表达载体 ； 然后经酶切鉴定 B3ds-scFv 与 SEA 两片段 连接正确后， 转化大肠杆菌如 BL21(DE3)， 可以经过不同表达方式如 IPTG 诱导进行表达， 获 得包涵体， 然后将表达的包涵体进行变性、 复性， 复性产物可以通过阳离子柱 SP-Sepharose 等纯化方法进行初步纯化， 获得 B3ds-scFv-SEA 融合蛋白。 0008 经鉴定， 重叠PCR扩增得到了。
18、B3ds-scFv单链抗体基因， 并通过酶切连接成功构建 了 B3ds-scFv 和 SEA(D227A) 两段融合基因， 成功构建了 B3ds-scFv-SEA-pET 表达载体， 诱 导表达产物以包涵体形式存在， 占总蛋白量的 33左右 ； ELISA 测定此融合蛋白中单链抗 体的结合活性以及其在 37的稳定性， 结果显示复性后的 B3ds-scFv-SEA 融合蛋白保持了 单链抗体的结合活性， 37孵育数小时后， 经 ELISA 测定， 蛋白仍能保持大部分活性 ； 采用 MTT 法检测其对 B3 抗原表面阳性细胞如结肠癌 HT-29 细胞的杀伤作用， 结果显示对结肠癌 HT-29 细胞具。
19、有一定的杀伤作用。 0009 本发明还公开了具有靶向功能的超抗原在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用， 其中 的肿瘤为在肿瘤细胞表面有与单克隆抗体B3相对应的LeY家族糖类抗原表达的肿瘤， 包括 结肠癌、 胃癌、 卵巢癌、 乳腺癌、 肺癌以及一些表皮癌等。 0010 在众多的恶性肿瘤的生物疗法中， 抗体的导向治疗具有毒副作用小、 选择性强、 效果持久等优点。抗体的 Fv 片段保留了特异的抗原结合能力， 并且能较快的穿透肿瘤 (Kuan CT， Pastan I.Improved antitumor activity of a recombinantanti-Lewis(y) immunotoxin 。
20、not requiring proteolytic activation.Proc Natl Acad Sci USA.1996Feb 说 明 书 CN 1884301 B3/7 页 5 6 ； 93(3) ： 974-978)， 由于其具有以上优点， 因此， 近年来出现了各种形式的Fv， ScFv和dsFv 就是其中的两种， 然而， ScFv 的不稳定性和 dsFv 的低复性率成为它们在临床应用上的障 碍。本发明所采用的二硫键稳定单链抗体 B3ds-scFv 抗体， 克服了以上的不足。 0011 本发明采用重叠 PCR 及人为引入链间二硫键 B3VH(Cys44) 和 B3VL(Cys105。
21、) 首次构 建了新型抗体 B3ds-cFv， 并同 SEA(D227A) 进行了融合表达， 目的是弥补 SEA 在肿瘤治疗中 的不足， 在对肿瘤细胞进行杀伤的同时减少其对正常细胞的伤害， 同时提高整个重组毒素 的稳定性以达到理想的治疗效果。 0012 本发明对融合蛋白进行了高效的诱导表达， 表达产物以包涵体形式存在， 产量 可达到总蛋白量的 30以上， 相对于可溶表达的低产量， 包涵体的高表达量更有利于 B3ds-scFv-SEA 的应用。在包涵体的复性方法上， 我们采用了稀释复性法， 并且对复性液的 配方进行了摸索， 结果表明， 在高浓度的促溶剂精氨酸和少量 GSSG 存在的条件下， 10复。
22、 性效果最好。 研究表明复性液中存在的复性剂和低浓度盐酸胍对肿瘤细胞就具有一定的杀 伤作用， 为了检测 B3ds-scFv-SEA 对肿瘤细胞的杀伤作用， 我们对复性后的产物进行了纯 化， 由于复性后的溶液体积较大， 我们用中空纤维浓缩换液柱对样品进行浓缩和换液处理， 整个过程仅需 2-3 个小时， 解决了传统的透析换液费时且除盐不彻底的缺点， 大大加快了 实验的进程。二硫键的形成是影响整个蛋白稳定的关键问题， 我们将复性纯化后的产物进 行了还原和非还原 SDS-PAGE 分析并进行了稳定性实验。结果表明， 蛋白在非还原状态下的 迁移率略大于还原状态， 将 B3ds-scFv-SEA 在 37。
23、孵育， 其活性无明显降低， 说明了通过复 性形成了二硫键。 0013 在以往靶向超抗原的研究过程中， 同时获得抗体结合活性和抗肿瘤活性良好的超 抗原双功能分子是困难的。在抗体和超抗原的融合过程中， 肿瘤细胞的结合活性和超抗原 免疫激活特性会部分甚至完全丧失。我们曾用同样方法制备 B3 基因工程抗体与葡萄球菌 B 型肠毒素 (SEB) 的融合蛋白， 结果该蛋白对 B3 抗体针对的肿瘤细胞无明显杀伤作用。本 研究的活性实验证明， 制备的融合蛋白对 B3 表面阳性肿瘤细胞具有良好的结合活性， 证实 其具备了良好的肿瘤导向作用， 且能够成功的激活 T 淋巴细胞对结肠癌细胞 HT-29 进行杀 伤， 蛋。
24、白浓度为 1g/ml 时， 最大抑制率可达 95， 其对肿瘤的杀伤力与天然 SEA 相当。 0014 本发明首次构建了源于 B3 单克隆抗体的二硫键稳定单链抗体 B3ds-scFv， 并在此 基础上与 SEA(D227A) 基因通过原核表达载体进行了高效的融合表达。实验证明了融合蛋 白稳定性良好， 37孵育数小时仍能保持大部分活性， 优于文献报道的单链抗体的稳定性 ； 与 B3 抗原表面阳性肿瘤细胞结合良好， 并对表达 B3 抗原的 HT-29 结肠癌细胞具有一定的 杀伤作用。本发明所获得的 B3(ds-scFv)-SEA 重组超抗原具备了导向和杀伤肿瘤细胞的双 重功能， 可以成为有效的肿瘤免。
25、疫治疗靶向药物。 附图说明 0015 图 1 为 B3dsscFv-SEA-pET 质粒构建示意图。 0016 图 2 为阳性表达质粒酶切鉴定图谱。 0017 图 3 为融合蛋白的诱导表达图谱。 0018 图 4 为 B3ds-scFv-SEA 与不同肿瘤细胞结合的结果图。 0019 图 5 为融合蛋白稳定性分析图 说 明 书 CN 1884301 B4/7 页 6 0020 图 6 为融合蛋白的纯化和二硫键分析 0021 图 7 为融合蛋白对肿瘤细胞的生长抑制实验 具体实施方式 0022 实施例一 B3ds-scFv-SEA 融合蛋白的制备 0023 1. 材料 0024 B3ds-scFv。
26、-pET 及 SEA(D227A)-pET 质粒按照常规方法构建， B3ds-scFv 基因片段 由上海博亚生物技术公司人工合成， SEA(D227A) 片段由金黄色葡萄球菌 FRI100A(ATCC) 钓取， 并按常规方法诱变。人结肠癌细胞系 HT-29、 人肝癌细胞系 SMMC-7721、 人乳腺 癌细胞系 MCF-7、 大肠杆菌 TOP10 均为国际标准株， 市购 ； 表达载体 pET22b 为市购 ； LA TaqDNA 聚合酶、 限制性内切酶均购自 Takara 公司 ； T4DNA 连接酶、 质粒提取试剂盒、 Non-RadioactiveCell Proliferation As。
27、say试剂盒购自Promega公司 ； DNA纯化试剂盒购 自道普公司， 羊抗兔 IgG 购自北京欣经科， AKTA 蛋白纯化系统、 Hitrap-SP-Sepharose 纯化 柱系 Amersham 公司产品 ； 中空纤维浓缩柱购自北京旭邦公司。其他试剂均为市购， 为分析 纯。引物合成及 DNA 测序， 由上海博亚生物工程公司完成。 0025 2. 方法 0026 2.1B3VH 和 B3VL 的 PCR 连接 0027 B3VH 和 B3VL 中二硫键突变位点的设计参照文献 (Jung SH， Pastan I， Lee B.Design of interchain disulfide 。
28、bonds in the framework region of the Fv fragment of themonoclonal antibody B3.Proteins.1994 May ； 19(1) ： 35-47 ； Brinkmann U， Reiter Y， Jung SH， Lee B， Pastan I.A recombinant immunotoxin containing a disulfide-stabilized Fv fragment.ProcNatl Acad Sci U S A.1993 Aug 15 ； 90(16) ： 7538-7542.)， 即 B3VH。
29、(Cys44) 和 B3VL(Cys105)。由于模板质粒 B3ds-scFv-pET32a 经测序后 发现 VH 和 VL 之间的 linker GGGGSGGGGSGGGGS 中第六个碱基 G 突变成了 S(G S)， 为了 不影响单链抗体的活性以及保持整个融合蛋白的空间构象， 我们通过重叠 PCR 对此突变进 行了纠正， 同时实现了 B3VH 和 B3VL 的连接。根据 GeneBank 中 B3VH 和 B3VL 的基因序列及 linker 的序列设计了四条引物 ( 见表 1)， 下划线先后标明了酶切位点 NdeI 和 BamHI， 其中 P2和 P3中包含了部分 linker 序列。。
30、以 B3ds-scFv-pET32a 为模板， 分别以 P1和 P2为上下 游引物扩增 B3VH ； 以 P3和 P4扩增 B3VL， PCR 产物经琼脂糖电泳鉴定并回收， 再以回收后等 比例混合的 B3VH 和 B3VL 为模板， 以 P1和 P4为上下游引物扩增 B3ds-scFv， 电泳鉴定并回 收 PCR 产物。 0028 表 1. 构建载体 B3ds-scFv-SEA-pET 寡核苷酸引物 说 明 书 CN 1884301 B5/7 页 7 0029 0030 2.2B3ds-scFv-pET 的构建 0031 将回收的 B3ds-scFv PCR 产物连入 pMD-18T-Vect。
31、or 测序， NdeI、 BamHI 双酶切测 序正确后的质粒， 与用相同酶切的载体 pET22b 连接， 构建重组质粒 B3ds-scFv-pET， 并对阳 性质粒进行双酶切鉴定。 0032 2.3B3ds-scFv 与 SEA(D227A) 的酶切连接 0033 以 rSEA 为模板扩增 SEA(D227A)， 分别以 P5和 P6( 见表 1) 为上下游引物扩增 SEA(D227A)， 并在上游引入酶切连接的位点BamHI。 将回收的PCR产物连入pMD-18T-Vector 测序， 测序后正确的质粒以BamHI和SalI酶切， 并与用相同酶切的表达载体B3ds-scFv-pET 连接，。
32、 实现B3ds-scFv和SEA(D227A)基因的融合， 构成表达载体B3dsscFv-SEA-pET， 表达质 粒构建过程见图 1。 0034 2.4B3ds-scFv-SEA 融合蛋白的诱导表达及分离 0035 表达质粒经 NdeI 和 SalI 双酶切鉴定后， 转化表达菌株 BL21(DE3)， 挑取单菌落于 TB 培养基中 37培养至 OD600 0.5， 加 IPTG 至终浓度为 1mmol/L， 37诱导 3h。收集菌 体， 将菌体用包含 50mmol/L pH8.5 的 Tris-Hcl， 5mmol/L 的 EDTA， 0.8 NaCl 的缓冲液重 悬， 超声破菌， 5000。
33、g， 4离心 15min， 分离上清和沉淀， 进行 SDS-PAGE 分析。 0036 2.5 表达产物的 western blot 鉴定 0037 将破碎后的沉淀进行 SDS-PAGE 后， 用半干转移装置将蛋白转移至硝酸纤维素膜 上， 以封闭液封闭后依次与兔抗 SEA 一抗， 羊抗兔 IgG 二抗共孵育， DAB 显色观察结果。 0038 2.6 包涵体的洗涤及变复性 0039 将超声后的到的沉淀以50mmol/L pH8.5的Tris-HCl， 5mmol/L的EDTA洗涤两次后 加入变性剂(6mol/L盐酸胍， 2mmol/L EDTA， 50mmol/L Tris-HclpH8.5，。
34、 l0mmol/L DTT)室温 放置 3h， 离心分离出上清， 将变性后的上清 1 30 稀释至包含 100mmol/LTris-HCl pH8.0， 0.5mol/L L-Arg， 2mmol/L EDTA 和 0.9mmol/L GSSG 的复性液中， 10复性 48h。 0040 2.7 复性产物的纯化 0041 将复性后的溶液经中空纤维超滤柱浓缩并换成 pH5.8， 5mmol/L 的磷酸盐缓冲液 (BufferA)， 过 SP-Sepharose 阳离子交换柱纯化， 以含 0.5mol/L NaCl 的 pH7.4 的磷酸盐缓 冲液 (BufferB) 线性洗脱， 目的蛋白在达到 。
35、50 BufferB 时被洗脱， SDS-PAGE 鉴定纯化产 物。 0042 3. 结果 说 明 书 CN 1884301 B6/7 页 8 0043 3.1B3ds-scFv 表达载体的构建及鉴定 0044 以 B3ds-scFv-pET32a 为模板， 通过重叠 PCR 连接获得 B3dsscFv， 大小为 750bp， 连入 T-Vector 测序结果说明成功纠正了模板中的点突变 ； 对阳性表达质粒进行了 NdeI 和 BamHI 双酶切鉴定， 2琼脂糖凝胶电泳酶切产物， 结果表明切下的片段与目的片段大小一 致， 见图 2。 0045 3.2B3ds-scFv-SEA 融合表达载体的构。
36、建及鉴定 0046 将测序正确的 SEA(D227A)-T-Vector 经 BamHI 和 SalI 酶切鉴定后连入经过相同 酶切的 B3ds-scFv-pET 构成 B3ds-scFv-SEA-pET22b 表达载体， 再对此表达载体进行 NdeI 和 BamHI 双酶切鉴定， 结果表明切下的片段为 1500bp 左右， 与 B3ds-scFv-SEA 融合基因大 小一致， 证明成功构建了 B3ds-scFv-SEA-pET22b 表达载体， 见图 2。 0047 3.3 融合蛋白的诱导表达 0048 将 B3ds-scFv-SEA-pET 表达质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 挑单。
37、菌落于 TB 培养基 中， 经 37培养诱导后收集菌体， 超声破碎后分离上清和沉淀， SDS-PAGE 结果表明表达产 物以包涵体形式存在(图3)， 大小约为50KD， 经TotalLab软件扫描分析占总表达量的30 左右。 0049 3.4 表达产物的 western blot 鉴定 0050 将表达的包涵体 SDS-PAGE 鉴定后进行 western blot 鉴定， 结果表明所显示条带 为目的蛋白， 见图 3。 0051 3.5 复性产物的纯化 0052 复性后的产物经浓缩换液后过 sp-sepharose 阳离子交换柱进行纯化， 将纯化产 物进行还原和非还原 SDS-PAGE 分析，。
38、 可见蛋白在非还原状态下的迁移率略大于还原状态， 初步说明蛋白复性过程中可能形成了二硫键， 见图 6。 0053 实施例二 B3ds-scFv-SEA 融合蛋白检测 0054 1. 材料 ： 同实施例一。 0055 2. 方法 0056 2.1ELISA 鉴定 B3ds-scFv-SEA 中单链抗体的活性 0057 用含血清的 1640 将肿瘤细胞浓度调至 5104/ml 铺于 96 孔板， 每孔 100uL 置于 细胞培养箱中培养 48 小时， 取出， 弃去培养液， 用 PBS 清洗一遍， 然后每孔加入 100ul 预冷 的细胞固定液 (V 甲醇 V 丙酮 1 1) 固定 30min 后再加。
39、入阻断液 ( 含 1 H2O2的 PBS) 阻断 10min 后用 PBS 洗三遍 ； 加入用含 3 BSA 的 PBST 梯度稀释的蛋白溶液 ( 初始浓度为 100g)， 37反应 1h， PBST 洗涤后加入 1 1000 稀释的兔源抗 SEA 一抗， 37结合 1h ； PBST洗涤后再加入11000稀释的羊抗兔IgG二抗， 37结合30min ； PBST洗涤后加入OPD 底物液显色至适当强度， 以 2M 的 H2SO4终止反应， 测 A450值。 0058 2.2 融合蛋白稳定性实验 0059 将蛋白样品置于 37孵育， 并分别于不同的时间间隔取样， 用样品对 HT-29 肿瘤 细胞。
40、的结合力来衡量其剩余活性进而确定其稳定性。 0060 2.3MTT 法测定复性纯化后的 B3dsscFv-SEA 对肿瘤细胞的杀伤活性 0061 参 照 文 献 方 法 (Dohlsten M， Lando PA， Bjork P， Abrahmsen L， Ohlsson L， Lind P， Kalland T.Immunotherapy of human colon cancer by antibody-targeted 说 明 书 CN 1884301 B7/7 页 9 superantigens.CancerImmunol Immunother.1995Sep ； 41(3) ： 1。
41、62-168.)，并 做 如 下 改 进 ： 于 96 孔细胞培养板中， 每孔加入 HT-29 细胞及外周血淋巴细胞 ( 效应细胞靶细 胞 8 1) 和系列稀释的 B3ds-scFv-SEA， 于 37、 5 CO2条件下培养 5d。然后采用 Non-Radioactive Cell Proliferation Assay试剂盒分析杀伤结果。 检测结果以肿瘤细胞 生长抑制率 (TGI) 表示。TGI( ) (1-Atest/AC)100。Atest指在含效应细胞和不同浓 度的 B3ds-scFv-SEA 的培养液中生长的肿瘤细胞的吸收值， AC指仅含效应细胞和肿瘤细胞 的吸收值。 0062 3。
42、. 结果 0063 3.1 细胞 ELISA 检测 B3dsscFv-SEA 的结合活性 0064 ELISA 测定 B3ds-scFv-SEA 与不同肿瘤细胞结合的结果见图 4。从图中可以看 出 B3ds-scFv-SEA 对乳腺癌细胞 MCF-7 的结合力优于其它两种细胞， 这可能是因为 B3 抗 原在 MCF-7 细胞上的表达量较高的缘故 (Pastan I， Lovelace ET， Gallo MG， Rutherford AV， Magnani JL， Willingham MC.Characterization of monoclonalantibodies B1 and B3 。
43、that react with mucinous adenocarcinomas.Cancer Res.1991 Jul15 ； 51(14) ： 3781-3787.)。 0065 3.2 融合蛋白稳定性分析 0066 通过将蛋白在 37孵育不同的时间并测活来确定其稳定性。在 37孵育了 16h 后， 蛋白仍保持了85以上的活性， 初步说明了B3ds-scFv-SEA具有较好的稳定性， 见图5。 0067 3.3 融合蛋白对肿瘤细胞的生长抑制实验 0068 在效靶比为 8 1 时， 随着蛋白浓度的增加， 对结肠癌细胞 HT-29 的抑制率逐渐增 大， 在蛋白浓度为1g/ml时， 最大抑制率可达95， 不加效应细胞时， B3ds-scFv-SEA对肿 瘤细胞无杀伤作用。 B3ds-scFv-SEA对肿瘤的抑制力略低于天然SEA(图7中起始蛋白浓度 均为 1g/ml)。 说 明 书 CN 1884301 B1/3 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 1884301 B2/3 页 11 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 1884301 B3/3 页 12 图 7 说 明 书 附 图 。