一种苯扎贝特高效降解菌的提取方法 【技术领域】
本发明属微生物细菌的分离纯化领域，特别是涉及一种苯扎贝特高效降解菌的提取方法。
背景技术
随着环境分析技术的提高和人们环境意识的增强，药物及个人护理品(Pharmaceutical and Personal Care Products，简称PPCPs)作为一种新兴污染物日益受到人们的关注。药物和个人护理用品即使微量存在仍具有相当程度的生物活性，给环境造成不可预测的影响，并可能通过饮用水和食物等途径对人体健康产生潜在危害。
在常见的PPCPs化合物中，抗生素、消炎药、抗癫痫药物、调节血脂药在各类环境介质中的检出频率较高。由于生活水平的提高，其中苯扎贝特(Bezafi-brate)(分子结构如图1所示)作为一种新型的血脂调节药，其药效显著，常作为治疗高血脂的首选药物被大量使用，是目前最受关注的PPCPs类污染物之一。
从苯扎贝特分子结构式可知，其含有多种活性基团，一旦进入自然水体，其会对生态环境及人体健康产生极大的潜在危害。因此控制自然水体中苯扎贝特显得尤为重要，然而苯扎贝特是含氮的芳香杂环化合物，目前传统的污水处理方法(如吸附、活性污泥、生物膜、紫外、光催化降解等方法)不能够有效去除，使其被频繁检出、且检出浓度相对较高。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是提供一种苯扎贝特高效降解菌的提取方法，该方法从城市污水处理厂二沉池的活性污泥中提取苯扎贝特降解菌株，种源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；提取到的菌株对苯扎贝特的降解率可达85％以上，具有良好的应用前景。
本发明的一种苯扎贝特高效降解菌的提取方法，包括：
(1)定向驯化培养
取活性污泥(城市污水处理厂二沉池)按5wt％的接入量接种于无机盐培养基中，以梯度压力式驯化法驯化2个月；
(2)菌株的富集分离和纯化
将驯化2个月后的样品静置30min，取上层水样1mL作梯度稀释，然后每种稀释浓度分别取1mL菌液于接种到固体培养基进行富集培养，确保长出纯的单一菌株，再接种到斜面培养基，于4℃下保存，即可。
所述步骤(1)中的无机盐培养基为K2HPO4 4.35g/L，KH2PO4 1.7g/L，NH4Cl 2.1g/L，MgSO4 0.2g/L，MnSO4 0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl2·2H2O 0.03g/L，蒸馏水1000mL，pH＝6.8～7.0；
所述步骤(1)中的梯度压力式驯化法为在无机盐培养基中，分别依次加入苯扎贝特使其浓度为10、15、20、25、30、35mg/L，改变浓度的间隔时间为10d，于30～35℃，振荡速率160r/min条件下进行驯化培养；
所述步骤(2)中的梯度稀释是指作10-1～10-10的梯度稀释；
所述步骤(2)中的固体培养基为富集培养基中加入17g/L的琼脂粉，加热融化，冷却后而形成的培养基，其中富集培养基为牛肉膏3.0g/L，蛋白陈10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.2，斜面培养基为将固体培养基加热溶化，取干净的试管，试管中倒入约5mL固体培养基，将试管口端放在玻璃棒上，使管内培养基形成斜面而形成；
所述步骤(2)中的富集培养是指将菌液于接种到富集培养基后于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果，在电子显微镜下观察菌落形态，反复2～4次，确保长出纯的单一菌株；
所述的苯扎贝特高效降解菌经16S rDNA序列测定，基因全序列如下：
GCACCGTTATCAACCGTGGTACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGGGGGCAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATTCTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGATCGGTTTTGTGAGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTCTGCATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAATCTCAAGGATTCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTTGT；
菌株16S rDNA的基因全序列在NCBI数据库中分析比较，鉴定为变形假单胞菌，其鉴定结果见图2，系统进化树见图3，同源性达到98％，命名为(Pseudomonas plecoglossicida.)B-3；
所述的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida.)B-3革兰氏染色为阴性，无芽孢，无荚膜，专性需氧，营养要求不高，产生水溶性色素，其电镜扫描见图4；该菌为短杆菌，菌体长度为0.2～0.5um，菌落直径大小为0.5-2.5mm，圆形，边缘整齐，表面低凸面，有光泽，呈乳白色，半透明；在无机盐培养基中的培养特征为乳白色悬浊；该菌株在紫外线照射2h后，均已失去活性；最适生长条件pH为6.8～7.6，温度为30～35℃，摇床震荡速率为160r/min。
该变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida.)B-3质粒检测结果表明该菌不携带质粒，因此降解基因编码于染色体上，这一特性使得在利用质粒进行水平基因转移的过程中，避免了质粒的不相容性，是构建具备多种降解能力的基因工程菌的良好材料，且对一般抗生素均无抗性，且易于灭活，保证了使用的生态安全性。
本发明的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida.)B-3不仅可以利用苯扎贝特作为唯一的碳、氮源进行新陈代谢，而且能在相对较高浓度的苯扎贝特基质条件下(苯扎贝特浓度约为35mg/L)良好生长；它对苯扎贝特的去除主要通过生物吸附和生物降解两个阶段，从而对苯扎贝特达到很高的去除率(85％以上)，同时适量的外加碳源不但不会影响本发明的菌株对苯扎贝特降解作用，而且对其降解具有促进作用。
在变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida.)B-3对苯扎贝特的降解代谢中间产物通过气质联机测定，检测结果见图5、图6，结果表明苯扎贝特经该菌作用后，转化为乙酸乙酯，乙酸等简单有机物，苯扎贝特的生物活性大大降低，该菌对苯扎贝特的降解作用较为彻底。
取本发明分离得到的苯扎贝特高效降解菌的单一菌落于各自的无机盐培养基中，各无机盐培养基中均含有15mg/L地苯扎贝特，在30℃、160r/min，250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行培养，培养时间为48h，培养后通过电子显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中苯扎贝特的剩余浓度。
有益效果
(1)本发明从城市污水处理厂二沉池的活性污泥中提取苯扎贝特降解菌株，种源易得且分离纯化方法简便快捷，成本低，对环境友好；
(2)提取的变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida.)B-3可以有效地降解苯扎贝特，对苯扎贝特的降解率可达85％以上；该菌株是废水处理系统中的优势菌株，因此该菌株能适应复杂的实际条件，这使得该菌的应用前景广阔。
【附图说明】
图1为苯扎贝特的分子结构式；
图2为(Pseudomonas plecoglossicida.)B-3的16S rDNA序列的鉴定结果；
图3为(Pseudomonas plecoglossicida.)B-3的系统进化树；
图4为(Pseudomonas plecoglossicida.)B-3的扫描电镜；
图5为苯扎贝特代谢中间产物的检测结果；
图6为苯扎贝特代谢中间产物的检测结果。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)取自城市污水处理厂二沉池的活性污泥按5％的接入量接种于无机盐培养基中，其中无机盐培养基为K2HPO4 4.35g，KH2PO4 1.7g，NH4Cl 2.1g，MgSO4 0.2g，MnSO4 0.05g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·2H2O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH＝6.8-7.0。以梯度压力式驯化法驯化，苯扎贝特浓度为10、15、20、25、30、35mg/L，在30℃、160r/min，250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行驯化培养，总驯化时间为2个月；
(2)取驯化2个月后的样品，静置30分钟，取上层水样1mL，作10-1～10-10梯度稀释。每种稀释浓度分别取1mL菌液于培养皿内，倒入固体培养基后将培养皿放在桌上，来回转动培养皿后，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，挑取形态清晰的单一菌落，编号，在固体培养基上划线，将培养皿倒置于30℃培养箱中培养48h，再观察结果，反复几次，并在电子显微镜下观察，确保是纯的单一菌株后，将分离出的菌种接种到斜面培养基上，4℃下保存于冰箱中待后续进行降解试验。其中固体培养基为富集培养基中加入17g/L的琼脂粉，加热融化，冷却后而形成的培养基，富集培养基为牛肉膏3.0g/L，蛋白陈10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL，pH＝7.0～7.2。斜面培养基为将固体培养基加热溶化，取干净的试管，试管中倒入约5mL固体培养基，将试管口端放在玻璃棒上，使管内培养基形成斜面而形成；
(3)分别挑取经分离纯化后的单一菌落于各自的无机盐培养基中，各无机盐培养基中均含有15mg/L的苯扎贝特，在30℃、160r/min，250mL锥形瓶中装填量100mL的条件下进行培养，培养时间为48h，培养后通过电子显微镜观察细菌生长情况以及测定溶液中苯扎贝特的剩余浓度，从而确定出对苯扎贝特具有高效降解作用的菌株。
本发明所提供的一株苯扎贝特高效降解菌在初始pH值为7.2左右，温度为30℃，振荡速率为160r/min，250mL锥形瓶的装液量为100mL的条件下，菌株接种量为0.6％，苯扎贝特初始浓度为15mg/L，培养时间48h，然后利用高效液相色谱法进行测定，色谱条件：流动相为甲醇∶0.01mol/L的磷酸二氢钾用磷酸调节pH至3.8＝6∶4(V∶V)，测定波长为230nm，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，保留时间约为8.9min；苯扎贝特的降解率高达87.3％。