一种美洲商陆中铀相关基因片段、获取方法及应用 【技术领域】
本发明属于分子生物学和环境监测领域，具体地说，是公开一种美洲商陆中与铀相关的基因片段，以及该基因片段的获取方法，进一步涉及该基因片段在检测环境铀污染中的应用。
背景技术
铀矿开采以及核能的利用过程是铀在环境中富集并产生污染的重要途径。铀尾矿和废石中含有铀及其全部子体，其放射性核素含量比本底高2到3个数量级。不适当的堆积或处置这些废料就会导致铀通过流失散布到土壤表面，经风蚀进入空气，或者通过淋洗而进入地下水。此外，铀矿冶炼过程会将大量的放射性废水不断地排出，也直接污染了天然水体和土壤。所以采用灵敏，准确的检测手段势在必行。
传统的铀污染及环境中放射性物质的检测通常采用放射性检测仪检测，采用的是α、β、χ、γ多功能射线检测仪探头来检测放射剂量，传统方法虽然能够检测一定剂量的放射源，但是很难区分究竟是哪种放射性物质产生的污染；另外，其灵敏度具有一定局限性。
美洲商陆(Phytolacca americana L.pokeweed)，又名垂序商陆、十蕊商陆。在中国某地的铀尾矿上生长着大量的美洲商陆，这表明美洲商陆对重金属铀有着某种耐受机制。生长于铀尾矿区和对照区中的美洲商陆因处于不同的生长环境，其基因必定存在着某些差异。利用这种差异，采用分子生物学方法，即利用核酸杂交分析方法鉴定环境受到铀污染是可行途径。但目前，这种方法国内还未见报道。
【发明内容】
本发明的目的在于提供用于检测美洲商陆受铀污染的一个基因片段及该基因片段的获取方法，以及利用该基因片段在检测环境铀污染中的应用。
本发明提供的美洲商陆中铀相关基因片段是从铀尾矿区的美洲商陆和非污染对照区域美洲商陆的根部组织提取总RNA，通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链，经过抑制性消减杂交(SSH)分离到对重金属铀胁迫下特异性表达的基因片段，该基因片段的序列为：
AACTGGCTTGTGGCAGCCAAGCGTTCATAGCGACGTTGCTTTTTGATCCTTCGATGACGTCTCTTCCTATCATTGTGAAGCAGATTTCACCAAGTGTTGGATTGTTCCCCCACCACCAGGGAACGTGAGTTGGGATTAGACCGTCGGGAAACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACAGGGCCGGGATGGTAATTCAACCTAGTACTTCGGCCGCGACCACGCTAATCCCTAGTGCGGCCGCCTGCTGGCCAACCTTAGGGAAGAGTTCCTAACCCGTGGATTGCTGTATTAGAGTTTCCTGTCGTGCCCCTCAAAAAGTTGGGACGATCCTGGCTCTTATTTGTTTCCTGTTAAAAGCCGCGTATTCTTCACCATTTTTGCCTGTTGACGATCCTCA。
该基因片段的获取方法包括以下步骤：
(1)在-196℃液氮冷藏铀尾矿区的美洲商陆和非污染对照区域美洲商陆的根部组织；
(2)提取美洲商陆的根部组织总RNA；
(3)以非污染对照区商陆根组织cDNA为Tester，位于铀尾矿区美洲商陆根组织cDNA为Driver，同时使用RevertAidTM First Strard cDNA Synthesis Kit和PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit两种试剂盒进行抑制性消减杂交(SSH)试验，包括：
1)cDNA第一链合成；
2)cDNA第二链合成；
3)Rsa I酶切；
4)连接接头；
5)第一轮杂交；
6)第二轮杂交；
7)两轮PCR扩增。
(4)将PCR产物转化到感受态细胞中；
(5)插入片段的筛选与鉴定；
(6)cDNA克隆测序与序列分析。
以上方法获取的基因片段可用于环境铀污染的检测，方法是以该基因片段为探针与环境中的美洲商陆提取的RNA杂交，按常规核酸杂交方法，如有阳性杂交信号，显示有同源片段，则说明环境受到铀污染，反之则相反；或以该基因片段两端序列为引物，做RT-PCR检测环境中的美洲商陆cDNA，如能扩增出相应片段，则说明环境受到铀污染，反之则相反。
本发明首次在美洲商陆中获得了铀胁迫下特异性表达的基因片段，发明了以植物美洲商陆中铀诱导下特异表达的基因为探针来检测铀污染的方法，解决了污染区周边环境铀污染难以准确检测的问题。本发明的有益效果是由于传统方法只能检测污染的辐射剂量，不能确定是何种污染物，所以采用本发明方法可以准确确定污染源及是否环境被铀污染。
【附图说明】
图1为总RNA电泳结果，其中左图为环境对照区商陆(tester)总RNA，右图为铀尾矿区商陆(driver)总RNA；
图2为第二轮PCR产物电泳图，其中1：Mark-F，2：PCR产物；
图3为蓝白斑筛选结果，其中箭头所指为蓝斑；
图4为克隆质粒电泳图，其中1-11：白斑质粒，12：蓝斑对照质粒；
图5为巢式PCR电泳图，其中1-7：PCR产物，8：Mark-F；
图6为获取基因片段测序结果图。
具体的实施方式
实施例1：
1.取铀尾矿区的美洲商陆和非污染对照区域美洲商陆的根部组织，放置于液氮-196℃冷藏待用；
2.提取美洲商陆的根部组织总RNA，如图1
(1)取预冷的RNA提取缓冲液(4mol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠(pH7.0)、0.5％(W/V)十二烷基肌氨酸钠、4％(V/V)β-巯基乙醇(使用前加入))10mL加入无Rnase的50mL离心管中，置于冰上；
(2)称取4g美洲商陆根系在装有过量液氮的研钵中充分研磨，用预冷的药匙将美洲商陆根系粉末转入离心管中，剧烈震荡10min，冰上静置5min；
(3)加入1mL 2mol/L醋酸钠(pH 4.0)，摇匀；
(4)加入10mL水饱和酚(pH 4.5)，摇匀；
(5)加入2mL氯仿∶异戊醇(24∶1)，摇匀，4℃、12000r/min离心20min；
(6)吸取上清，转入另1支新的无Rnase的50mL离心管，重复(4)、(5)步骤；
(7)吸取上清，分装到新的无Rnase的1.5mL离心管，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，置于-20℃沉淀1.5h；
(8)4℃、13000r/min离心15min，弃上清，倒置空干，加入0.6mL 75％乙醇，悬浮沉淀；
(9)4℃、14000r/min离心5min，弃上清，加入0.5mL 75％乙醇，洗涤RNA沉淀，室温下干燥10min，溶于40μL 0.1％DEPC水后置于-80℃下保存。
3.抑制性消减文库的构建
本实验同时使用了RevertAidTM First Strard cDNA Synthesis Kit(Ferment公司)和PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(Clontech公司)两种试剂盒进行SSH试验。cDNA第一链的合成使用了RevertAidTM First Strard cDNA Synthesis Kit，第二链合成使用了PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(clontech公司)。以非污染对照区商陆根组织cDNA为Tester，位于铀尾矿区美洲商陆根组织cDNA为Driver。
3.1cDNA第一链合成
(1)对每一份Tester和Driver RNA，在0.5mLEP管中加入：PolyA+RNA 2μg，cDNA synthesis primer(10μm)1μL，如需要，加无菌水，调总体积为5μL，混匀后短暂离心；
(2)在PCR热循环仪中70℃温育2min；
(3)冰浴冷却2min，短暂离心；
(4)每个反应加入下列成分：5×First-strand Buffer 2μL，dNTP mix(10mMeach)1μL，Sterile H2O 1μL，AMV Reverse Transcriptase(20unite/μL)1μL；
(5)轻轻的涡旋混合液，短暂离心；
(6)42℃空气浴1.5hr(注：不能用水浴或PCR仪，蒸发可以减少反混合物体积，因此而降低反应效率)；
(7)冰上放置终止第一链反应，并迅速进行第二链cDNA合成步骤。
3.2cDNA第二链合成
用Tester、Driver cDNA每一链cDNA完成下面步骤：
(1)加入以下成份到第一链合成反应EP中(10μL)：Sterile H2O 48.4μL，5×Second-Strand Buffer 16.0μL，dNTP Mix(10mM)1.6μL，20×Second-StrandEnzyme Cocktail 4.0μL；
(2)混合各组分并短暂离心，总体积应为80μL；
(3)在水浴上或PCR仪上，16℃保温2h；
(4)加入2μL(6u)T4DNApolymerase，混匀反应液；
(5)16℃水浴或PCR仪上保温30min；
(6)加4μL20×EDTA/Glycogen Mix终止第二链合成；
(7)加100μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)；
(8)充分涡旋，14,000rpm离心10min(室温)；
(9)将上层液体移入新的0.5mLEP中；
(10)加100μL地氯仿∶异戊醇(24∶1)；
(11)重复步骤(8)和(9)；
(12)加40μL4M NH40Ac和300μL的95％乙醇(立即开始沉淀，不需将EP管放置在-20℃，在此条件下放置时间过长可能会使不需要的盐沉淀)；
(13)充分涡旋混匀，室温14,000rpm离心20min；
(14)小心收集上清；
(15)用500μL 80％乙醇轻轻覆盖沉淀；
(16)14,000rpm离心10min；
(17)仔细移出上清；
(18)空气中干燥10min，让剩余的乙醇全部挥发；
(19)用50μL灭菌水溶解沉淀；
(20)转移6μL到一个干净的EP管中，于-20℃冰箱中保存，用于在RsaI酶切后电泳，检测dscDNA分子的产量和大小范围。
3.3Rsa I酶切
对每个实验用Tester和Driver dscDNA完成以下操作：
(1)加入以下试剂：dscDNA 40μL；10×Rsa I Restriction Buffer 5μL；Rsa I(10unite/μL)1.5μL；
(2)涡旋混匀，短暂离心；
(3)37℃温育1.5h；
(4)取出5μL酶切混合物，分析Rsa I酶切效率；
(5)加入2.5μL 20×EDTA/Glycogen混合物，终止反应；
(6)加50μL酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)；
(7)充分涡旋，室温14,000rpm离心10min，使液体分层；
(8)小心收集上清，转入新的0.5mL EP管中；
(9)加入50μL氯仿∶异戊醇(24∶1)；
(10)重复步骤7和8；
(11)加25μL 4M NH4OAc和187.5μL95％乙醇(注：立即开始沉淀，不需将EP管放置在-20℃，在此条件下放置时间过长可能会使不需要的盐沉淀)；
(12)重复步骤(7)；
(13)弃上清；
(14)用200μL 80％乙醇轻轻覆盖沉淀；
(15)14,000rpm离心5min；
(16)仔细移出上清(如果用dCTP[-32P]同位素标记，则可用盖革计数器测定)；
(17)空气中干燥沉淀10min；
(18)用5.5μL水溶解沉淀，存于-20℃冰箱中。
3.4连接接头
(1)用5μL无菌水稀释1μL Rsa I酶切的cDNA；
(2)在0.5μLEP管中准备连接用Master Mix，确保你有足够的Master Mix满足下列反应：无菌水1μL，5×连接Buffer 2μL，T4DNA Ligase(400unite/μL)3μL；
(3)对每一组实验用Tester，在0.5μLEP管中按表1按顺序加入试剂，用枪吸打液体充分混匀；
表1建立连接反应体系
(4)混合2μLTester1-1和2μLTester1-2在一个新的EP管中，作为非消减Tester1对照；同样其他每组Tester做法相同。连接反应后，大约有1/3的cDNA分子带有两种不同的接头在每一个非消减Tester对照管中；
(5)短暂离心，16℃温育过夜；
(6)加1μLEDTA/Glycogen混合液终止连接反应；
(7)72℃保温5min失活ligase；
(8)短暂离心，实验用接头的Tester加接头cDNA和非消减的Tester对照现在已完成准备；
(9)取1μL非消减Tester对照并用水稀释至1μL，这些样品用于后面的PCR扩增检测；
(10)样品贮存在-20℃冰箱。
3.5第一轮杂交
在进行下面的步骤中，过量的Driver cDNA加入到每个Tester cDNA中，样品被加热变性，重新退火，剩余的差异表达的单链cDNA被明显富集，由于非靶基因cDNA出现在Tester中和Driver cDNA形成杂交。
注意：杂交之前，将4×Hybridization buffer加热至室温至少15～20min，检查buffer，确保用之前无可见的小块沉淀物，如果需要，可在37℃加热buffer 10min溶解沉淀。
(1)对于每一个样品的杂交，按顺序照以下表2在EP管中加入下列试剂；
表2建立第一轮杂交
(2)用一滴矿物油覆盖样品并做简单离心；
(3)在热循环仪上温育样品(98℃，1.5min)；
(4)68℃，温育样品8h(样品杂交可能需6～12min，不要让其温育超过12h)。
3.6第二轮杂交
将第一轮杂交的两个样品混合在一起，将新变性好的Driver DNA加入到混合样品中，以进一步富集差异表达序列，含差异表达的cDNA以其连接不同的接头形成新杂交分子。注意：不要在此阶段将首轮杂交样品变性，也不要将杂交样品从热循环仪上取出的时间超过加入新的Driver的必要时间。
(1)在灭菌管中加入以下试剂：Driver cDNA 1μL，4×Hybridization Buffer1μL，Sterile H2O 2μL；
(2)取出上述混合物1μL到一个新的0.5mL离心管中，在其上覆盖一滴矿物油；
(3)热循环仪上98℃温育1.5min；
(4)从热循环仪上移出新的新变性的Driver，同时将Driver与杂交样品1和2混合在一起，即将微量移液枪调至15μL；轻轻地将枪头放在杂交样品2的EP管的矿物油/样品交界面；小心吸取整个样品的一部分到枪头里，把枪头从EP管中移出，吸入少量空气到枪头里，在这一滴样品下创建一个小的空气空间；重复b～d以含新变性Driver的EP管，现在移液枪头应该含有两个样品(杂交样品2和变性Driver)，这两个样品由一个小空气泡隔开；转移两个样品到含杂交样品
1的EP管中；用枪头吹打混匀；
(5)如果需要，可短暂离心；
(6)68℃温育过夜；
(7)加200μL dilution buffer并用枪头混匀；
(8)在热循环仪上68℃加热7min；
(9)-20℃保存。
3.7两轮PCR扩增
按此部分所做两轮反应，差异表达的cDNA被选择性扩增，首先热循环，通过75℃短暂温育，缺失接头的链被填补，这就为PCR引物创造了一个结合位点。在第一轮扩增，只有在序列两端带有不同接头的cDNA链被指数形式扩增，在第二轮扩增中，嵌套式PCR被用于进一步减少表达相同的序列，并富集差异表达的序列，如图2。
(1)取1μL各种稀释了的cDNA到一个作了相应标记的EP管中；
(2)为所有的首轮PCR管准备Master Mix，每个反应准备好后，将下列试剂按顺序(表3)加入到一个0.5mL的EP管中。对每个其他实验cDNA，也如表4所述准备相应量的Master Mix。
表3首轮PCR Master Mix的准备
(3)涡旋混匀，并简单离心；
(4)在第一步所准备的每一个反应管中加入24μLMaster Mix；
(5)用50μL矿物油覆盖；
(6)在热循环仪上75℃，5min温育反应混合物以延伸接头(不要从热循环仪上移出样品)，这步填补了丢失的接头，因此创建了一个PCR引物的结合位点；
(7)立即开始热循环(12cycles)：94℃30sec，66℃30sec，72℃1.5min；
(8)于27μL水中稀释3μL各种首轮PCR混合物，以此作为第二轮PCR的模板；
(9)取1μL各种来自第8)步的稀释好的首轮PCR产物混合物到1个作了相应标记的EP管中；
(10)按照表4的顺序加入试剂来准备第二轮PCR反应的Master Mix(对于其它试验cDNA，为其反应准备相应的Master Mix)；
表4第二轮PCR Master Mix的准备
(11)涡旋混匀并作简单离心，
(12)24μL Master Mix加入到第(9)步的反应体系中，
(13)用1滴矿物油覆盖，立即开始热循环(10-12cycles)：94℃30sec；66℃30sec；72℃1.5min。
(14)于-20℃保存反应产物(到现在PCR产物中富集了差异表达的cDNA)
4.将PCR产物转化到感受态细胞中，如图3；
5.插入片段的筛选与鉴定图4，图5；
6.cDNA克隆测序与序列分析(结果参见图6)；
7、以获取的基因片段为探针与环境中的美洲商陆提取的RNA杂交。
实施例2：
1.步骤同实施例一1；
2.步骤同实施例一2；
3.步骤同实施例一3；
4.步骤同实施例一4；
5.步骤同实施例一5；
6.步骤同实施例一6；
7.以该特异表达基因片段两端序列设计引物；
8.做RT-PCR检测环境中的美洲商陆cDNA。
【序列表】
AACTGGCTTGTGGCAGCCAAGCGTTCATAGCGACGTTGCTTTTTGATCCTTCGATGACGTCTCTTCCTATCATTGTGAAGCAGATTTCACCAAGTGTTGGATTGTTCCCCCACCACCAGGGAACGTGAGTTGGGATTAGACCGTCGGGAAACAGGTTAGTTTTACCCTACTGATGACAGGGCCGGGATGGTAATTCAACCTAGTACTTCGGCCGCGACCACGCTAATCCCTAGTGCGGCCGCCTGCTGGCCAACCTTAGGGAAGAGTTCCTAACCCGTGGATTGCTGTATTAGAGTTTCCTGTCGTGCCCCTCAAAAAGTTGGGACGATCCTGGCTCTTATTTGTTTCCTGTTAAAAGCCGCGTATTCTTCACCATTTTTGCCTGTTGACGATCCTCA